Name: 등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 PVA 스폰지 이식 및 꼬리 피부 절제 모델을 사용하여 쥐의 급성 상처 치유를 평가하는 방법을. 이 기법은 세포 및 사이토카인 반응을 분석하여 당뇨병 등 복합 질환에서의 상처 치유 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 브라운 대학 유동 세포 분석 및 선별 시설의 케빈 칼슨 (Kevin Carlson)에게 유동 세포 분석 실험에 대한 상담 및 지원에 감사드립니다. 그림 1B 및 C의 이미지는 BioRender로 작성되었습니다. 카일 리와 그레고리 세르파는 사진 촬영에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) YFAA15 D15AP0100, 신흥 새로운 과학 상 (브라운 대학), 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, 국립 환경 과학 연구소 (NIES) T32-ES7272 (환경 병리학 교육), 브라운 대학 연구 종자 상.

여기에 설명된 모든 동물 연구는 브라운 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원의 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었습니다.  참고: 비디오에서는 데모 목적으로 수술용 드레이프가 생략되었습니다.
1. PVA 스폰지의 피하 이식
<ol><li>가위를 사용하여 PVA 스폰지 시트를 8mm x 8mm x 4mm 조각으로 자릅니다. 비커에 멸균 1x PBS에 담가 PVA 스폰지 조각을 다시 수화.</li>
	<li>스폰지를 1x PBS로 오토클레이브하여 살균하고 완전히 식힙니다. 4 °C에서 멸균 1x PBS에 오토 클레이브 스폰지를 저장합니다.</li>
	<li>외과 적 이식을 수행하기 전에, 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 멸균 배양 접시에 스폰지의 필요한 수를 aliquot. 여분의 스폰지를 멸균 1x PBS에 보관하여 향후 사용을 위해 4°C에 보관하십시오. 재수화 후 스폰지가 1cm x 1cm x 0.5cm로 팽창하도록 하십시오. 탈수 된 PVA 스폰지의 이미지는 그림 1A에표시됩니다. 참고 : 수술 부위의 멸균성을 유지하기 위해 PVA 스폰지 이식 절차는 한 개인이 마우스를 처리하고 수술 부위를 준비하고 두 번째 사람이 이식을 수행해야합니다.</li>
	<li>8-12주 된 남성 C57BL/6J 마우스를 복강 내 주사로 80 mg/kg 케타민을 마취시다. 관리 40 진의 mg/kg의 실 라 진 복 강 진에 대 한 진 통.  페달 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 클리퍼로 도르섬을 따라 머리카락을 제거하여 수술 부위를 준비하십시오. 멸균 거즈를 사용하여 포비동 요오드 용액을 면도 부위에 2x 바르고 70 % 에탄올을 바르습니다.</li>
	<li>멸균 수술 커튼위에 마우스를 놓습니다. 가열된 패드를 수술용 커튼 아래에 놓아 마우스의 핵심 온도를 유지합니다.</li>
	<li>수술을 수행하기위한 멸균 수술 장갑을 착용. 집게로 기본 조직에서 등쪽 피부를 당기고 멸균 수술 가위를 사용하여 등쪽 중간선을 따라 약 2cm 앞쪽으로 꼬리를 절개하십시오. 멸균 집게로 절개를 열어 놓고, 도 1B에표시된 위치 중 하나에서 도르섬을 따라 피하 포켓을 형성하기 위해 멸균 곡선, 무딘 팁 수술 가위를 사용합니다.</li>
	<li>포셉을 계속 사용하여 피부를 기본 조직에서 들어 올립니다. 멸균 수술 용 가위를 사용하여 배양 접시에 PVA 스폰지 1 개를 부드럽게 짜서 과도한 PBS를 제거하십시오. 멸균 수술 가위를 사용하여 PVA 스폰지를 한 쪽 모서리로 집어 들고 가위가 들고있는 모서리로 이어지며 1.4 단계에서 형성 된 피하 포켓에 스폰지를 놓습니다.</li>
	<li>그림 1B와같이 총 6개의 스폰지를 피하 포켓에 넣고 이 과정을 5회 반복합니다.</li>
	<li>절개된 등지 피부를 멸균 집게와 함께 꼬집고 두 개의 스테인리스 스틸 상처 클립으로 절개를 닫습니다.</li>
	<li>각 마우스에 대한 멸균 수술 기구의 새로운 세트를 사용합니다. 또는 비드 멸균기를 사용하여 마우스 사이에 악기를 살균하십시오.</li>
</ol>2. PVA 스폰지에서 유체의 절연
<ol><li>급성 상처 사이토 카인 밀리유를 평가하기 위해, 1-14 일 후 착상 사이에 스폰지를 분리.</li>
	<li>5 mL 주사기의 배럴을 16 mL 배양 튜브에 중첩하여 유체 수집 튜브를 준비합니다.</li>
	<li>CO2 질식에 의해 이식된 PVA 스폰지로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 후.</li>
	<li>수술 스테이플을 제거하고 톱니 집게로 절개를 엽니다. 가위를 사용하여 등중간선을 따라 절개를 확장합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 피하 주머니에서 스폰지 하나를 추출하고 스폰지에 대한 압력을 최소화하기 위해주의하면서 준비된 주사기 배럴로 옮긴다. 스폰지의 표면에 부착 된 남아있는 결합 조직을 분리하십시오. 필요한 경우 가위를 사용하여 스폰지를 주변 조직에서 해부하십시오. 나머지 스폰지와 스폰지 제거 과정을 반복합니다. 스폰지가 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>상처 액을 분리하기 위해, 5 mL 주사기를 포함하는 배양 튜브를 스폰지700 x g에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>원심 분리 후 주사기와 스폰지를 버립니다. 상처액은 16 mL 배양 튜브에서 수집될 것이다. 7일째 상처로부터 채취한 유체의 대표적인 이미지는 도 1D에나와 있다. 상처 액을 -80 °C에서 장기간 보관하기 위해 깨끗한 튜브로 옮깁니다.</li>
</ol>3. PVA 스폰지에서 세포의 격리
<ol><li>급성 상처 치유 세포 milieu를 평가하기 위해, 사이 스폰지를 수집 1-14 일 후 스폰지 이식. 이식 후 7일 후에 상처로부터 얻은 스폰지는 도 1E에나타내었다.</li>
