Name: Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 생쥐 해마에서 모세관과 소동맥을 분리하는 ex vivo 방법을 통해 혈관 신호 전달을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 주변 조직의 간섭 없이 뇌 미세순환을 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

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저자는 원고에 대한 통찰력있는 의견에 줄스 모린에게 감사드립니다. 이 연구는 CADASIL 함께 우리는 희망 비영리 단체, 여성 건강 및 연구 센터, NHLBI R01HL136636 (FD)에서 상에 의해 투자되었다.

모든 실험은 콜로라도 대학, 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 솔루션
<ol><li>해부를 위해 MOPS 버퍼링 식염수를 사용하고 시료를 사용 전에 4 °C로 유지하십시오. 용액을 가스로 사용하지 마십시오. 다음 조성으로 MOPS 완충 식염수 준비: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4,1 mM MgSO4,2.5 mM CaCl2,5 mM 포도당, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL 소 세루민, 30 mg/mL 소 세루민, 30 mg/mL 소 세루민 을 준비한다.</li>
	<li>인공 뇌척수액(aCSF)을 목욕 용액 및 파이펫 용액으로 사용하십시오. 가스 모두 ACSF 및 Ca2+-free aCSF 5% CO2,20% O2및 N2 균형. 다음 조성물로 용액을 준비: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,1.25 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2,4 mM 포도당, 2 mM CaCl2,pH 7.3 (5%CO2,20%O2,및 N2 균형).</li>
	<li>명목상 Ca2+-free aCSF (0 mM [Ca2 +]o, 5 mM EGTA)에서 최대 팽창을 가져옵니다.</li>
</ol>2. 장기 챔버 준비
<ol><li>보로실리케이트 유리 모세혈관(외부 직경 = 1.2 mm; 내경 = 0.69 mm; 길이 = 10cm)을 유리 풀러에 삽입합니다. 모세관을 당겨 한쪽 끝에 길고 얇은 팁을 만듭니다.</li>
	<li>챔버의 한쪽에, 용기를 발광하기 위해 소형 연동 펌프에 연결할 수있는 캐뉼라를 추가합니다. 해부 현미경으로 캐뉼라의 끝을 부러뜨려 관심있는 용기에 맞을 만큼 작지만 솔루션이 팁을 통해 흐를 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 팁의 직경이 약 10-15 μm인지 확인하십시오.</li>
	<li>산소 aCSF가 부착 된 0.22 μm 필터로 주사기를 사용하여 캐뉼라를 채웁니다. 캐뉼라에 기포나 이물질이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>챔버의 반대편에 두 개의 캐뉼라를 더 추가합니다. 그들의 팁을 깰하지 마십시오.</li>
</ol>3. 해마 해부 및 격리
<ol><li>마우스를 안락사시키고 참수한다. 이 실험에서는 8주된 C57BL6/J 마우스를 사용하여 남성과 여성의 차이를 비교합니다. 펜토바르비탈로 마우스를 주입하고 외과 용 가위로 참수하십시오.</li>
	<li>작은 해부 가위를 사용하여 머리 상단의 중간선을 따라 피부를 잘라냅니다. 스킨을 측면으로 이동합니다.</li>
	<li>두개골의 꼬리 쪽에서 시작하여 후각 전구에 도달 할 때까지 중간 선을 따라 두개골을 잘라냅니다. 뇌가 노출 될 때까지 두개골의 일부를 제거합니다.</li>
	<li>천천히 마우스의 코 근처에서 시작, 뇌를 제거합니다. 작은 해부 가위로 구조를 절단하여 후각 전구, 두개골 신경 및 척수에서 뇌를 분리하십시오.</li>
