Name: 마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 마우스 배아 조직의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석 방법을. 드롭릿 기반 기술로 비용을 절감하고 배치 효과를 최소화하여 유전자 발현 프로파일링을 효율적으로 수행합니다.

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우리는 지질 기반 바코드 시약의 종류 공급과 실험 단계 및 데이터 분석에 대한 제안에 대한 박사 Zev J. Gartner 실험실에서 데이비드 M. 패터슨과 크리스토퍼 S. 맥기니스 에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 설립 되었다 (HL13347202).

<ol><li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877(2008).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377(2009).</li>
<li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476(2019).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100(2017).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175(2016).</li>
<li>Grün, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77(2016).</li>
<li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).</li>
<li>SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).</li>
<li>Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).</li>
<li>Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).</li>
<li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li>
<li>Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

본 연구에서, 우리는 단일 세포 전사 프로파일을 분석하는 프로토콜을 입증했다. 우리는 또한 scRNA-Seq 워크플로우에서 멀티플렉스 샘플에 두 가지 선택적 방법을 제공했습니다. 두 방법 모두 다양한 실험실에서 실현 가능한 것으로 입증되었으며 비용 효율적이고 배치 효과가없는 단일 세포 실험18,26을실행하는 솔루션을 제공했습니다.
프로토콜을 통과할 때 주의 깊게 따라야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 이상적인 단세포 현탁액은 생존 세포의 >90%가 있어야 하며 세포 밀도는 또한 특정 범위27내에 있어야 한다. 세포 응집체, 파편 및 섬유의 존재를 최소화하기 위해 좋은 품질의 세포를 얻는 것이 중요합니다. 세포 응집체는 샘플 멀티플렉싱에 부정적인 영향을 미치며 액적 생성기계(17)를막을 수 있...

각 단하나 세포의 전사 단면도는 배아 발달 도중 세포 인구 사이에서 변화합니다. 단일 분자가 소수의 유전자1의발현을 시각화하는데 사용될 수 있지만, 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)은 단일 세포에서 유전자의 게놈 전체 발현 패턴을 예시하는 편견없는 접근법을 제공한다. 2009년에 처음 발표된 후2,scRNA-Seq는 최근 몇 년 동안다발성발달 단계에서 다중 조직을 연구하기 위해3,4,5. 또한, 인간 세포 아틀라스가 최근 발달 중심 프로젝트를 시작함에 따라 인간 배아 조직에서 더 많은 단일 세포 데이터가 가까운 장래에 생성 될 것으로 예상됩니다.
개발하는 첫번째 기관으로 심혼은 배아 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 심혼은 다중 세포 모형으로 이루어져 있고 각 세포 모형의 발달은 단단히 시간적으로 그리고 공간적으로 통제됩니다. 지난 몇 년 동안, 초기 발달 단계에서 심장 세포의 기원과 세포 혈통은 선천성 심장 질환 병인을 이해하는 데 엄청난 유용한 탐색 도구를 제공하는6을특징으로하며, 심근 세포 재생을 자극하는 보다 기술적으로 진보 된 방법을 개발하기위한7.
scRNA-Seq는 최근8,9,10에서급속한 확장을 겪고있다. 새로 개발 된 방법으로, 단일 세포 실험의 설계 및 분석은 더 달성될 11,12,13,14. 여기서 제시된 방법은 액적 용액에 기초한 상업적 절차(재료표참조)15,16. 이 방법은 미세 유체 제어 기제어 시스템의 제어하에 오일-물 에멀젼 액적에 고유한 바코드 비드 세트를 캡처하는 기능을 제공합니다. 액적으로 의한 세포 로딩속도는 매우 낮기 때문에 대부분의 액적 에멀젼은 하나의셀(17)만을함유하고 있다. 절차의 독창적 인 디자인은 이질적인 집단에 RNA-Seq를 사용하여 개별 세포의 병렬 분석을 가능하게하는 바코드와 동시에 발생하는 액적 에멀젼으로 단일 세포 분리에서 비롯됩니다.
멀티플렉싱 전략의 편입은 기존의 단일 셀워크플로우(13,14)에중요한 추가 사항 중 하나이다. 이 추가는 셀 더블을 폐기하고, 실험 비용을 절감하고, 배치 효과18,19를제거하는 데 매우 유용합니다. 지질 기반 바코드 전략 및 항체 기반 바코드 전략(재료 표참조)은 주로 사용되는 두 가지 다중화 방법입니다. 특정 바코드는 두 가지 방법으로 각 샘플에 라벨을 부착하는 데 사용되며, 표지된 샘플은 단일 셀 캡처, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 혼합됩니다. 그 후, 풀링된 시퀀싱 데이터는 바코드 시퀀스를 분석하여 분리될 수있다(도 1)19. 그러나 두 메서드 간에는 상당한 차이가 있습니다. 지질 기반 바코드 전략은 지질 변형 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하며, 이는 어떤 세포 유형 선호도가 없는 것으로 밝혀졌다. 항체 기반 바코드 전략은 항원 단백질을 발현하는 세포만을 검출할 수 있는반면,20. 또한, 지질을 염색하는 데 약 10분이 걸리지만 항체를 염색하는 데는 40분이 걸린다(도1). 더욱이, 지질 변형 올리고뉴클레오티드는 항체-컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드보다 저렴하지만 이 기사를 쓰는 시점에서 시판되지 않는다. 마지막으로, 지질 기반 전략은 한 실험에서 96개의 샘플을 다중화할 수 있지만, 항체 기반 전략은 현재 12개의 샘플만 멀티플렉스할 수 있다.
단일 실험에서 멀티플렉스에 대한 권장 세포 수는 2.5 x 104보다낮아야 하며, 그렇지 않으면 세포 배더의 높은 비율과 잠재적인 주변 mRNA 오염으로 이어질 것이다. 멀티플렉싱 전략을 통해 단일 세포 캡처, cDNA 생성 및 여러 샘플에 대한 라이브러리 준비 비용은 하나의 샘플 비용으로 감소되지만 시퀀싱 비용은 동일하게 유지됩니다.

