Name: 구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 구조적 DNA 재배열 분석과 환자 유래 종양 제노이식을 활용한 표적 치료 시험 알고리즘입니다. 면역결핍 마우스 모델에서 약물 효능을 검증하여 정밀 의료에 기여합니다.

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우리는 실험을 수행하는 데 도움을 준 린 양 박사와 페이 R. 해리스 박사를 위한 메이요 클리닉 센터 (CIM) 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 개인화 의학 (CIM)에 대한 메이요 클리닉 센터에 씨와 부인 닐 E. 에클스의 선물에 의해 지원되었다.

난소암을 가진 동의한 환자에게서 새로운 조직은 메이요 클리닉 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수술을 해독하는 시간에 수집되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 동물 절차 및 치료는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 동물 관리 지침을 따랐습니다.
1. 메이트 쌍 시퀀싱 및 분석
참고: 신선하거나 플래시가 고정된 조직은 메이트 쌍(MPeq) 시퀀싱에 사용해야 합니다. 파라핀 임베디드 물질은 단편화된 DNA를 포함하기 때문에 적합하지 않습니다.
<ol><li>냉동 종양 조직에서 DNA를 분리합니다. 수술 물질 또는생검(36)에서얻은 원래 인간 표본을 사용한다.</li>
	<li>차세대 시퀀서에 차선당 2개의 샘플로 MPeq 라이브러리 및 서열을 만들기 위해 DNA 1000 ng를 사용합니다(재료 표참조)36.</li>
	<li>알고리즘 세트를 사용하여 데이터를 분석하여 이전36,,37에설명된 바와 같이 큰 염색체 수차(삭제, 삽입, 증폭, 반전 및 전좌)를 감지한다.</li>
</ol>2. 치료 대상 의 선택
<ol><li>오픈 액세스 팬더 도구(경로 및 주석) 또는 유사한 도구를 사용하여 대상 변경(http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda)을 식별합니다.<ol>
<li>표준 허용 된 유전자 기호를 사용하여 간단한 탭 분리 파일로, 변경된 MSeq에 의해 확인된 유전자의 목록을 확인합니다. 참고: 포함된 예제는 증폭 및 이득에 대한 분석을 특징으로 합니다.</li>
		<li>테이블 헤더가 소프트웨어의 경로 수준 보기로 전송되도록 목록의 헤더 줄에 "#" 기호를 추가합니다.</li>
		<li>업로드 어음 세트 탐색 탭을 클릭하여 파일을 업로드합니다.</li>
		<li>메뉴에서 단일 아이콘을 할당하여 선택한 아이콘을 클릭한 다음 최종 탭을 클릭하여 기본 데이터를 나타냅니다.</li>
		<li>별표 파일이 업로드된 후 경로당 부음 유전자 수를 표시하는 열을 식별합니다. 오른쪽의 마지막 열입니다.</li>
		<li>메인 창의 왼쪽 상단에 있는 통로 필터를 사용하여 관심 있는 유전자를 포함하는 경로를 표시합니다.</li>
		<li>우연히 예상되는 것보다 더 많은 부가 된 유전자가있는 경로를 식별합니다. 보강 탭 아래에 있는 함수를 사용합니다.</li>
		<li>메인 창 왼쪽에 있는 적절한 아이콘(예: DGIdb, PharmGKB)을 확인하여 사전 설정 기여에서 잠재적으로 약물이 가능한 유전자를 표시하는 데이터베이스를 선택합니다.</li>
		<li>경로 뷰어 페이지에 표시된 이름을 클릭하여 시각화할 경로를 선택합니다. 참고: 각 음권 세트를 나타내는 아이콘은 관련 유전자 옆에 표시됩니다. 관심 유전자를 클릭하여 해당 GeneCards 웹 페이지를 엽니다.</li>
		<li>관심의 인가 유전자를 보여 준 경로를 선택 (즉, 주어진 종양에서 변경) 및 추가 분석을위한 잠재적 인 약물에 대한 "안타".</li>
	</ol>
</li>
	<li>임상 적용(https://clinicaltrials.gov/)을 위해 승인된 약물을 함유한 데이터베이스를 사용하여 확인된 표적을 상호 참조한다.</li>
	<li>특정 유형의 종양의 생물학과 관련성을 확인하기 위해 문헌 검토(예: PubMed)를 수행하여 PDX 모델에서 추가 검사를 위한 표적 변경의 우선 순위를 지정합니다.</li>
</ol>3. PCR 및 Sanger 시퀀싱에 의한 게놈 재배열 검증
<ol><li>MPeq 데이터에서 얻은 시퀀싱 읽기를 사용하여 프라이머를 디자인합니다.<ol>