	<li>완전히 침수하기에 충분한 MOPS 용액으로 해부 판에 뇌를 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 뇌를 해부 판의 중앙에 놓고 복부 쪽을 아래를 향합니다.</li>
	<li>면도날을 사용하여 세로 균열을 따라 뇌를 반으로 자른다. 날카로운 모서리가 해부 판의 바닥과 평행하도록 블레이드를 잡습니다. 한 번의 스트로크로 뇌를 통해 블레이드를 누릅니다. 한 반구를 플레이트의 측면으로 이동합니다.</li>
	<li>각 반구에 대해 따로 또는 병렬로 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>중간선이 아래를 향할 수 있도록 플레이트 중앙에 반구 를 배치합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 횡방향 균열을 따라 절단하여 소뇌와 뇌간을 제거합니다. 블레이드를 티슈를 통해 똑바로 밀어 넣습니다.</li>
		<li>내측이 위를 향도록 반구를 회전시다(그림1A). 한 주걱을 사용하여 뇌를 제자리에 고정시다. 두 번째 주걱을 사용하여, 코퍼스 callosum 아래에 팁을 삽입하고 시상, 중격, 시상 하부를 제거하기 위해, 해마를 덮고(그림 1B).</li>
		<li>해마가 이제 대뇌의 후방 측 근처의 곡선 구조로 보이는지 확인하십시오. 한 주걱을 사용하여 뇌를 제자리에 고정하고 두 번째 주걱을 사용하여 해마를 대뇌에서 스쿱합니다(그림 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MOPS 용액으로 반쯤 채워진 새로운 해부 판으로 해마를 옮긴다. 뇌의 나머지 부분을 폐기하십시오.</li>
</ol>4. 하마 동맥 격리
<ol><li>각 해마에 대한 다음 단계를 완료합니다.<ol>
<li>섹션의 각 끝에 작은 핀을 사용하여 해마 중 하나를 핀 다운합니다. 해마 동맥이 위를 향하고 있습니다.</li>
		<li>매우 날카로운 집게를 사용하여 해마의 작은 부분을 부드럽게 스트레칭하십시오. 이것은 동맥을 둘러싼 조직을 풀어, 그(것)들을 해부하는 것을 쉽게 합니다.</li>
		<li>등쪽 해마 조직을 통해 검색하여 외부 횡방향 동맥을 식별한다(도1C)16,27.</li>
		<li>부드럽게 외부 횡방향 동맥을 잡고 천천히 해마의 CA3 영역을 정유 동맥과 모세 혈관을 수집하기 위해 조직에서 멀리 당겨.</li>
		<li>일단 조직에서 제거 될 더 이상 혈관이 없다면, 해마를 폐기하십시오. 사용하지 않는 동안 에는 용기를 얼음에 얼음에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 해포 모세관 - 자렌 성 동맥 통조림
<ol><li>모세 혈관으로 끝나는 가지가있는 동맥을 찾으십시오. 장기 챔버로 옮김을 옮김으로 옮김. 아테리올이 완전히 팽창할 때 약 15-30 μm인지 확인한다(도1D).</li>
	<li>조심스럽게 대상 영역 아래 의 동맥 벽을 통해 캐뉼라 팁을 밀어 혈관을 탑재. 넥타이를 묶을 수 있는 충분한 조직이 있을 때까지 용기를 캐뉼라 에 조심스럽게 밀어 놓습니다.</li>
	<li>12-0 나일론 봉합사로 느슨한 매듭을 만들어 혈관과 캐뉼라에 맞도록하십시오. 반 히치 매듭을 사용하여 동점을 확보하십시오. 그런 다음 끝을 당겨 매듭을 조이고 동맥을 캐뉼라에 고정시십시오. 끈 아래에 있는 불필요한 용기 가지를 집게로 부드럽게 당겨 제거합니다.</li>
	<li>다른 넥타이를 만들고 그것을 밀봉하기 위해 arteriole의 다른 쪽 끝에 고정합니다.</li>
	<li>챔버 바닥의 커버 슬립에 대해 평평해질 때까지 부착된 용기로 캐뉼라를 낮춥니다. 캐뉼라를 너무 많이 낮추지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>챔버의 반대편에 하나의 캐뉼라를 사용하여, 그것의 포인트가 arteriole의 끝에 넥타이를 고정되도록 그것을 낮춥시다.</li>