<table><tbody><tr><td>10% Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x 칩 홀더</td><td>10x 유전체학</td><td>120252 330019</td><td></td></tr><tr><td>10x 크롬 컨트롤러</td><td>10x 유전체학</td><td>120223</td><td></td></tr><tr><td>10x 자기 분리기</td><td>10x 유전체학</td><td>120250 230003</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex 어댑터</td><td>10x 유전체학</td><td>330002, 120251</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex 클립</td><td>10x Genomics</td><td>120253 230002</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation 시스템</td><td>애질런트</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 고감도 DNA 키트</td><td>애질런트</td><td>5067-4626</td><td>피츠버그 대학교 건강 과학 염기서열 분석 코어</td></tr><tr><td>바코드 올리고</td><td>통합 DNA 기술</td><td>단일 가닥 DNA</td><td>25 nmol</td></tr><tr><td>버퍼 EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>CD1 마우스</td><td>Chales River</td><td>Strain Code 022</td><td>주문 임신한 마우스</td></tr><tr><td>원심분리기 5424R</td><td>Appendorf</td><td>2231000214</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000073</td><td>주변 온도에서 보관</td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>120262</td><td>-20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 3' GEM 키트 v3,4 rxns</td><td>10x 게놈</td><td>1000094</td><td>-20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 3' 라이브러리 키트 v3</td><td>10x 유전체학</td><td>1000095</td><td>-20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 3' v3 겔 비즈</td><td>10x 게놈</td><td>2000059</td><td>-80 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 A</td><td>시그마 / Millipore</td><td>10103578001</td><td>4 &deg에서 분말을 저장; C, -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 B</td><td>시그마 / 밀리 포어</td><td>11088807001</td><td>4 &deg에서 분말을 저장; C, -20 &deg에서 보관; C 용해 후</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>University of Pittsburgh Health Sciences 염기서열분석 Core</td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브 마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431048</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>2000048</td><td>4 &deg에 저장; C, 비드 클린업 믹스에 사용됨(표 1)</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Theromo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 순수(200프루프, 무수)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL 고선명도 PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 고선명도 PP 원심분리기 튜브</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청, 자격, 미국</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>26140079</td><td>스토어 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Finnpipette F1 멀티채널 피펫, 10-100&mu; l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661020N</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F1 멀티채널 피펫, 1-10&mu; l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661000N</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi Cell Strainer</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td>Porosity 40 &mu; m, 1000 uL 피펫 팁,</td></tr><tr><td>글리세린(글리세롤) 각 50개 팩, 50%(v/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX(Fc 수용체 차단 솔루션)</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td>5 &micro 추가; 100 &micro에 있는 백만 개의 세포당 인간적인 TruStain FcX의 l; l 염색 부피</td></tr><tr><td>이소프로판올 (IPA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>NC0295239</td><td>-20 &deg에서 보관; C, 지질 태그 바코드 라이브러리 믹스에 사용됨(표 1)</td></tr><tr><td>지질 바코드 프라이머(Multi-seq Primer)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Single-stranded DNA</td><td>100 nmol</td></tr><tr><td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950W</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 0.2 ml 8-튜브 스트립</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 칼슘 및 마그네슘 미포함</td><td>1X Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 및 10% 소 알부민(Thermo Fisher 제품 대체)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>피펫 4팩 (0.1&ndash; 2.5&뮤; 엘, 0.5-10&mu; L, 10&ndash; 100&뮤; L, 100&ndash; 1,000&mu; L 가변 부피 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>선택 시약(SPRIselect 시약 키트)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318 (60ml)</td><td></td></tr><tr><td>템플릿 스위치 Oligo</td><td>10x Genomics</td><td>3000228</td><td>-20°C에 보관; C, Master Mix에 사용됨(표 1)</td></tr><tr><td>항체 기반 바코드 전략은 Cell Hashing</td><td></td><td></td><td></td>이라고도 합니다</tr><tr><td>. 셀 브라우저는 Loup Cell Browser</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics 입니다. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td></tr><tr><td>8.1단계에서 상용 분석 파이라인은 Cell Ranger</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank"입니다>https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ 최신/what-is-cell-ranger</a></td></tr><tr><td>지질 기반 바코드 전략은 MULTI-seq</td><td></td><td></td><td></td>라고도 합니다</tr><tr><td>. 잘 관리된 R 플랫폼은 Seurat V3</td>입니다. <td>satijalab</td><td></td><td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td></tr><tr><td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL 초저 보유 필터 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3710</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1000 ul XL 초저보유 필터 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1730</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 ul 초저보유 필터 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8710</td><td></td></tr><tr><td>TotalSeq-A0301 안티-마우스 해시태그 1 항체</td><td>BioLegend</td><td>155801</td><td>0.1 - 1.0 &micro; 100 &micro에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포마다 염색 완충액의 l</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 안티 마우스 해시태그 2 항체</td><td>BioLegend</td><td>155803</td><td>0.1 - 1.0 &마이크로; 100 &micro에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포당 염색 완충액의 l</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 안티 마우스 해시태그 3 항체</td><td>BioLegend</td><td>155805</td><td>0.1 - 1.0 &마이크로; 100 &micro에 있는 항체의 g; 100만 개의 세포당 염색 완충액</td></tr><tr><td>l TrueSeq RPI 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>단일 가닥 DNA</td><td>100 nmol, 지질 태그 바코드 라이브러리 믹스에 사용됨(표 1)</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Universal I5</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>단일 가닥 DNA</td><td>100 nmol</td></tr></tbody></table>