<li>MVPeq 분석을 기반으로 유효성 검사(즉, 잠재적 치료 대상)에 대한 관심 접합을 선택합니다.</li>
		<li>앰플리시온이 접합을 포함할 수 있도록 방향적으로 프라이머를 디자인합니다. 접합의 각 측면에 2 프라이머를 설계하여 총 4개씩 접합을 증폭시킬 확률을 높입니다. 참고: 케이스 및 염색체 위치에 따라 프라이머의 이름 입니다.</li>
		<li>프라이머 디자인과 선택한 소프트웨어에 표준 PCR 매개 변수를 사용합니다. 용융 온도(60-62°C)와 GC 함량(40-60%)을 선택합니다. 프라이머 시퀀스가 프라이머 디머, 팔린드롬 또는 헤어핀 루프를 형성하지 않는지 확인합니다.</li>
		<li>프라이머 서열이 BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)를 사용하여 확인하여 인간 게놈의 다른 영역에 동성애가 부족하다는 것을 확인한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관심의 교차를 증폭하기 위해 PCR을 실행합니다.<ol>
<li>프라이머를 물로 10mM로 희석하고 각 프라이머의 10mL를 결합하여 각 포워드 프라이머와 각 리버스 프라이머를 프라이머 믹스에 결합합니다. 참고: 선택한 예제의 프라이머에 대한 시퀀스는 표 1에표시됩니다.</li>
		<li>라벨 0.2 mL 스트립 튜브: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 및 T4 어디 C=제어 인간 게놈 DNA (상업), T=종양 DNA, 환자 또는 PDX 종양으로부터 분리, 그리고 숫자는 프라이머 믹스를 나타냅니다.</li>
		<li>각 프라이머 믹스 1mL을 라벨이 붙은 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>표 2에나열된 시약을 결합하여 타크 마스터믹스를 준비하여 필요한 때까지 냉동실에 효소를 남기고 마지막에 믹스에 추가합니다.</li>
		<li>2 마스터 믹스를 확인, 각 템플릿 DNA에 대한 하나, 인간의 DNA와 종양 DNA를 제어. 각 Taq 마스터 믹스24mL을 각 스트립 튜브에 추가합니다. 총 반응 량은 25mL입니다. 소용돌이는 매우 짧게 스트립 튜브를 아래로 회전.</li>
		<li>열순환기에서 PCR을 실행합니다. 표 3에 표시된 매개 변수를 사용합니다. 프라이머의 용융 온도보다 적어도 1 °C 더 추워지 않도록 어닐링 온도를 조정합니다.</li>
		<li>완성된 PCR 제품을 -20°C(장기)에 저장하거나 필요할 때까지 4°C(단기)로 냉장 보관하십시오.</li>
		<li>1-5 V/cm에서 전기 전도를 수행하여 1.5% 아가로즈 젤을 사용하여 PCR 제품을 시각화합니다. Sanger 시퀀싱에 사용할 제품의 2mL 알리쿼트를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sanger 시퀀싱을 수행하여 접합을 확인하고 정확한중단점(38)을식별합니다.<ol>
<li>PCR이 단일 제품(대역)을 생성한 경우 PCR 제품을 사용합니다. 또는, 젤에서 밴드를 잘라, 정화 및 증폭에 사용되는 프라이머와 함께 Sanger 시퀀싱에 대한 제출. 참고: 유전체 분석이 수행된 종양은 마우스의 이식에 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 종양 이식 및 유지 보수
<ol><li>PDX 마우스 모형으로 종양을 이식하는 준비를 설치합니다. 유전체 분석이 수행되거나 수행된 이식 종양을 선택합니다.<ol>
<li>전용 실험실 및 동물 시설, 숙련된 기술 직원 및 상세한 표준 운영 절차를 포함한 모든 PDX 모델 개발이 시작될 때 지원 인프라가 마련되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>속도는 세포 생존력과 성공적인 이식에 매우 중요하기 때문에 표본의 신속한 운송 및 처리를 보장하십시오.</li>
		<li>멸균 환경을 사용하여 세균 및 곰팡이 오염을 감소시키고 시편을 이식합니다.</li>
		<li>잠재적으로 생체 내성 물질에 관한 제도적 정책에 따라, 혈액 매개 병원균을 품을 수 있기 때문에 인간의 표본을 주의 깊게 처리하십시오.</li>
		<li>20mL의 조직 배양 배지를 가진 사전 냉각된 50mL 튜브에 수술용 표본을 넣어 이식을 위한 조직(0.5-0.7 cm 크기)을 준비한다.3 참고: 종양 조직은 이전에 냉동 보존된 물질5에서신선하거나 회복될 수 있다.</li>
		<li>병리학자와 상담하여 시편의 종양 함량을 확인합니다.</li>