	<li>세 번째 캐뉼라를 사용하여 모세관 가지를 커버슬립에 고정합니다. 모세혈관의 끝을 노출된 채로 분기 의 끝에 가깝게 놓습니다(캐뉼라 아래가 아님).</li>
</ol>6. 압력 조영술
<ol><li>기록 소프트웨어로 해부 범위에서 현미경으로 챔버를 이동합니다.</li>
	<li>유입 및 유출 튜브를 챔버에 연결하여 관류를 확인합니다. 4 mL / min의 유량으로 가열 된 aCSF (37 °C)로 관류를 시작합니다.</li>
	<li>가압 캐뉼러를 압력 트랜스듀서와 페어링된 연동 펌프에 부착하고 내부 압력을 20mm Hg로 가져옵니다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 및 이미징 설정을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 구현합니다. 설정이 감지 소프트웨어에 최적화되면 레코딩을 시작합니다.</li>
	<li>에지 감지 소프트웨어로 동맥 직경을 기록하면서 용기의 압력을 최대 40mm Hg까지 높입니다.</li>
	<li>~15-20 분 동안 MOPS 용액을 aCSF로 챔버밖으로 씻어 내고 HiCaPA 가 균질 톤을 평형화하고 개발할 수 있도록하십시오.</li>
	<li>용기의 생존 가능성을 테스트하려면 1 μM NS309 용액을 목욕 관류에 적용하십시오(그림 2A, B 및 대표 결과 섹션 참조). 동맥 세그먼트는 앞서 설명한 대로 약 30-40% 근생 톤을 보여주는 팽창해야하며, 3,14,20.</li>
</ol>7. 모세 혈관 끝의 초점 자극
<ol><li>동맥에 대한 기준선이 확립되고 내피 기능이 평가되면 모세관 자극의 반응을 테스트하십시오.</li>
	<li>유리 풀러를 사용하여 한쪽 끝에 미세한 지점이 있도록 캐뉼라를 만듭니다. 테스트 된 약물이 5 psi에서 팁을 원활하게 통과 할 수 있도록 캐뉼라에서 팁을 끊습니다.</li>
	<li>관심있는 약물 용액으로 캐뉼라를 채우고 현미경에 부착 된 3 축 미세 조작체에 추가하십시오. 압력 배출 시스템에서 캐뉼라에 튜브를 연결합니다.</li>
	<li>캐뉼라를 모세 혈관 근처의 욕조로 천천히 내리고 챔버의 용기 나 하드웨어의 일부를 치지 않도록주의하십시오. 캐뉼라 끝을 건드리지 않고 모세혈관 끝 옆에 있는 캐뉼라 끝을 조종합니다. 캐뉼라가 누출되면 용기가 자극되지 않도록 캐뉼라 끝을 커버슬립에서 막아두십시오.</li>
	<li>모세 혈관을 자극 할 준비가되면 캐뉼라를 덮개 슬립과 모세 혈관 바로 옆에 낮춥습니다. 원하는 배출 시간(여기 20s)으로 압력 배출 시스템을 활성화합니다. 자극이 끝나면 추가 자극을 피하기 위해 캐뉼라를 약간 올립니다.</li>
	<li>필요에 따라 자극을 반복하십시오. 압력 배출 시스템 캐뉼라를 변경하여 다른 약물 화합물을 테스트합니다.</li>
	<li>모세 혈관만 자극되고 있는지 확인하려면 캐뉼라를 1 μM NS309 용액으로 채우고 위의 단계를 반복하십시오. 참고: 모세관 내피 세포는 NS309에 의해 활성화된K+ 채널을 발현하지 않으므로 아테리올은 자극에 반응하지 않아야 합니다. 동맥이 팽창하는 경우 캐뉼라를 재배치해야 하거나 구멍의 직경을 더 작아야 합니다(그림 2 A, B 및 대표 결과 섹션 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 원고에 기재된 가압 HiCaPA(해모세혈관-자영형 동맥) 제제는 중증 모낭 동맥 을 분리, 가압 및 연구하기 위한 당사의 잘 확립된 절차의 연장체이다29. 최근 뇌 모세관 내피 세포에서 Kir2.1 채널이 신경 활성화와 관련된 [K+]o에서 감각이 증가하고, 상류 동맥20을팽창시키는 오름차순 과극성 신호를 생성한다고 보고하였다. 모세 혈관에 대한 이전에 예기치 않은 역할을 밝히는 것은 부분적으로 피질 미세 순환20,21에서CaPA 준비를 개발함으로써 가능했습니다. 이 원고는 유사한 실험 적인 접근을 제시하지만 신경 혈관 커플링 동안 모세관 - 동맥 신호를 조사하기 위해 간단하고 재현 가능한 접근 방식을 설명하기 위해 마우스 뇌의 더 깊고 제한된 구조에서.
<p class="jove_conte...