	<li>1% FBS, 1% HEPES 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 1x HBSS(+칼슘/+마그네슘/-페놀 레드)를 함유한 수집 매체를 준비하십시오.</li>
	<li>15 mL 원추형 튜브에 HBSS 수집 매체의 5 mL.</li>
	<li>2.2-2.4에 기재된 바와 같이 안락사된 마우스로부터 PVA 스폰지를 추출한다. 스폰지를 HBSS 수집 매체의 5 mL을 포함하는 원추형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>스폰지와 HBSS 컬렉션 매체를 붓는 다음 80 mL 블렌더 백에 옮니다. 패들이 스폰지와 미디어를 공격할 수 있도록 패들 블렌더의 해치에서 블렌더 백을 걸어 놓습니다. 패들 블렌더의 설정을 조정하여 60초 동안 높은 높이에서 실행합니다.</li>
	<li>믹서기 백에서 파이펫이 있는 15mL 원추형 튜브로 미디어를 다시 옮기고 스폰지를 가방에 넣습니다. 스폰지를 짜서 미디어를 철저히 놓습니다. 패들 블렌더의 설정을 조정하여 높은 높이에서 30s 동안 실행합니다. 블렌더 백에 5 mL의 용지를 넣고 배복 과정을 2x 반복하여 총 3개의 스폰지 세스를 시둡니다.</li>
	<li>원심분리기원심은 250 x g에서 5분 동안. 세포와 적혈구의 빨간 펠릿원심 분리 후 원심 관의 바닥에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상류를 버리고 적혈구 를 수행 : 혼합 세포 펠릿과 피펫에 dH2O의 900 μL을 추가합니다. 10x PBS의 100 μL로 중화하십시오. 튜브에 4 mL의 1x PBS를 추가하여 용해를 완전히 중화 한 다음 250 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 추가하십시오. 참고: 라시스 단계는 간략해야 합니다. 3-5 s 이상세포와 접촉하는 근해를 떠나는 것은 비 적혈구의 용해 귀착될 수 있었습니다.</li>
	<li>원심 분리 후, 적혈구가없는 상처 세포를 포함하는 백혈구 펠릿이 원엽 관의 바닥에 나타납니다. 상급체를 버리고 하류 분석을 위해 원하는 배지에 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
</ol>4. PVA 스폰지 상처에서 분리 된 선천성 백혈구의 선택적 유동 세포 분석
<ol><li>10 μg/mL 항 CD16/CD32 FcRγII/III 항체를 함유하는 차단 항체용의 25 μL에서 25 μL에서 0.5-1 x 106개의 상처 세포를 1x PBS + 1% BSA로 희석한 재중단. 참고: 모든 항체는 유세포 분석분석을 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 적정되어야 합니다.</li>
	<li>얼음에 10 분 동안 차단 항체로 세포를 배양.</li>
	<li>PerCP-eFluor710-Ly6G의 2.5 mg/mL, FITC-Ly6C의 5 mg/mL, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, 및 eFluor660-F4-80 의 10 mg/mL을 포함하는 항체의 2x 마스터 믹스를 만듭니다. 직접 차단 항체에 인큐베이팅 세포에 항체 칵테일의 25 μL을 추가합니다.</li>
	<li>빛으로부터 보호된 얼음에 20분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포를 1x PBS로 2x 세척합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 1:1,000희석된 아민 반응성 생존가능 성염염-eFluor506의 마스터 믹스를 만드십시오. 생존성 염료 용액의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 참고: 혈청은 내인성 단백질에 염료의 결합을 방지하기 때문에 고정 가능한 생존 단계에서 제외되어야 합니다. 빛으로부터 보호된 얼음에 20분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포를 1x PBS로 2x 세척합니다. 1% 파라포름알데히드의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시다.</li>
	<li>빛으로부터 보호된 얼음에 15분 동안 1% 파라포름알데히드로 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포를 1x PBS로 1x 세척하고 유세포 분석분석을 위해 1x PBS로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
</ol>5. 꼬리 피부 절제
<ol><li>8-12주 된 남성 C57BL/6J 마우스를 복강 내 주사로 80 mg/kg의 케타민을 마취시다. 관리 40 진의 mg/kg의 실 라 진 복 강 진에 대 한 진 통. 페달 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.</li>
	<li>무균 거즈를 사용하여 마취 된 마우스의 꼬리에 수술 부위를 준비하고 povidone-요오드 용액을 2 x 적용한 다음 70 % 에탄올을 한 번 적용합니다.</li>
	<li>미리 만들어진 템플릿에서 추적하는 영구 마커를 사용하여 꼬리의 등쪽 표면에 10 mm x 3 mm 섹션을 정의하고 꼬리의 기저부로부터 10mm(그림1C)를정의합니다.</li>
	<li>마취 된 마우스를 멸균 수술 커튼에 놓습니다.</li>
	<li>수술 절차를 수행하기 위해 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 멸균 메스 블레이드를 사용하면 상처 부위의 오른쪽, 아래 및 왼쪽 가장자리를 따라 전체 두께절개를 합니다.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 절제된 피부를 꼬리에서 벗겨내고 멸균 수술 용 가위를 사용하여 상처 부위의 위쪽 가장자리를 잘라냅니다.</li>
	<li>출혈을 막기 위해 멸균 거즈로 압력을 가하십시오.</li>
	<li>상처 부위에 스프레이 배리어 필름을 적용합니다.</li>
	<li>일정한 시간 간격으로 고정 된 거리에서 상처를 촬영하십시오. 평면 분석으로 사진을 분석하여 상처 영역 측정을 결정합니다. 또는 캘리퍼스를 사용하여 상처 길이 및 너비 측정을 얻습니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