		<li>종양 조직을 감기 PBS의 10-15mL 또는 항생제를 함유하는 RPMI 1640 또는 DMEM과 같은 조직 배양 배지(1% 페니실린 및 연쇄절제술)를 포함하는 접시에 놓는다.</li>
		<li>병리학자의 도움으로 인접한 정상 및 괴사 조직에서 실행 가능한 종양 물질을 식별하고 분리합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 병리학자가 지적한 괴사 물질을 제거하십시오. 참고: 종양은 마우스로 복경구 또는 피하로 이식될 수 있다. 4.2단계를 따라 복막 이식을 수행하거나 4.3단계로 건너뛰어 피하 이식을 수행한다. 이 연구에서는, 게놈 분석에 근거를 둔 표적으로 한 치료는 복막 이식을 가진 높은 급성 난소암을 위한 PDX 모형의 시리즈에서 시험되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>멸균 집게와 얼음에 메스를 가진 조직을 다진 인트라보네아(IP) 이식조직을 준비하여 약 1-1.5mm3크기의 조각을 만들고 냉기 배지와 혼합한다. 16-17 게이지 바늘을 사용하여 종양 슬러리의 0.3-0.5 mL을 주입하십시오. 참고: 모든 수술 절차는 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 멸균 장갑, 멸균 기구, 소모품 및 이식 된 물질이 감염 가능성을 줄이기 위해 사용되었습니다.<ol>
<li>조각 1:1을 얼음-차가운 배양 배지와 혼합하고 적어도 3개의 암컷 SCID 마우스에 100mL내과 회음하여 주입한다.</li>
	</ol></li>
	<li>멸균 집게, 메스 또는 수술 가위를 사용하여 피하 이식을 위한 종양 조직을 작은 조각으로 자르고, 약 2 x 2 x 2mm 크기로, 조각난 조직을 얼음 위에 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다.<ol>
<li>차가운 지하 막 매트릭스를 조각난 조직(조직 10개당 약 200mL)으로 접시에 넣고 잘 섞어 10분 동안 차가운 지하 막 매트릭스에 적재합니다.</li>
		<li>5 명의 여성 NOD / SCID 마우스를 마취하여 이식을 준비합니다.</li>
		<li>각 마우스를 케타민(150 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg) 조합으로 각 마우스를 인트라페톤으로 주입합니다.</li>
		<li>마우스가 외상성 집게로 꼬리 끝을 꼬집어 제대로 마취되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>챔버에서 부드럽게 완전히 마취 된 마우스를 제거하고 마우스에 기화기의 입력과 폐 가스 청소 시스템에서 출력이있는 코 콘을 마우스에 놓습니다.</li>
		<li>마취 하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 수의사 연고를 넣습니다. 수술이 수행될 영역을 준비합니다. 무균 기술을 사용하여 수술을 수행하십시오.</li>
		<li>수술이 수행될 표면이 다공성, 밀봉되지 않았는지, 수술 전에 폐화되는지 확인하십시오.</li>
		<li>멸균 (오토 클레이브, 가스 또는 화학 살균에 의해) 기기로 수술을 시작합니다.</li>
		<li>장갑을 사용하여 기기를 처리하고 수술 단계 사이에 에탄올에 침수하여 절차 전반에 걸쳐 악기 팁의 멸균을 유지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>요오드와 알코올의 3 교대 스크럽을 적용하여 수술 부위를 살균. 멸균 수술 가위와 집게를 사용하여 마우스 양쪽 측면에 5-10mm 수직 피부 절개를 합니다.<ol>
<li>피하 공간에 직선 포셉을 부드럽게 삽입하여 종양 단편이 지방 패드 아래에 배치될 수 있을 만큼 큰 포켓을 만듭니다.</li>
		<li>멸균 직선 집게를 사용하여 5개의 마우스 각각에 이전에 준비된 주머니에 종양 조각을 삽입합니다. 참고: 한 주머니에 종양 조직의 3-4 조각을 놓습니다.</li>
		<li>조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.</li>
		<li>임포세포 증식을 억제하기 위해 이식 후 리툭시맙 100mL의 각 마우스를 내분하소서 주사한다.</li>
	</ol></li>
	<li>마취에서 회복 될 때까지 약 20 분 동안 열 램프 아래에 마우스를 케이지에 넣습니다. 마우스 활력 징후를 모니터링하고 충분한 수분을 보장합니다.</li>