뇌 표면의 pial 순환은 많은 연구의 대상이되었습니다, 부분적으로 때문에 실험 접근성. 그러나 대뇌 혈관 구조의 토폴로지는 뚜렷한 영역을 만듭니다. 혈류를 리디렉션하기위한 실질적인 용량을 가진 해부학이 풍부한 견고한 pial 네트워크와는 달리, 내측 중골 동맥 동맥 (PA)은 제한된 부수적 공급을 제시하며, 이들 각각은 신경 조직의 개별 부피를교배1,2. 이것은 독특한 생리적 특징3,4,5,6,7,8과결합하여 뇌혈류(CBF) 조절9,10을위한 중요한 부위로 뇌내 동맥을 만드는 혈류에 병목 현상 효과를 일으킨다. PA의 격리 및 통조림에 내재된 기술적 과제에도 불구하고, 지난 10년 동안 가압용기11,12,13,14,15,16,17을이용한 생체내 기능연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 관심증가에 대한 이유 중 하나는 뇌 기능성 충혈을 지지하는 기전인 신경혈관 커플링(NVC)에 대한 상당한 연구 노력이 수행된 것이다18.
지역적으로, CBF는 현지 신경 활성화19에따라 급속하게 증가할 수 있다. NVC를 제어하는 셀룰러 메커니즘 및 신호 특성은 불완전하게 이해됩니다. 그러나, 우리는 신경 활동을 감지하고 상류 동맥20,21,22를팽창시키기 위하여 과극화 전기 신호로 번역하는 NVC 도중 두뇌 모세혈관을 위한 이전에 예기치 않은 역할을 확인했습니다. 행동 전위23,24 및 성상 세포 종받에 큰 전도도Ca2+활성화 된 K+ (BK) 채널의 개방25,26 간질 칼륨 이온 농도 [K+]o,이는 모세 혈관내 혈관 내 내 정류기 K+ (Kir) 채널의 활성화를 초래한다. 이 채널은 외부 K+에 의해뿐만 아니라 과분극 자체에 의해 활성화됩니다. 갭 접합을 통해 확산, 과분극 전류는 근세포 이완 및 CBF 증가20,21원인 arteriole까지 인접한 모세관 내피 세포에서 재생. 이 기계장치의 연구 결과는 혈관 활성에이전트를 가진 모세관 자극 도중 동맥 직경을 측정하기 위하여 가압 모세관-parenchymal arteriole (CaPA) 준비를 개발하기 위하여 저희를 지도했습니다. CaPA 제제는 손상되지 않은 하류 모세관 파급 효과를 가진 굴절식 중계 동맥 분절로 구성됩니다. 모세관 끝은 마이크로피펫에 의해 챔버 유리 바닥에 압축되며, 이는 전체 혈관형성을 20,21로막고 안정화시킵니다.
우리는 이전에 쥐 편도체 13 및 해마16, 17에서마우스 피질20,21 및 동맥에서 CaPA 제제를 이미징하여 도구적 혁신을 이루었다. 해마 혈관구조는 병리학적 조건에 대한 감수성으로 인해 더 많은 관심을 받고 있기 때문에, 여기서 우리는 기능적 NVC 연구뿐만 아니라 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학에서도 사용할 수있는 마우스 해마 (HiCaPA)에서 CaPA 준비를위한 단계별 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22&마이크로; m 주사기 필터</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 나일론(12cm) 검은색</td><td>미세 수술 기구, Inc</td><td>S12-0 나일론</td><td></td></tr><tr><td>자동 온도 조절기</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 외경: 1.2mm, 내경: 0.68mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 & 드라이브 및 MS/CA가 있는 완전한 펌프 4-12 펌프 헤드</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - 샤프</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>인라인 워터 히터</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; 밀텍스&트레이드; 조직 겸</td>자 <td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 무수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 염산염</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - 세포 내 미세사출 디스펜스 시스템, 2채널</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프가 있는 압력 서보 컨트롤러</td><td>리빙 시스템 기기</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>초극세 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>수직 마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo 가압 해모골 모세관-parenchymal arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