이 문서는 급성 상처 치유 반응의 평가를 허용 하는 두 가지 견인 뮤린 상처 모델을 설명 합니다. 첫 번째 방법은 등지 피하 공간에서 PVA 스폰지의 외과 이식을 포함한다. 이 접근법은 고립된 스폰지로부터 수득된 많은 수의 세포 및 상처 체액의 양으로 인해 세포 상처 치유 반응을 연구하기 위한 생검 기반 상처 모델보다 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 절차의 성공적인 실행을 위해, 절개 주위 피부를 철저히 청소하여 멸균 수술 장을 유지하는 것은 필수적입니다, 상처에 박테리아의 전좌는 크게 치유의 과정을 변경합니다. 여기에 기술된 세포 분리 방법을 사용하여, 스폰지 추출 의 시간에 따라 PVA 스폰지로부터 적어도 1-10 x 106 세포를 분리할 수 있다. PVA 스폰지 상처로부터 분리된 세포의 대부분은 실행가능하다(그림 2D). 그러나, 죽은 세포가 기계적 중단 후에 단리된 상처 세포의 ~20%까지 구성할 수 있기 때문에, 유세포 분석 기지를 둔 분석을 진행할 ...

상처 치유 과정을 검사할 수 있는 많은 뮤린 모델 시스템이 있으며, 각각 특정 한 장점과 한계를 가지고1,,2. 다음 방법은 두 개의 뮤린 상처 모델을 제시하며, 각 모델은 상처 치유 반응의 특정 측면을 다루고 부상에 대한 반응에서 교란의 원인과 효과를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 상처 치유 과정은 별개의 단계에서 발생합니다. 첫 번째 단계는 혈소판, 호중구 및 단핵구 / 대식세포의 급속한 유입뿐만 아니라 전염증성 사이토 카인 및 케모카인의 생산을 특징으로하는 염증성입니다. 염증의 해결에 따라, 환경은 profibrotic 및 proangiogenic 사이토 카인 및 성장 인자의 유도와 함께 더 회복 상태로 전환. 과립 조직은 증착되고 신혈관은 근섬유 아세포, 섬유 아세포, 상피 세포 및 내피 세포의 이동과 함께 형성됩니다. 최종 단계에서 임시 세포 외 매트릭스가 리모델링되고 흉터 형성 및 상처 폐쇄가2,3,34,45,5,66,7,,8로진행됩니다.
어떤 단일 뮤린 모델은 상처 치유의 모든 단계를 연구하는 시스템을 제공하지않습니다 2. 여기에서, 2개의 외과 상처 모형은 기술됩니다: 1개는 심각한 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 설명하고, 다른 하나는 조직학 분석 뿐만 아니라 상처 폐쇄의 평가를 허용합니다. 이들 두 가지 방법은 상처 치유 반응의 상이한 양상에 대한 섭동 또는 동반의 효과를 평가하기 위해 상호 보완적인 방식으로 사용될 수 있다. 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스폰지의 등쪽 피하 이식은 세포 및 과립 조직반응의다양한 측면을 해명하기 위해 수십 년 동안 설치류 모델에 사용되어 왔다 시스템9,10, 11,,12,,11,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20 ,21,22,23,,24. 이 접근법은 사이토카인이 풍부한 상처 액과 세포 침투를 검색할 수 있게 합니다. 이 모델에서는 1cm x 1cm x 0.5 cm 크기의 PVA 스폰지가 후방 등쪽 중간선에서 제작된 2cm 절개를 통해 피하 포켓에 넣습니다. 절개는 수술 클립으로 닫혀 있으며, 스폰지는 세포와 유체 격리를위한 이후 시점에서 검색 할 수 있습니다. 분리된 스폰지의 세포 및 사이토카인 밀리유는 약 14일 간 이식 후 급성 상처 치유의 정상적인 단계를 반영한다. 나중 시점에서 모델은 과립 조직 형성 및 이물질 반응1을연구하는 데 더 유리하다. 이 시스템을 사용하면 다른 생검 기반 방법,,,1,,22,23,25,26에서세포를 분리하는 것에 비해 자형및 기능성 세포 및 RNA 분리에 대한 뚜렷한 이점을 제공하는 >106 세포를 분리할 수 있습니다.
상처 폐쇄율은 꼬리 피부 절제 모델을 사용하여 결정됩니다. 이 모델에서, 처음에 Falanga 등에서 설명한 바와 같이 다른 사람에 의해 보고27,,28,,29,,30,꼬리 피부의 1cm x 0.3 cm 전체 두께 섹션은 꼬리의 기저 부근에서 제거된다. 상처 부위는 쉽게 시각화되고 시간이 지남에 따라 측정 할 수 있습니다. 대안적으로, 꼬리 조직은 조직학적 분석을 위해 분리될 수 있다. 이러한 접근법은 잘 확립된 등쪽 펀치 생검 방법에 대한 대안으로서 또는 이를 사용할 수 있다. 이 두 모델 사이의 주요 차이점은 상처 폐쇄율, 모피의 존재 또는 부재, 및 피부 구조22,31,,32입니다. 꼬리 피부 상처는 전체 폐쇄가 발생하기까지 약 21 일이 걸리기 때문에 상처 폐쇄를 평가하는 더 긴 기간을 제공합니다. 이것은 파니큘러스 카르누스의 작용으로 인해 주로 수축에 의해 훨씬 더 빨리 (~ 7-10 일) 치유되는 부목되지 않은 등쪽 펀치 생검에 반대합니다. 부목 등쪽 펀치 생검은 더 느리게 치유하고 수축 치유의 효과를 감소시키지만, 수축계메커니즘을제한하기 위해 이물질의 존재에 의존한다1,2,27,,30,,31,,33.,
설명된 상처 모델은 교란이 없는 정상적인 상처 치유 과정을 이해하는 데 유익합니다. 설치류 피부의 치유는 느슨한 구조, 수축성 치유에 대한 의존성 및 기타 해부학적 차이를 포함하여 인간의 피부와 매우 중요한 면에서 다르지만, 뮤린 시스템은 기계론및 선별 연구에 특정 한 이점을 제공합니다. 이들 중 가장 중요한 것은 근친 균주와 유전 돌연변이체의 가용성, 유전 적 견인성 및 낮은 비용입니다. 뮤린 연구에서 얻은 기계적 통찰력은 돼지 계통2,,31과같은 인간의 피부 치유를 보다 밀접하게 모방하는 복잡한 동물 모델로 번역될 수 있다.
안정된 상태에서 상처 치유 반응을 검사하는 것 외에도, 이러한 모델은 세포, 사이토카인 및 총 조직 수준에서 상처 치유 결함의 기초를 이해하기 위해 comorbid 조건과 결합 될 수 있습니다. 이러한 특정 환경에서는 수술 후 폐렴과 같은 특정 동반 질환 상태의 효과를 평가하기 위해 두 모델이 함께 사용될 수 있으며, 급성 세포 상처 치유 반응 및 상처폐쇄속도(30)에대한 반응도 있다.