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mrna 염기서열 분석

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

단 세포 mRNA 염기서열 분석은 지난 몇 년 동안 중요한 진전을 이루었으며 발달 생물학 분야에서 중요한 도구가 되었습니다. 그것은 성공적으로 희귀 한 세포 집단을 식별 하는 데 사용 되었습니다., 새로운 마커 유전자를 발견, 공간 및 시간 개발 정보를 디코딩. 단일 셀 방법은 또한 지난 2 ~ 3 년 동안 미세 유체 기반 Fluidigm C1 기술에서 액적 기반 솔루션으로 진화했습니다. 여기에서 우리는 액적 기반 scRNA-Seq 방법을 사용하여 마우스 배아 조직 세포를 프로파일업하는 방법을 입증하기 위해 예를 들어 심장을 사용했다. 또한 워크플로우에 두 가지 전략을 통합하여 단일 실험에서 여러 샘플을 프로파일로 프로파일합니다. 통합된 방법 중 하나를 사용하여 8개의 심장 샘플에서 9,000개 이상의 세포를 동시에 프로파일화했습니다. 이 방법은 다른 유전 적 배경, 발달 단계 또는 해부학 적 위치에서 단일 세포를 동시에 프로파일러딩하는 비용 효율적인 방법을 제공함으로써 발달 생물학 분야에 가치가있을 것입니다.