미묘한 행동 변경에서 말기 치매에, 혈관 인식 손상은 전형적으로 대뇌 허혈 다음 발전합니다. 뇌졸중과 심장 마비는 현저하게 성적으로 이형질환이며, 둘 다 대뇌 허혈을 유발합니다. 그러나, 혈관 인지 장애를 이해 하 고 다음 성 별 치료를 개발에 진행, 기능 연구에서 마우스 모델에서 뇌 미세 순환을 조사에 의해 부분적으로 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌에서 전 생체 내 해모모세-자영-자영 아테리올(HiCaPA) 준비에서 모세관-아티올 신호신호를 검사하는 접근법을 제시한다. 우리는 모세관 자극에 응하여 동맥 직경을 측정하기 위하여 미세 순환을 분리, 통조림 및 가압하는 방법을 기술합니다. 우리는 HiCaPA 제제 무결성을 검증하고 신경 혈관 커플링 제로 칼륨을 테스트하고 Kir2 안쪽정류 칼륨 채널 패밀리, ML133의 최근 특징 억제제의 효과를 포함하여 전형적인 결과를 표시하는 데 사용할 수있는 적절한 기능 적 제어를 보여줍니다. 또한, 우리는 남성과 여성 마우스로부터 수득된 제제에서의 반응을 비교한다. 이러한 데이터는 기능적 조사를 반영하는 반면, 우리의 접근 방식은 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학 연구에서도 사용될 수 있습니다.