	<li>마취에서 회복하고 음식과 물을 가지고 시작한 후 다른 마우스의 회사에 마우스를 반환합니다. 기관 지침에 따라 수술 후 치료 및 모니터링을 제공합니다. 수술 후 3일 연속 매일 통증과 고통의 징후를 확인하십시오. 참고: 통증 이나 고민에 대 한 기준 괴 사 또는 궤 양, 체중 감소/신체 상태 점수, 활동 수준 등 행동 징후, 운동 기능 및 자세.</li>
	<li>종양이 캘리퍼에 의해 측정된 직경 0.5 cm의 크기에 도달할 때까지 정기적으로 종양 형성을 위한 마우스를 검사합니다.</li>
	<li>각 마우스의 체력 점수를 모양, 동작 및 신체상태(39)에서파생된 것으로 평가한다. 이산화탄소 흡입에 의해 희생되는 moribund 마우스에 대한 기준으로 ≤6의 점수를 사용합니다.</li>
</ol>5. PDX 모델에서 genomically 식별된 대상에 대한 응답 테스트
<ol><li>종양이 만져볼 수 있을 때 선택된 표적 처리를 시작하고 초음파 검사에 의해 측정된 대로 0.5 cm3에 도달하십시오.<ol>
<li>복부의 초음파 스캔을 수행하기 전에 마우스 복부 모피를 제거하고 멸균 젤리 윤활제를 적용합니다.</li>
		<li>트랜스듀서가 있는 초음파 기계를 사용하여 단면에 위치한 종양으로 이미지를 얻습니다. 각 동물당 세션당 3가지 측정값을 측정하고 종양 크기를 보다 정확하게 평가할 수 있도록 평균 값을 측정합니다.</li>
		<li>사용 가능한소프트웨어(40)를사용하여 이미지를 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>카보플라틴의 혼합물로 구성된 화학요법을 투여하여 51 mg/kg, 파클리탁셀은 4-6주의 총 치료 기간 동안 일주일에 한 번 15 mg/kg의 인트라피톤(IP)에서 카보플라틴을 투여한다. 주사의 총 부피가 0.2 mL를 초과하지 않는지 확인하십시오.</li>
	<li>MK-220641 스톡 용액을 30% 사이클로덱스트린(예: 캡티솔)으로 만들고 매일 120 mg/kg에서 4주 연속 경구 용품을 통해 배송한다.</li>
	<li>마우스의 머리와 팔다리가 고정되도록 마우스를 뒤로 꼬집고 다시 고정하여 마우스를 고정하여 구강 개구부용 마우스를 준비합니다.<ol>
<li>프로브가 식도에 도달할 때까지 마우스 목구멍 뒤쪽에 게이지 프로브를 삽입합니다. 마우스의 폐가 천공을 할 수 있기 때문에 프로브가 너무 멀리 삽입되지 않았는지 확인하여 사망을 유발합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 mg/mL에서 에탄올에 MK-866942 스톡 솔루션을 만듭니다. 5.2% Tween 80, 5.2% PEG400을 함유한 차량에 희석하여 IP 주사를 위한 멸균수로 5일 동안 10 mg/kg으로 총 치료 기간을 4주간 희석한다. 참고: 쥐에 주입된 부피는 동물의 체중에 따라 50-120mL여야 합니다.</li>
	<li>치료 군당 7-8마우스를 사용하여43,,44의차이를 감지하기에 충분한 통계적 힘을 갖도록 한다.</li>
	<li>매일 치료에서 쥐의 체중과 일반적인 상태를 평가합니다. 동물의 체중이 초기 체중에서 20% 이상 떨어지면 약물을 보류하십시오.</li>
	<li>초음파 스캐닝을 사용하여 매주 종양 크기를 평가합니다. 종양 성장의 모니터링을 수행하는 개인이 반응의 편견 점수를 보장하기 위해 치료에 눈이 멀게되는지 확인하십시오. 참고: 소규모 실험실은 치료 및 초음파 모니터링을 관리하기 위해 2 명의 다른 사람을 고용 할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 우리가 시험을 위한 약의 최상 선택을 결정하기 위하여 게놈 프로파일링에 의해 얻어진 종양의 분자 특성을 이용하는 PDX 모형에 있는 "임상 시험"을 수행하는 데 이용된 접근 및 프로토콜을 기술합니다. 다중 시퀀싱 플랫폼은 현재 전체 게놈 시퀀싱, RNAEq 및 사용자 정의 유전자 패널을 포함한 1 차 종양의 게놈 특성화에 사용됩니다. 고급 난소 암종의 경우, 구조적 변경, DNA 재배열 및 복사 번호 변경을 식별하는 Mpeq의 경우 이러한 유형의 종양에서 관찰된 높은 수준의 유전체 불안정성 때문에 특히 유용합니다. Mpeq 플랫폼의 두 번째 장점은 전체 게놈을 커버하지만 다른 포괄적 인 시퀀싱 기술보다 훨씬 적은 비용이 든다는 것입니다. 그러나 Mpeq는 기본 적용 범위가 충분하지 않기 때문에 포인트 돌연변이 검출에 적합하지 않으며 8-10배에 불과합니다. 종양의 게놈 특성화를 위해 혼자 의원을 사용하는 한계 중 하나는 복잡한 클러스터된 염색체 재배열의 존재이며, 그 중 분석은 관심있는 유전자의 발현을 예측하지 못한다. ...