<table><tbody><tr><td>10x 인산염 완충 식염</td>수 <td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브, Olympus</td><td>Genesee</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (+칼슘, +마그네슘, &ndash; 페놀 레드)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45.2-APC Fire750</td><td>BioLegend</td><td>109852</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>안티 마우스 F4/80-eFluor660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-4801-82</td><td>클론 BM8</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly6C-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553104</td><td>클론 AL-21</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly6G-PerCP-eFluor710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9668-82</td><td>클론 1A8-Ly6g</td></tr><tr><td>안티 마우스 Siglec-F-APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565183</td><td>클론 E50-2440</td></tr><tr><td>Autoclip 스테인레스 스틸 상처 클립 애플리어</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9021392</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 스테인레스 스틸 상처 클립, 9mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9334081</td><td></td></tr><tr><td>블렌더 백, 80mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14258201</td><td></td></tr><tr><td>배양 튜브, 16mL, 17x100</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-130</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 - 표준</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>고정성 생존도 염료 eFluor506</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>헤페스 용액, 1M</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-534</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(5000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올 스폰지 - 큰 기공 크기</td><td>Ivalon/PVA 무제한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>www.sponge-pva.com 포비돈-요오드 용액, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>3955-16</td><td></td></tr><tr><td>스프레이 배리어 필름, Cavilon</td><td>3M</td><td>3346E</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster, 110V</td><td>수어드</td><td>0080/000/AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