이 연구에서, 우리는 다중화 된 단일 세포 mRNA 염기서열 분석이 기관의 별도의 부분에서 다른 샘플을 동시에 처리하기 위해 수행된 방법을 전시하기 위해 예로 마우스 배아 심장을 사용했습니다. E18.5 CD1 마우스 하트는 좌측 심방(LA), 우측 심방(RA), 좌심실(LV) 및 우심실(RV)으로 분리및 해부되었다. 심방 및 심실 세포는 지질 기반 바코드 절차를 사용하여 독립적으로 바코드화하고 GEMs 생성 및 역전사 전에 함께 혼합하였다. 개략적인 개요는 그림 1에나와 있습니다. 라이브러리 시공 전에 cDNA 농도를 정량화했습니다(그림2A). 표준 scRNA-Seq로부터 다중화 scRNA-Seq를 수행하는 구별 중 하나는 내인성 cDNA 라이브러리와 샘플 바코드 cDNA 라이브러리가 cDNA 증폭 및 정제 후 별도로 획득되었다는 것이다(단계 4.2.1 및...

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

단일 세포 mRNA 염기서열분석은 단일 세포 수준에서 생물학적 과정을 이해하는 데 널리 사용된다. 멀티플렉스 전략의 출현은 단일 실험에서 여러 샘플의 프로파일링을 허용하여 비용을 크게 절감하고 배치 효과를 피함으로써 증폭을 더욱 확장했습니다. 절차를 시연하는 것은 포스트닥인 웨이 펑과 제 실험실의 기술자인 앤드류 Przysinda입니다.카운트 후, 배아 일 18.5 심장 챔버에서 분리 된 세포를 5 번 10으로 나누어 다섯 번째 알리쿼트로 나누어 세척 당 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 샘플당 180마이크로리터의 PBS로 펠릿을 재연하고 부드러운 믹싱을 통해 각 튜브에 앵커 바코드 스톡 솔루션 20마이크로리터를 추가합니다. 얼음에 5 분 인큐베이션 후, 얼음에 추가 5 분 인큐베이션을 위해 부드러운 혼합각 튜브에 공동 앵커 바코드 스톡 솔루션 20 마이크로 리터를 추가 한 다음 세척 당 1 %의 소음부 알부민으로 보충 된 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 세 번 세척한 다음 샘플을 40 마이크로 미터 세포 세포 스트레이너를 통해 새로운 튜브로 필터링합니다.계산 후 칩 B를 칩 홀더에 조립한 다음 사용하지 않은 우물에 50% 글리세롤 용액의 75마이크로리터를 1열의 미사용 우물에 추가하고, 2열의 미사용 우물에 40마이크로리터, 3열의 미사용 우물에 280 마이크로리터를 넣습니다. 교육 칩은 절차를 시연하는 데 사용됩니다. 부드러운 파이펫팅과 마스터 믹스에 세포 현탁액과 뉴클레아제없는 물의 적절한 볼륨을 추가합니다.생성된 셀 용액의 75마이크로리터를 거품 없이 한 줄로 잘 샘플의 하단 중앙에 추가합니다. 젤 비드를 30초 동안 소용돌이치고, 거품이 없는 2열에서 젤 비드의 하단 중앙에 40 마이크로리터의 비드를 천천히 첨가합니다. 3열에 분할 오일의 측면 벽아래로 280 마이크로리터를 추가합니다.개스킷을 누르지 않고 칩에 개스킷을 부착하고 개스킷을 적시지 않도록 개스킷을 수평으로 유지합니다. 크롬 컨트롤러에 개스킷으로 조립 된 칩을로드하고 크롬 단일 셀 B 프로그램을 실행합니다. 화면은 트레이닝 칩에 대한 크롬 훈련을 보여주지만 실제 실험을 위해 화면은 크롬 단일 셀 B.프로그램이 완료되면 즉시 칩을 제거하고 개스킷을 폐기합니다.뚜껑을 다시 접어 45도 각도로 우물을 노출하고 액체 레벨을 확인하여 나막신이 없는지 확인합니다. 천천히 회복의 가장 낮은 지점에서 에멀젼에 젤 구슬 의 100 마이크로 리터를 흡착하고 구슬의 균일성을 확인합니다. 유화 된 구슬을 얼음에 새 PCR 튜브의 벽 아래로 분배하고 역 전사를위해 열 사이클러에 튜브를 배치합니다.증폭을 위해 cDNA를 준비하려면 실온시 시료에 125마이크로리터의 회수제를 추가하십시오. 불투명한 액체를 관찰해서는 안되며 파이펫팅이나 소용돌이를 피해서는 안됩니다. 