환자 종양 조각을 면역형 마우스로 이식하여 발생하는 환자 유래 이종이이식(PDXs)은 개인화된 항암 치료를 돕기 위한 강력한 전임상 모델로 부상하고 있다. PDX 모델은 다양한 인간 악성 을 위해 성공적으로 개발되었습니다. 여기에는 유방 및 난소암, 악성 흑색종, 대장암, 췌장 선암 및 비소세포 폐암1,,2,,3,,4,5가5포함됩니다. 종양 조직은 정형소 또는 이종학적으로 이식될 수 있다. 전자, 더 정확 하지만 기술적으로 어려운 간주, 종양 기원의 기관에 직접 이식 을 포함. 이러한 유형의 모델은 종양6,,7에대한 "자연적인' 미세 환경으로 인해 원래 종양의 조직학을 정확하게 모방하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 마우스 난소의 부르사내로의 교정 이식은 종양이 복막 구멍으로 보급되고, 난소암8의전형적인 아분담의 생산으로 종양이 보급되었다. 유사하게, 복부 유방 선 대신 흉부로 유방 종양의 주입은 PDX 성공률 및 행동9에영향을 미쳤다. 그러나, 치열 교정 모형은 종양 성장을 감시하기 위하여 정교한 화상 진찰 시스템을 요구합니다. 고형 종양의 이종화 이식은 전형적으로 종양 성장을 쉽게 모니터링할 수 있고 비용이 적게소요되는7인 마우스의 피하 측면에 조직을 이식하여 수행됩니다. 그러나, 종양은 기립성이식(10)의경우와 달리 피하로 성장했다.
이식성공률은 종양 유형에 따라 다양하고 크게 의존하는 것으로 나타났다. 종양 세포의 더 높은 백분율을 포함하는 더 공격적인 종양 및 조직 견본은 더 나은 성공률12,,13가있기 위하여 보고되었습니다. 이와 일치, 전이성 부위에서 파생된 종양은 50-80%의 주파수에서 이식하는 것으로 나타났으며, 1차 부위에서 온 종양은 14%12로낮은 주파수에서 이식하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 괴사 세포를 포함하는 조직 및 더 적은 실행 가능한 종양 세포가 제대로 이식합니다. 종양 성장은 또한 원래 종양의 특성을 손상시키지 않고마우스(14)로 주입될 때 조직 혼합에 지하 막 매트릭스 단백질을 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 이식을 위한 조직 조각의 크기와 수는 또한 이식의 성공률에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 더 큰 종양 테이크 비율은 원래 종양 기질을 유지하고 숙주 기질 세포를 제공하기 위해 서브 신장 캡슐의 능력에 의한 피하 이식에 비해 하위 신장 캡슐에서 이식을 위해 보고되었다15.
대부분의 연구는 NOD/SCID 면역 결핍 마우스를 사용, 이는 자연 킬러 세포 부족16 다른 균주에 비해 종양 engraftment, 성장 및 전이를 증가 표시 되었습니다14. 그러나,13세의3-4개월 초에 흉림프종을 개발할 수 있기 때문에 추가 모니터링이 필요하다. SCID 마우스에서 자란 난소 종양 이식에서, B 세포의 아웃성장은 림프종의 발달을 방지하지만 난소종양(17)의이식에 영향을 미치지 않고 리툭시맙에 의해 성공적으로 억제되었다.
최근에는 NSG(NOD) Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)마우스는 인터류신 2 수용체 감마사슬(18)을코딩하는 유전자에서 null 돌연변이를 운반하여 PDX 모델의 생성에 자주 사용되는 변형이 되었다. 마우스의 미래 세대로 항통과된 PDX 모델으로부터종양은 3~6세대19,,20대에대한 조직학적 및 분자 특성을 유지하는 것으로 보고된다. 수많은 연구는 PDX 모델에서 처리 결과가 그들의 해당 환자의 그(것)들을 모방한다는 것을 보여주었습니다2,,33,4,,21,,22,,23. 비소폐암 및 대장암에 대한 PDX 모델에서 화학요법에 대한 반응률은 동일한약물(24,,25)에대한 임상 시험과 유사했다. 임상시험에 등록된 환자를 위해 개발된 PDX 모델에서 실시한 연구는 해당 환자에서 임상적으로 관찰된 약물과 유사한 테스트된 약물에 대한 반응을입증했다 2,,3,,4.
PDX 모델과 함께 환자 종양의 높은 처리량 게놈 분석은 특정 게놈 변경과 치료 반응 사이의 상관 관계를 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 이들은 몇 가지 간행물26,,27에설명되었습니다. 예를 들어, EGFR 증폭을 운반하는 대장 PDX 모델 세트에서 EGFR 억제제 cetuximab에 대한 치료 반응은환자(28)에서cetuximab에 대한 병렬 임상 반응이다.
PDX 모델의 개발 및 적용과 관련된 몇 가지 과제가 있습니다. 그 중 종양 이질성(29)은29PDX30 내의 증식 능력이 높은 단일 세포 클론으로서 처리 반응 해석의 정확도를 손상시킬 수 있어 다른세포(31)를능가할 수 있으므로 이질성의 손실을 초래한다. 추가적으로, 단 하나 종양 생검이 PDX를 개발하기 위하여 이용될 때, 세포 인구의 몇몇은 놓칠 수 있고 최종 이식에서 표현되지 않을 것입니다. 동일한 종양에서 여러 샘플이 문제를 해결하기 위해 이식하는 것이 좋습니다. PDX 종양은 원래 기증자 종양의 모든 세포 유형을 포함하는 경향이 있지만, 이러한 세포는 점차적으로 뮤린 기원3의사람들에 의해 대체된다. PDX 모형에 있는 뮤린 스트로마와 인간 종양 세포 사이 상호 작용은 잘 이해되지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 기질 세포는 종양미세환경(33)을재구성하는 것으로 나타났다.
이러한 제한에도 불구하고 PDX 모델은 환자 치료를 선택하기 위한 맞춤형 의학뿐만 아니라 번역 연구를위한 가장 가치있는 도구 중 하나입니다. PDX의 주요 응용 프로그램은 바이오 마커 발견 및 약물 테스트를 포함한다. PDX 모델은 또한 성공적으로 약물 내성 메커니즘을 연구하고 약물 저항을 극복하기위한 전략을 식별하는 데사용된다 34,,35. 본 원고에 기재된 접근법은 연구원이 인간 종양에 있는 잠재적인 치료 표적을 확인하고 생체내에서 대응하는 약의 효험을 평가하는 것을허용합니다, 처음에 genomically 특징이 었던 이식된 종양을 품고 있는 마우스에서. 프로토콜은 인과간 이식된 난소 종양을 사용하지만 마우스2,,3,,12에서성장하기에 충분히 공격적인 종양의 모든 유형에 적용가능하다.