상처 치유는 염증, 과립 조직 형성, 섬유증 및 분해의 질서 정연한 진행을 필요로하는 복잡한 과정입니다. Murine 모델은 이러한 프로세스에 대한 귀중한 기계적 통찰력을 제공합니다. 그러나 상처 치유 반응의 모든 측면을 완전히 해결하는 단일 모델은 없습니다. 대신 여러 모델을 사용하여 상처 치유의 다양한 측면을 해결하는 것이 이상적입니다. 여기서, 상처 치유 반응의 다양한 양상을 해결하는 두 가지 다른 방법이 설명된다. 첫 번째 모델에서, 폴리 비닐 알코올 스폰지는 피하 마우스 dorsum을 따라 이식된다. 스폰지 검색 다음, 세포는 기계적 중단에 의해 분리 될 수 있으며, 유체는 원심 분리에 의해 추출 될 수있다, 따라서 급성 상처 환경에서 세포 및 사이토 카인 반응의 상세한 특성을 허용. 이 모델의 한계는 상처 폐쇄 속도를 평가할 수 없다는 것입니다. 이를 위해 꼬리 피부 절제 모델이 활용됩니다. 이 모델에서는 꼬리 의 기저부 근처의 등쪽 표면을 따라 10mm x 3mm 직사각형 의 꼬리 스킨 조각을 절제합니다. 이 모델은 치부 분석을 위해 쉽게 촬영하여 치유 속도를 결정할 수 있으며 조직학적 분석을 위해 절제될 수 있습니다. 설명된 두 방법 모두 유리하게 변경된 마우스 긴장에서 이용될 수 있습니다, 또는 상처 치유 기계장치를 해명하기 위하여 당뇨병, 노화, 또는 이차 감염과 같은 comorbid 조건의 모형과 함께.

PVA 스폰지 이식 다음 전신 염증 반응 PVA 스폰지 이식 수술은 상처 후 1일 동안 플라즈마에서 IL-6의 유도에 의해 입증된 바와 같이 전신 염증 반응을일으켰다(도 2A). TNF-α 및 IL-1β를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인뿐만 아니라 CCL2 및 CXCL1을 포함하는 케모카인의 배열은 PVA 후 7일 동안 전세포증으로 유도되었고, 다른 곳에서26,,30을기재하였다.
PVA 스폰지 상처에서 세포와 액체의 격리 PVA 스폰지 상처 모델의 주요 장점은 급성 세포 상처 치유 반응의 현상형 및 기능 분석을위한 충분한 세포를 복구 할 수있는 능력이다. PVA 스폰지 상처로부터 회복 될 수있는 세포의 수는 상처 당일 1 x 10 6 에서 8 x 10...