튜브 바닥에서 회복제를 천천히 제거하기 전에 60초 동안 기다렸다가 200마이크로리터의 소용돌이 비드 정리 혼합물을 샘플에 추가합니다.피펫 혼합물을 10번 배양한 후 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로 샘플을 높은 위치에 자석에 놓습니다. 용액이 지워지면 상체를 제거하고 펠릿에 80%에탄올200 마이크로리터를 추가합니다.30초 후에 에탄올을 제거하고 두 번 더 세척을 반복합니다. 마지막 세척 후, 샘플을 간단히 원심분리하고 낮은 위치에 자석에 튜브를 배치하여 샘플이 2 분 이내에 공기 건조 할 수 있도록합니다. 시료가 건조되면 자석에서 튜브를 제거하고 갓 준비된 용출 용액35.5 마이크로리터를 추가합니다.실온에서 2분 간 인큐베이션한 후, 샘플의 35마이크로리터를 새로운 튜브 스트립으로 옮기기 전에 용액이 지워질 때까지 자석에 샘플을 배치합니다. 지질 기반 바코딩 전략을 사용하여 cDNA 증폭을 위해 35 마이크로리터 cDNA 샘플에 증폭 반응 혼합물을 추가하여 간략하게 원심분리하기 전에 철저한 혼합을 합니다. 스핀의 끝에서, 적절한 cDNA 증폭 절차에 따라 열 사이클러에서 샘플을 배양한다.선택 시약 120 마이크로리터와 100 마이크로리터의 초순수물을 100마이크로리터의 시료와 파이펫 100마이크로리터에 추가하여 0.6배 선택 시약을 15회 선택합니다. 실온에서 5분 간 인큐베이션한 후 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자석위에 놓습니다. 수퍼너티를 1.5밀리리터 로우 바인드 튜브로 이송하여 바코드 된 cDNA 라이브러리 구조를 다중화합니다.슈퍼나티의 내용이 바코드 된 cDNA와 기본 내용 내생 cDNA를 조립할 때 슈퍼 네이티퍼와 베이스를 모두 저장하는 것을 기억하십시오. 내인성 cDNA를 80%에탄올로 청소하고 40마이크로리터의 용출 완충제로 DNA를 엘로드한 다음 내인성 성적증명서 라이브러리를 준비하기 전에 내인성 cDNA의 품질 관리 검사를 실행합니다. cDNA 농도는 라이브러리 시공 전에 정량화되고 자격을 갖추어야 합니다.내인성 cDNA 및 바코드 라이브러리를 포함한 건설 된 라이브러리도 시퀀싱 전에 정량화되고 자격을 갖추어야합니다. 시퀀싱 후 바코드 식은 각 단일 셀에서 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 이 분석에서 8개의 상이한 샘플에서 세포를 나타내는 한 가지 유형의 바코드를 고유하게 표현한 단일 세포의 8개 그룹이 관찰되었다.또한 일부 세포는 바코드를 표현하지 않았기 때문에 부정적인 세포로 정의되었으며 다른 세포는 이중을 나타내는 두 개의 서로 다른 바코드를 표현했습니다. 단일 세포를 사용하여 세포 이질성 및 분자 규정은 세포 유형 주석, 신규 및 희귀 세포 유형 식별, 해부학 영역 비교 분석 및 세포 주기 상 분리와 같은 유전자 상측 경로 분석에 의해 평가될 수 있다. 당신이 할 수있는 경우 에멀젼젤 구슬을 이미지하는 것이 도움이됩니다, 이미지는 절차가이 시점까지 성공했는지 여부를 알려줍니다.샘플 멀티플렉스는 실험을 설계하는 데 큰 유연성을 제공합니다. 이 시연을 본 후, 나는 당신이 당신의 자신의 실험을 시작하는 것에 대해 더 자신감을 가질 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

배우세요 마우스 배아 조직의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석 방법을. 드롭릿 기반 기술로 비용을 절감하고 배치 효과를 최소화하여 유전자 발현 프로파일링을 효율적으로 수행합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

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