<table><tbody><tr><td>3M 베트본드</td><td>3M, Co.</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>항AKT 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH 항체(G-9)</td><td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAPK 항체</td><td>세포 신호 Technologies, Inc.</td><td>9926</td><td></td></tr><tr><td>항인산염-AKT 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>항-mTOR 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-mTOR 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-S6 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>항립체 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>항-S6 항체</td><td>세포 신호 기술, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>캡티솔</td><td>ChemScene, Inc.</td><td>CS-0731</td><td></td></tr><tr><td>카보플라틴</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, 주식 회사</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Hi-Fi PCR 클로닝 효소</td><td>애질런트, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>윤활유</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>McCoy's media</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>에이펙스바이오, Inc.</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>ARIAD 제약, Inc.</td><td></td><td></td>AP23573</tr><tr><td>나이르 센서티브 스킨</td><td>처치 & 드와이트 (주)</td><td>Nair 헤어 리무버 샤워 파워 센서티브</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID 마우스</td><td>Charles River, Inc.</td><td>끄덕이다. CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>파클리탁셀</td><td>노바플러스, Inc.</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>밀리포어 시그마, Inc.</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Perjeta</td><td>Genetech, Co.</td><td>Pertuzumab</td><td></td></tr><tr><td>리툭시맙</td><td>Genetech, Co.</td><td>리툭산</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SCID 마우스</td><td>Harlan Laboratories, Inc.</td><td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>SLAx 13-6MHz 선형 변환기</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>SonoSite S 시리즈 초음파 기계</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc SonoSite</td><td>SII</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>P4780-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