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

이러한 모델은 세포 및 사이토카인 운동 및 상처 폐쇄를 포함한 상처 치유 반응의 다양한 측면을 평가하기 위해 구현될 수 있다. PVA 스폰지 모델은 페노티픽 및 기능 분석을 위해 수백만 개의 상처 백혈구를 회수할 수 있으며, 꼬리 피부 절제 모델은 느린 치유 상처의 쉬운 시각화를 가능하게합니다. PVA 스폰지 및 절제테일 테일 상처 모델은 당뇨병이나 폐렴과 같은 혼수 상태와 함께 상처 치유에 미치는 영향을 이해할 수 있습니다.메레디스 크레인으로 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조수 인 빌 헨리가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에 가위를 사용하여 PVA 스폰지 시트를 8-8-4 밀리미터 조각으로 자른다. PBS에서 스폰지를 살균하기 전에 10 분 동안 비커에 멸균 PBS로 스폰지 조각을 다시 수분처리하십시오.스폰지가 식으면 PBS에 잠긴 스폰지를 섭씨 4도에 보관하십시오. 시술 당일, 실험동물 1인당 6개의 스폰지를 멸균 라미나르 플로우 후드에 멸균 배양 접시에 넣고, 8주에서 12주 된 남성, C57-Black/6 마우스에 발가락 꼬집어에 대한 반응이 부족한지 확인한다. 보조 용 클리퍼를 사용하여 도섬과 멸균 거즈를 따라 머리카락을 제거하여 면도 부위에 포비도네 요오드 용액을 두 번 적용한 다음 70% 에탄올 한 번 적용합니다.그런 다음 도우미는 가열 패드 위에 배치 멸균 수술 커튼에 마우스를 전송해야합니다. 멸균 장갑을 착용하고, 집게를 사용하여 등색 피부를 기본 조직에서 끌어당기고 멸균 수술 가위를 사용하여 등주 중간선을 따라 약 2센티미터 절개를 꼬리의 베이스로 만듭니다. 멸균 집게로 절개를 열고, 멸균, 곡선, 무딘 팁 수술 가위를 사용하여 도면에 표시된 위치 중 하나에서 도섬을 따라 피하 포켓을 형성한다.가위를 삽입하면 팁을 두 번 열고 닫아 삽입 된 스폰지를 잡을 수있을만큼 큰 포켓을 형성하십시오. 포켓이 생성되면 멸균 수술 가위를 사용하여 문화 접시에 PVA 스폰지 1 개를 부드럽게 짜서 과도한 PBS를 제거하십시오. 다음으로, 스폰지를 한 쪽 구석으로 들어 올리고 가위가 들고 있는 모서리로 이어지는 스폰지를 피하 주머니에 넣습니다.여섯 개의 스폰지가 모두 입증된 대로 배치되면 멸균 포셉을 사용하여 절개 된 등불 피부를 함께 꼬집어 두 개의 스테인레스 스틸 상처 클립으로 절개를 닫습니다. PVA 스폰지 유체 절연의 경우 이식 후 1~14일 후에 수술용 스테이플을 제거하고 치아 집게로 절개를 엽니다. 가위를 사용하여 등주 미드라인을 따라 절개를 확장하고 집게를 사용하여 피하 포켓에서 하나의 스폰지를 추출합니다.스폰지를 얼음 위에 16 밀리리터 배양 튜브에 중첩된 5 밀리리터 주사기의 배럴에 넣고 필요에 따라 스폰지 표면에 부착된 결합 조직을 분리합니다. 모든 스폰지가 추출되고 입증된 대로 옮겨지면 배양 튜브를 원심분리하여 상처 액을 수집합니다. PVA 스폰지에서 세포를 분리하려면 스폰지를 수집 한 후 HBSS 수집 배지 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다.모든 스폰지를 수집하면 스폰지 서스펜션을 80 밀리리터 블렌더 백에 넣고 패들 블렌더의 해치에서 가방을 걸아 패들이 스폰지와 매체를 공격할 수 있도록 합니다. 