구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

여기서 설명된 프로토콜은 생체내 암 모델을 사용하여 치료 효능을 테스트하기 위한 알고리즘을 입증하는 것을 목표로 한다. 프로토콜은 여러 기술의 조합으로 구성됩니다. 인간 종양 표본의 전체 게놈 바이오 염기서열분석은 게놈 변경을 확인하기 위하여 이용됩니다.

이들은 유전자 재배열 및 유전자 복사 번호 변경을 둘 다 포함합니다. 따라서 잠재적으로 약물 사용 가능한 변경 사항을 선택하기 위해 식별된 변경 사항을 분석합니다. 게놈 분석에 기초하여 선택된 약은 면역 손상한 마우스에서 자란 상응하는 종양의 생체 내 처리를 위해 그 때 이용됩니다.

개발 된 알고리즘은 암 환자의 치료를위한 치료 결정을 돕기 위한 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 팬더 도구 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 대상 변경 내용을 식별합니다. 우리는 표준 허용 된 유전자 기호를 사용하여 간단한 탭 묘사 파일로 결과 현미경에 의해 확인 된 유전자를 나열 할 수 있습니다.

테이블 헤더가 소프트웨어의 경로 수준 U로 전송되도록 목록의 헤더라인에 파운드 기호를 추가합니다. 해당 탐색 탭을 클릭하여 파일을 업로드합니다. 선택한 아이콘을 클릭한 다음 최종 탭을 클릭하여 기본 데이터를 나타내는 단일 아이콘을 할당합니다.

환자 파일이 업로드되면 페이지를 미리 보고 경로당 인음이 표시된 유전자 수를 표시하는 열을 식별합니다. 오른쪽의 마지막 열입니다. 메인 창의 왼쪽 상단에 있는 통로 필터를 사용하여 관심 있는 유전자를 포함하는 경로에 표시되는 경로의 수를 제한합니다.

우연히 예상보다 더 많은 유전자가 추가되는 경로를 식별하려면 농축 탭 아래에 있는 함수를 사용하십시오. 그런 다음 열이 피셔의 정확한 테스트에서 해당 p 값을 표시하는 기본 테이블에 추가됩니다. 데이터베이스를 선택하여 주 창 왼쪽에 있는 적절한 아이콘을 확인하여 미리 설정된 별표에서 잠재적인 약물 제거 가능한 유전자를 표시합니다.

시각화를 위한 경로를 선택하려면 경로 뷰어 페이지에 표시된 이름을 클릭합니다. 각 별표 집합을 나타내는 아이콘은 관련 유전자 옆에 표시됩니다. 통로에 있는 어떤 유전자든지 클릭하면 해당 유전자 카드 페이지가 열립니다.

추가 분석을 위해 잠재적인 약에 대한 관심과 안타의 인장 유전자를 보여 준 경로를 선택합니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 라미나르 플로우 후드에서 조직 작업을 수행합니다. 항생제를 함유하는 RPMI, DMEM과 같은 감기 PBS 또는 조직 배양 배지를 포함하는 접시에 종양 조직을 놓습니다.

병리학자의 도움으로 인접한 정상 및 괴사 조직에서 실행 가능한 종양 물질을 식별하고 분리합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 병리학자가 지적한 괴사 물질을 제거하십시오. 피하 이식을 수행하려면 멸균 집게, 메스 또는 수술 가위로 종양 조직을 약 2 x 2 x 2 밀리미터 크기로 잘라냅니다.

조각난 조직을 얼음 위에 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다. 조각난 조직, 조직 10개당 약 200마이크로리터로 차가운 마트리겔을 접시에 넣으세요. 잘 섞어서 조직 조각이 10분 동안 결혼에 담가 두십시오.

멸균 수술 가위와 집게를 사용하여 마우스 양쪽 측면에 5-10밀리미터 수직 피부 절개를 합니다. 피하 공간에 직선 포셉을 부드럽게 삽입하여 종양 단편이 지방 패드 아래에 배치될 수 있을 만큼 큰 포켓을 만듭니다. 멸균 직선 집게를 사용하여 5마리의 마우스 각각에 이전에 준비된 주머니에 종양 조각을 삽입합니다.

조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 이식 후 림프구 증식을 억제하려면 각 마우스에 리툭시맙 100 마이크로리터를 주입하십시오. 마우스의 머리와 입술이 고정되도록 뒷면의 피부를 꼬집고 뒤로 구부려 구강 영역을 위해 마우스를 준비합니다.

프로브가 식도에 도달할 때까지 마우스 목구멍 뒤쪽에 게이지 프로브를 삽입합니다. 마우스의 폐가 죽음을 일으키는 천공을 할 수 있기 때문에 프로브가 너무 멀리 삽입되지 않았는지 확인하십시오. 대표적인 게놈 플로트(genomic float)는 한 종양에서 게놈 변화의 풍경을 보여줍니다.

고급 혈청형 종양에 대 한 전형적인, 여러 이득 블루 라인 및 손실 레드 라인, 게놈 불안정의 높은 수준을 나타내는 확인 되었다. OC101 종양에서 치료 개입에 대한 주요 추세 변경은 HER2 수용체를 코딩하는 유전자인 ERBB2를 포함하는 염색체 17의 증폭이었다. DNA 수준에서 결과를 검증하기 위해, 특정 프라이머의 여러 세트는 증폭 된 영역의 가장자리를 위해 설계되었습니다.

그리고 PCR이 수행되었다. 인간의 DNA를 제어할 때 증폭 생성물이 흡수되지 않았습니다. OC101 종양 DNA에 대한 구체적인 대역이 확인되었다.

또 다른 변이체 종양, T14에서 수많은 DNA 이득이 관찰되었습니다. 그 포함 AKT2 RICTOR 유전자에. 면역 블로팅을 사용하여 단백질 수준에서 수행된 유효성 검사는 RICTOR에서 높은 수준의 AKT를 보였다.

6주차 말까지 화학요법 치료군에서 종양 부담이 현저한 감소가 관찰되었다. 조합 치료를 받은 그룹에서 혼자 화학 요법을 통해 추가 혜택이 있었다. 종양 조직은 치료 시험의 끝에 치료 반응의 분자 분석을 위해 수집되었다.

S6, AKT 및 mTOR의 총 및 인계 수준은 면역블로팅을 사용하여 결정되었다. 치료되지 않은 화학 요법에서 이러한 단백질의 수준을 비교하고, 화학요법 처리, AKT 또는 mTOR 억제제로 치료된 후 2에 대한 현저한 감소를 보였다. 제시된 접근방식은 PDX 모형에 있는 임상 시험을 수행하는 것이 아주 유용합니다.

그것은 시험을 위한 약의 최상 선택을 결정하기 위하여 게놈 프로파일링에 의해 얻어진 바와 같이 종양의 분자 특성을 이용합니다.