내피 소형 전도도 (SK) 및 중간 전도도 (IK) Ca2 +-민감한 K+ 채널은 PA의 직경에 경악영향을 미칩니다. 1 μM NS309의 목욕 적용, 합성 IK 및 SK 채널 작용제, 거의 최대 팽창 발생(그림 2A,B). 그러나, 모세관 내피 세포는 IK 및 SK 채널이 부족하고 NS30920에대한 반응으로 과분극화되지 않았다. 그 결과, 모세관을 자극하는 것은 초점 압력 배출(20s, 5 psi)에 의해 1 μM NS309로 끝나며 상류 동맥 팽창을 일으키지않았다(도 2A, B). 이러한 결과는 NS309가 HiCaPA 제제에서 동맥에 도달하지 못했고 압력 배출에 의해 모세혈관에 가해지는 화합물의 공간 적 제한을 평가하...

본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

우리의 방법은 그렇지 않으면 해마와 같은 Vivo에서 이미지하기 어려울 것이다 구조에 있는 혈관의 연구를 허용합니다. 혈관은 뇌 조직에서 제거되기 때문에 모세 혈관과 동맥 사이의 신호는 주변 조직에 대한 오프 타겟 효과없이 연구 할 수 있습니다. 해마를 분리하려면 작은 해부 가위를 사용하여 마우스 머리 상단의 중간선을 따라 피부를 자르고 피부를 측면으로 이동시합니다.두개골의 코달 측면에서 시작하여 후각 전구에 도달 할 때까지 중간선을 따라 두개골을 자르고 두개골이 노출 될 때까지 두개골의 일부를 제거하십시오. 마우스의 코 근처에서 시작하여 가위를 사용하여 후각 전구, 두개골 신경 및 척수를 잘라 내어 뇌를 천천히 제거합니다. 뇌를 침수하고, 복부 면을 MOPS 버퍼드 식염수, 해부 판의 중앙에 아래로 잠수하고, 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다.접시의 바닥에 평행날카로운 가장자리를 잡고, 한 스트로크에서 세로 균열을 따라 반으로 뇌를 잘라 면도날을 사용합니다. 중간선을 향한 접시 중앙에 한 반구를 놓고 소뇌와 뇌줄기를 제거하기 위해 횡방향 균열을 따라 조직을 통해 면도날을 똑바로 밀어 넣습니다. 내측이 위쪽을 향하고 있는지 반구를 회전시키고 주걱을 사용하여 뇌를 제자리에 고정시하십시오.코퍼스 캘로섬 아래에 두 번째 주걱 의 끝을 삽입, 해마에서 시상, 중격 및 시상 하부를 제거하기 위해 조직 아래에 특종. 해마는 이제 뇌의 후방 측면 근처의 곡선 구조로 볼 수 있어야합니다. 한 주걱을 사용하여 뇌막을 제자리에 고정시면 두 번째 주걱을 사용하여 뇌마를 자궁에서 내보냅니다.그런 다음 해마를 새로운 해부 판으로 옮기고, 신선한 MOP 용액으로 절반 정도 채워지도록 합니다. 해마 동맥 격리를 위해, 샘플 해마 동맥 측면을 위로 확보하기 위해 한 해마의 각 끝에 작은 핀을 배치합니다. 매우 날카로운 집게를 사용하여 해마의 작은 부분을 부드럽게 스트레칭하여 동맥을 둘러싼 조직을 풀어냅니다.그리고 외장 횡방향 동맥을 식별하기 위해 등쪽 해마 조직을 검색합니다. 동맥이 발견되면 해마에서 외부 횡단 동맥을 잡고 천천히 조직에서 당겨 동맥과 모세 혈관을 수집합니다. 각 해마의 동맥은 별도로 제거됩니다.더 이상 제거할 혈관이 없을 때, 얼음에 샘플을 놓고 나머지 해마 조직을 폐기하십시오. 동맥의 수조를 위해, 모세 혈관으로 끝나는 가지를 찾아 내고 동맥을 장기 챔버에 놓습니다. 조심스럽게 혈관을 장착하기 위해 대상 영역 아래 의 동맥 벽을 통해 캐뉼라 팁을 밀어.그런 다음, 조심스럽게 넥타이를 배치 할 수있는 충분한 조직이있을 때까지 캐뉼라에 혈관을 밀어. 12-0 나일론 봉합사를 사용하여 혈관과 캐뉼라에 맞는 느슨한 매듭을 만들고, 반 히치 매듭을 사용하여 넥타이를 고정하고, 끝을 당겨 매듭을 당겨 캐뉼라에 동맥을 고정하십시오. 아티리올의 다른 쪽 끝에 또 다른 넥타이를 고정하여 밀봉합니다.챔버의 반대편에, 캐뉼라의 지점이 동맥의 끝에 넥타이 아래로 핀 때까지 두 번째 캐뉼라를 낮춥다. 그런 다음 세 번째 캐뉼라를 사용하여 모세 혈관 가지를 표지 슬립에 고정하고 팁을 분기 의 끝 부분에 가깝게 두면서 모세 혈관의 끝이 노출됩니다. 뇌 미세 순환이 정교하게 깨지기 때문에, 동맥의 생존을 보장하기 위해 캐니레이션 절차 동안 혈관의 스트레칭과 처리를 최소화해야합니다.압력 myography 분석을 위해, 기록 소프트웨어와 함께 가벼운 현미경 단계로 챔버를 전송하고 풍부하기 위해 챔버에 유입 및 유출 튜브를 연결합니다. 분당 4밀리리터의 인공 뇌척수액37도로 증식을 시작하고 압력 트랜스듀서와 페어링된 연동 펌프에 가압 캐뉼라를 부착합니다. 내부 압력을 20밀리미터의 머큐리로 가져와 녹음 소프트웨어를 시작하십시오.현미경과 이미지 설정을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 구현합니다. 