패들 블렌더를 60초 동안 높이로 실행하도록 설정하고 시작합니다. 블렌더가 멈춘 후 가방에 스폰지를 짜서 배지를 완전히 방출하고 파이펫을 사용하여 믹서기 가방에서 15 밀리리터 튜브로 배지를 다시 옮겨넣습니다.패들 블렌더의 설정을 조정하여 30초 동안 높이 로 실행하고 블렌더 백에 5 밀리리터를 추가합니다. 수집된 매체의 튜브를 원심분리하기 전에 위닝 과정을 두 번 더 반복합니다. 세포와 적혈구의 적색 펠릿은 원문 관의 바닥에 표시되어야합니다.증류수 900마이크로리터를 세포와 3~5초 동안 혼합한 후 10x PBS의 100마이크로리터와 1x PBS의 4밀리리터로 리시스를 중화시합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 다운스트림 분석을 위한 적절한 배지에서 백혈구 펠릿을 재보중단한다. 꼬리 피부 상처를 만들기 위해, 마취, 8- 12 주 된, 남성, C57-블랙 / 6 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 수술 부위에 두 번 포비도네 요오드 용액을 적용하기 위해 멸균 거즈를 사용하여 70 %의 에탄올을 적용합니다.영구 마커와 미리 만들어진 템플릿을 사용하여 꼬리의 등대 표면에 10 x 3 밀리미터 섹션을 추적하고 꼬리 베이스에서 10 밀리미터를 추적하고 마우스를 멸균 수술 커튼에 놓습니다. 멸균 수술 장갑을 착용하고 멸균 메스 블레이드를 사용하여 상처 부위의 오른쪽, 아래 및 왼쪽 가장자리를 따라 전체 두께 절개를 합니다. 멸균 포셉을 사용하여 절제된 피부를 꼬리에서 떼어내고 멸균 수술 가위를 사용하여 상처 부위의 상단 가장자리를 잘라냅니다.멸균 거즈를 사용하여 상처에 압력을 가하여 출혈을 멈추고 상처 침대에 스프레이 장벽 필름을 발라주세요. 이어서, 일정한 시간 간격으로 고정된 거리에서 상처를 촬영하고, 평면 분석을 통해 사진을 분석하여 상처 부위 측정을 결정한다. PVA 스폰지 이식 수술은 부상 후 하루 플라즈마에서 IL-6의 유도에 의해 입증된 바와 같이 전신 염증 반응을 생성한다.PVA 스폰지 상처에서 복구 할 수있는 세포의 수는 시간이 지남에 따라 증가, 호중구와 함께, 단세포, 및 스폰지 내에서 인구에 침투 기본 세포를 포함하는 대식세포. 호중구는 Ly6G 양성, 시글-F-음성 세포로 식별됩니다. 시그렉-F 양성 세포는 주로 호산구입니다.Ly6G 음성에 게이팅, Siglec-F-음성 셀F4/80 양성 단세포 및 대식세포의 식별을 허용. F4/80 양성 세포는 Ly6C 고염증단세포 및 Ly6C 저단세포 유래 대식세포를 구별하기 위해 Ly6C 발현에 의해 더욱 분화될 수 있다. 흥분 꼬리 피부 모델은 조밀한 털이 부족한 단단한 피부에서 상처 폐쇄를 연구하는 등지 피부 펀치 생검 방법에 대한 대안을 제공합니다.상처 폐쇄는 시간이 지남에 따라 상처 침대의 면적을 측정하여 정량화 될 수 있습니다. 꼬리 피부 상처는 또한 H와 E와 마슨의 삼색 염색을 통해 조직학 분석에 의해 단면에서 관찰될 수 있습니다. 이러한 이미지에서, 절제된 피부의 측면 여백은 꼬리의 등쪽 표면에 있는 화살촉에 의해 표시됩니다.꾸준한 상태 상처 치유를 이해하기 위해, 치료 화합물 또는 내정간섭은 또한 PVA 스폰지로 직접 주입을 통해 또는 꼬리 상처 침대에 납품을 통해 시험될 수 있습니다.