구조적 dna 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

당사는 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 차세대 시퀀싱 테크놀로 기, 치료 표적 분석 및 약물 반응 모니터링을 결합한 표적 치료법의 효능을 테스트하기 위한 통합 접근법을 소개합니다. 이 전략은 예로 난소 종양을 사용하여 검증되었습니다. 메이트 쌍 차세대 시퀀싱(MpPseq) 프로토콜은 구조적 변화를 식별하는 데 사용되었으며, 그 다음에는 잠재적으로 표적화 가능한 변경에 대한 분석이 뒤따랐습니다. 면역 절제된 마우스에서 자란 인간 종양은 게놈 분석에 기초하여 선택된 약물로 처리되었다. 결과는 PDX 모델에서 예측된 응답과 관찰된 응답 사이의 좋은 상관 관계를 보여 주었다. 제시된 접근은 조합 처리의 효험을 시험하고 재발성 암을 가진 환자를 위한 개인화한 처리를 돕기 위하여 이용될 수 있습니다, 표준 치료가 실패하고 라벨 떨어져 약을 사용할 필요가 있는 경우에 특히.

탈크 수술 시 절제된 난소 종양으로부터의 조직은 IRB 지침에 따라 수집되어 1) 게놈 특성화 및 2) 면역 절인 된 마우스에서 이식에사용되었다(도 1). 메이트 쌍 염기서열 분석프로토콜(36)37은 손실, 이득 및 증폭을 포함한 DNA의 구조적 변화를 식별하는 데 사용되었다., 한 종양(OC101로 지정된)에서 게놈 변화의 풍경을 보여주는 대표적인 게놈 플롯이 도 2에도시된다. 상급 장뇌 아형 종양에 전형적으로, 여러 이득(블루 라인) 및 삭제(red line)가 발견되었으며, 이는 높은 수준의 게놈 불안정뿐만 아니라 염색체 손실 및 이득을 나타내는, 부추증을 나타내는 것으로 관찰되었다. 평균 300-700변경합계는 고등급 세루 아형종양(45)에서확인된다. 후속 분석은 잠재적...

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

여기서 설명된 프로토콜은 생체내 암 모델을 사용하여 치료 효능을 테스트하기 위한 알고리즘을 입증하는 것을 목표로 한다. 프로토콜은 여러 기술의 조합으로 구성됩니다. 인간 종양 표본의 전체 게놈 바이오 염기서열분석은 게놈 변경을 확인하기 위하여 이용됩니다.이들은 유전자 재배열 및 유전자 복사 번호 변경을 둘 다 포함합니다. 따라서 잠재적으로 약물 사용 가능한 변경 사항을 선택하기 위해 식별된 변경 사항을 분석합니다. 게놈 분석에 기초하여 선택된 약은 면역 손상한 마우스에서 자란 상응하는 종양의 생체 내 처리를 위해 그 때 이용됩니다.개발 된 알고리즘은 암 환자의 치료를위한 치료 결정을 돕기 위한 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 팬더 도구 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 대상 변경 내용을 식별합니다. 우리는 표준 허용 된 유전자 기호를 사용하여 간단한 탭 묘사 파일로 결과 현미경에 의해 확인 된 유전자를 나열 할 수 있습니다.테이블 헤더가 소프트웨어의 경로 수준 U로 전송되도록 목록의 헤더라인에 파운드 기호를 추가합니다. 해당 탐색 탭을 클릭하여 파일을 업로드합니다. 선택한 아이콘을 클릭한 다음 최종 탭을 클릭하여 기본 데이터를 나타내는 단일 아이콘을 할당합니다.환자 파일이 업로드되면 페이지를 미리 보고 경로당 인음이 표시된 유전자 수를 표시하는 열을 식별합니다. 오른쪽의 마지막 열입니다. 메인 창의 왼쪽 상단에 있는 통로 필터를 사용하여 관심 있는 유전자를 포함하는 경로에 표시되는 경로의 수를 제한합니다.우연히 예상보다 더 많은 유전자가 추가되는 경로를 식별하려면 농축 탭 아래에 있는 함수를 사용하십시오. 그런 다음 열이 피셔의 정확한 테스트에서 해당 p 값을 표시하는 기본 테이블에 추가됩니다. 데이터베이스를 선택하여 주 창 왼쪽에 있는 적절한 아이콘을 확인하여 미리 설정된 별표에서 잠재적인 약물 제거 가능한 유전자를 표시합니다.시각화를 위한 경로를 선택하려면 경로 뷰어 페이지에 표시된 이름을 클릭합니다. 각 별표 집합을 나타내는 아이콘은 관련 유전자 옆에 표시됩니다. 통로에 있는 어떤 유전자든지 클릭하면 해당 유전자 카드 페이지가 열립니다.추가 분석을 위해 잠재적인 약에 대한 관심과 안타의 인장 유전자를 보여 준 경로를 선택합니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 라미나르 플로우 후드에서 조직 작업을 수행합니다. 항생제를 함유하는 RPMI, DMEM과 같은 감기 PBS 또는 조직 배양 배지를 포함하는 접시에 종양 조직을 놓습니다.병리학자의 도움으로 인접한 정상 및 괴사 조직에서 실행 가능한 종양 물질을 식별하고 분리합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 병리학자가 지적한 괴사 물질을 제거하십시오. 피하 이식을 수행하려면 멸균 집게, 메스 또는 수술 가위로 종양 조직을 약 2 x 2 x 2 밀리미터 크기로 잘라냅니다.조각난 조직을 얼음 위에 미리 차가운 페트리 접시로 옮춥니다. 조각난 조직, 조직 10개당 약 200마이크로리터로 차가운 마트리겔을 접시에 넣으세요. 잘 섞어서 조직 조각이 10분 동안 결혼에 담가 두십시오.멸균 수술 가위와 집게를 사용하여 마우스 양쪽 측면에 5-10밀리미터 수직 피부 절개를 합니다. 피하 공간에 직선 포셉을 부드럽게 삽입하여 종양 단편이 지방 패드 아래에 배치될 수 있을 만큼 큰 포켓을 만듭니다. 멸균 직선 집게를 사용하여 5마리의 마우스 각각에 이전에 준비된 주머니에 종양 조각을 삽입합니다.조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 이식 후 림프구 증식을 억제하려면 각 마우스에 리툭시맙 100 마이크로리터를 주입하십시오. 마우스의 머리와 입술이 고정되도록 뒷면의 피부를 꼬집고 뒤로 구부려 구강 영역을 위해 마우스를 준비합니다.프로브가 식도에 도달할 때까지 마우스 목구멍 뒤쪽에 게이지 프로브를 삽입합니다. 마우스의 폐가 죽음을 일으키는 천공을 할 수 있기 때문에 프로브가 너무 멀리 삽입되지 않았는지 확인하십시오. 대표적인 게놈 플로트(genomic float)는 한 종양에서 게놈 변화의 풍경을 보여줍니다.고급 혈청형 종양에 대 한 전형적인, 여러 이득 블루 라인 및 손실 레드 라인, 게놈 불안정의 높은 수준을 나타내는 확인 되었다. OC101 종양에서 치료 개입에 대한 주요 추세 변경은 HER2 수용체를 코딩하는 유전자인 ERBB2를 포함하는 염색체 17의 증폭이었다. DNA 수준에서 결과를 검증하기 위해, 특정 프라이머의 여러 세트는 증폭 된 영역의 가장자리를 위해 설계되었습니다.그리고 PCR이 수행되었다. 인간의 DNA를 제어할 때 증폭 생성물이 흡수되지 않았습니다. OC101 종양 DNA에 대한 구체적인 대역이 확인되었다.또 다른 변이체 종양, T14에서 수많은 DNA 이득이 관찰되었습니다. 그 포함 AKT2 RICTOR 유전자에. 면역 블로팅을 사용하여 단백질 수준에서 수행된 유효성 검사는 RICTOR에서 높은 수준의 AKT를 보였다.6주차 말까지 화학요법 치료군에서 종양 부담이 현저한 감소가 관찰되었다. 조합 치료를 받은 그룹에서 혼자 화학 요법을 통해 추가 혜택이 있었다. 종양 조직은 치료 시험의 끝에 치료 반응의 분자 분석을 위해 수집되었다.S6, AKT 및 mTOR의 총 및 인계 수준은 면역블로팅을 사용하여 결정되었다. 치료되지 않은 화학 요법에서 이러한 단백질의 수준을 비교하고, 화학요법 처리, AKT 또는 mTOR 억제제로 치료된 후 2에 대한 현저한 감소를 보였다. 제시된 접근방식은 PDX 모형에 있는 임상 시험을 수행하는 것이 아주 유용합니다.그것은 시험을 위한 약의 최상 선택을 결정하기 위하여 게놈 프로파일링에 의해 얻어진 바와 같이 종양의 분자 특성을 이용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