그리고 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 동맥이 완전히 팽창될 때 직경이 약 15~30 마이크로미터인지 확인합니다. 설정이 최적화되면 레코딩을 시작하고 선박의 내혈관 압력을 최대 40mm까지 늘리는 동시에 에지 감지 소프트웨어로 동맥 직경을 기록합니다.그런 다음 15~20분 동안 챔버를 사용하여 MOP 용액을 씻어낸다. 선박의 생존 가능성을 테스트하려면, 목욕 풍부에 하나의 마이크로 몰러 NS309 용액을 적용, 동맥 세그먼트는 30 ~ 40 %의 근생 톤을 시연, 팽창한다. 동맥의 기준선 톤이 확립되면 유리 풀러를 사용하여 한쪽 끝에 미세한 포인트로 캐뉼라를 만들고 집게를 사용하여 각 캐뉼라의 끝을 깨뜨려 관심있는 약물이 평방 인치 당 5 파운드의 압력으로 끝을 통해 원활하게 흐를 수 있습니다.관심의 약물캐뉼라를 채웁니다. 그리고 현미경에 부착 된 3 축 미세 조작기에 캐뉼라를로드합니다. 압력 배출 시스템에서 캐뉼라에 튜브를 연결하고, 혈관이나 챔버의 일부를 치지 않도록 주의하여 카누라를 모세혈관 근처의 욕조로 천천히 낮춥니다.모세 혈관을 자극하기 위해, 모세 혈관 바로 옆에 있는 커버슬립으로 캐뉼라를 낮추고 원하는 배출 시간으로 압력 배출 시스템을 활성화한다. 자극의 끝에서, 추가 자극을 피하기 위해 약간 캐뉼라를 올립니다. 모세혈관만 자극되고 있음을 확인하려면 새로운 캐뉼라를 NS309 용액의 1마이크로몰라로 채우고 모세혈관을 자극합니다.그런 다음 칼슘이 없는 용액으로 준비하여 최대 혈관 확장을 얻습니다. 1개의 마이크로몰러 NS309의 목욕 응용은 내피의 칼슘 에 민감한 칼륨 채널로 인해 동맥의 거의 최대 팽창을 일으킵니다. 모세관 내피 세포는 그러나 중간 및 소형 전도성 채널이 부족하고 고뇌에 대한 응답으로 과극화하지 않으며, 그 결과, 모세관을 NS309로 자극하고, 상류 동맥 팽창을 일으키지 않으며, 이는 NS309가 동맥에 도달하지 못했고, 이는 포세피라압력에 대한 접근조절으로 사용될 수 있음을 나타낸다.입증된 바와 같이 해마 모세관 당면 성동맥 제제를 사용하여, 모세관 끝에 10 밀리머 칼륨으로 보충된 인공 뇌척수액의 적용은 남성과 여성 마우스의 제제마다 다르지 않은 상류 동맥 팽창을 초래한다. 또한, Kir2 억제제 ML 133의 첨가는, 모세관 유도 된 동맥 팽창을 사실상 폐지하며, 남성과 여성 마우스 모두에서 준비시 10 밀리머 칼륨에 대응한다. 혈액 베셀을 장착할 때 혈관과의 직접적인 상호 작용을 제한하여 손상을 최소화하고 혈관의 생존 가능성을 높입니다.일단 혈관이 고립되면, 다른 약 화합물을 시험할 수 있고 혈관은 전골 생물학, 면역화학, 또는 전기생리학 연구를 위해 추가처리될 수 있다.

ex-vivo-pressurized-hippocampal-capillary-parenchymal-arteriole

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐의 대뇌 실질에서 내피관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 효소 분해와 기계적 해리의 조합을 통해 이 과정은 내피 세포가 있는 온전한 튜브를 생성합니다.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles(쥐 실질 세동맥에서 대뇌 내피관 준비)

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

이 원고는 압력 근조영술, 면역형광, 생화학 및 분자 연구에 사용하기 위해 생쥐로부터 뇌내 세동맥(실질 세동맥, 관통 세동맥 및 모세혈관 전 세동맥을 포함하는 혈관 그룹)을 분리하기 위한 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다.

분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

여기서 프로토콜은 미세 투석 시스템을 사용하여 깨어 있는 쥐의 해마에서 세포외액의 상세한 실시간 동적 샘플링을 제공합니다.

Microdialysis System을 사용한 의식이 있는 쥐의 해마 세포외 유체의 실시간 동적 수집

배우세요 생쥐 해마에서 모세관과 소동맥을 분리하는 ex vivo 방법을 통해 혈관 신호 전달을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 주변 조직의 간섭 없이 뇌 미세순환을 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

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