assessment-acute-wound-healing-using-dorsal-subcutaneous-polyvinyl

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마약, 성장 요인 및 / 또는 상처 수리의 동물 모델에서 조작 세포의 효과를 분석하는 유용한 도구가 설명되어 있습니다. 이 기술은 구현 및 포함하고 원하는 치료를하며 excised하고 분석할 수 있도록 플랫폼을 제공하기 위해 폴리비닐 알코올 (PVA) 스폰지의 속성을 활용합니다.

폴리비닐 알코올 스폰지 모델 주입

생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.

상처 치유의 생쥐 모델

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

쥐가 크기 때문에, 가용성, 오히려 유순 한 행동에, 몇 년 동안 연구 모델로 이용되고있다. 이 프로토콜의 목적은 만성 상처의 병태 생리에 대한 통찰력을 제공하는 허혈성 상처 치유 피부 모델로서 쥐를 이용하는 것이다.

쥐 허혈성 피부 상처 모델의 데모

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

이 연구는 두 가지 중요한 실험 기법을 제시합니다: 상처 봉합을 평가하기 위한 쥐 상처 모델의 구축과 세포 생존력을 보존하기 위해 쥐 피부에서 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

마우스 상처 모델 및 단일 세포 현탁액 준비

상처는 전 세계적인 보건 문제를 나타냅니다. 이 연구는 상처 측정 변동성을 최소화하기 위해 디지털 플레니메트리를 활용한 표준화된 사진 부스를 개발했습니다. 14일 동안 생쥐의 상처를 모니터링한 결과, 처음에는 상처 부위와 둘레가 증가한 후 점차 봉합되는 것으로 나타났습니다. 이 방법론은 전임상 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하기 위한 디지털 플레니메트리

치유 과정의 다양한 단계에서 생리학적 또는 병리학적 조건에서 다양한 치료제를 평가할 수 있는 쥐 피부 상처 모델이 기술되었습니다. 또한, 조직 복구 기간 동안 상처 수축 속도를 모니터링하기 위한 수동 평면측정 프로토콜도 상세히 안내되어 있습니다.

쥐 수술 피부 상처 모델: 상처 치유 연구 및 생체재료 평가를 위한 접근법

학습하세요 PVA 스폰지 이식 및 꼬리 피부 절제 모델을 사용하여 쥐의 급성 상처 치유를 평가하는 방법을. 이 기법은 세포 및 사이토카인 반응을 분석하여 당뇨병 등 복합 질환에서의 상처 치유 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

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