구조적 DNA 변형 분석 및 환자 유래 이종이식을 사용한 암 내 표적 치료법 테스트

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

인간 종양 이종 이식은 생체 혈관의 성장 단계 중 마우스 유래의 세포에 의해 함침된다. 하류 분석시 이러한 세포의 오염에 의한 바이어스를 회피하기 위해, 자기 세포 선별에 의해 모든 마우스 세포의 광범위한 공핍을 허용하는 방법을 개발 하였다.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

시험관 내 스크리닝을 위해 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 오가노이드를 생성하여 생체내/생체 외 모델의 쌍을 매칭하는 방법을 설명합니다. PDX 종양은 기계적 또는 효소적으로 작은 조각으로 수확/처리되었으며, 원래 PDX에 대해 처리, 냉동 보존 및 특징인 종양 오르가노이드를 성장시키는 영리한 방법.

암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

이 논문은 살아있는 환자 관련 전임상 모델 시스템에서 종양 약물 반응을 평가하기 위한 환자 유래 각종의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명합니다.

환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

이 프로토콜은 마우스에서 유방암 환자 유래 이종이식편의 정소성 이식을 위한 효율적인 비수술적 방법을 설명합니다. 이 기술은 효소 종양 해리 후 유방 지방 패드에 직접 주입하여 고처리량 이식을 가능하게 합니다. 포괄적인 검증은 모델 충실도를 보장하여 다양한 유방암 하위 유형에 대한 엄격한 연구를 촉진합니다.

High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-derived Xenografts(유방암 환자 유래 이종이식편의 High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of breast Cancer Patient-derived Xenografts)

학습하세요 구조적 DNA 재배열 분석과 환자 유래 종양 제노이식을 활용한 표적 치료 시험 알고리즘입니다. 면역결핍 마우스 모델에서 약물 효능을 검증하여 정밀 의료에 기여합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

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