Name: 뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 학습하세요 췌도 분리 및 인과 피하 백색 지방 조직(ISWAT) 이식 기법을 이용한 제1형 당뇨병 치료 연구 방법입니다. 이 기법은 혈당 모니터링과 조직학 분석을 통해 이식 효과를 검증합니다.

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이 사업은 중국 의전사업(2017YFC1103704)의 국고병원 건립을 위한 특별기금(2019), 심천의학산명프로젝트(SZSM201412020), 고급기금의 보조금으로 지원되었다. 심천의 의료 분야 건설 (2016031638), 심천 과학 기술 재단 (JCJY2022229204849975, GJHZ2017031417135556), 심천 재단 건강 및 가족 계획위원회 (SZXJ20102111S222222 중국 광동성 과학 연구 재단 (A2019218), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M633218).

이 프로토콜의 모든 절차는 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회의 동물 복지 원칙을 따랐다. 아일렛 이식 수혜자 및 기증자는 광동성 의과 동물 센터에서 구입한 8-10주 된 C57BL/6 남성 마우스이었습니다. 수확된 세포의 수확, 분리, 배양, 또는 투여의 절차는 무균 조건에서 수행되었다.
1. 아일렛 준비
<ol><li>콜라게나아제 V 형 작동 용액을 준비하십시오. 콜라게나아제 V형을 계량하고 D-Hank의 버퍼로 1 mg/mL의 최종 농도로 용해하고, 0.22 μm 주사기 구동 필터 유닛과 60 mL 주사기를 사용하여 필터를 사용하여 얼음에서 미리 냉각합니다. 각 기증자 받는 사람에 대 한 5 mL의 볼륨이 필요 합니다.</li>
	<li>자궁 경부 탈구에 의해 10 주 된 C57BL / 6 남성 마우스 (23 ± 2g)를 안락사시키고 마우스의 외부 부분을 75 % 에탄올로 몇 초 동안 살포하십시오. 한편, 콜라게나제 용액으로 5 mL 주사기를 채우고 굴곡 무딘 뾰족한 관류 바늘 (32G)으로 주사기 바늘을 변경하십시오.</li>
	<li>해부 범위 아래 얼음 가방에 척추 위치에 기증자 마우스를 넣어, 음모 영역의 피부에 직선 뾰족한 안과 가위를 사용하여 횡개구를 잘라, 완전히 머리를 향해 피부를 절개. 그런 다음 음모 부위에서 xiphoid 과정으로 V 절개를 통해 복부를 완전히 엽니다.</li>
	<li>담낭과 간을 재배치하여 일반적인 담관의 전체 길이를 노출. 그런 다음 일반적인 담관의 십이지장 개구부를 혈관 클램프로 고정하고 담낭의 작은 개구부를 잘라냅니다. 참고: 최적의 바늘 배치는 간과 담낭으로의 역류를 방지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>1.2 단계에서 관류 바늘을 사용하여 담낭 개구부로부터 일반적인 담관을 캔울한 다음 췌장에 콜라게나아제 용액의 ~ 2 mL를 주입합니다. 그 후, 비침습적 마이크로트위즈 2쌍을 사용하여 내장, 위 및 비장에서 관류췌장을 분리하고 얼음 위에 50 mL 원엽 튜브에 넣습니다. 참고: 모든 기증자 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 연속적으로 관류된 3개의 췌장(40분 이상 떨어져 있지 않음)을 각 췌장에 대해 3 mL의 콜라게나아제 용액으로 미리 채워진 50 mL 원엽 튜브로 결합할 수 있습니다.</li>
	<li>췌장당 100 μL DNase I(10 mg/mL)를 50 mL 원엽 튜브에 넣고 37°C의 수조에서 췌장을 3-5분 동안 흔들어 소화합니다. 참고: 수조에서 소화되기 전에 조직을 분리하기 위해 10s 간격으로 튜브를 40배 격렬하게 흔들어 소화 중에 튜브를 적당히 흔들어 줍니다.</li>
	<li>최대 50 mL의 최종 부피까지 정지 용액(2.5 mg/mL BSA-HBSS 솔루션)을 추가하고 튜브를 4°C에서 750 x g의 속도로 펄스 원심분리하고 신속하게 중지합니다.</li>
	<li>상급을 붓고 BSA-HBSS의 15-25 mL에서 부드럽게 다시 중단하여 펠릿 2x를 씻으십시오. 펄스 원심분리기는 1.7 단계에서 1분 동안 설명한 것과 동일한 속도 조건을 가진 튜브를.</li>
	<li>상급을 붓고 3 개의 원엽 튜브의 펠릿을 50 mL 원점 튜브로 풀. 히스타크-1119의 총 부피 10 mL로 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 균일하게 혼합하고, 튜브의 측면을 따라 천천히 피펫팅하여 히스타크-1077 및 HBSS의 5 mL및 5 mL을 순차적으로 추가합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 시료를 4°C에서 750 x g에서 브레이크 없이 10분 동안 회전시다.</li>
	<li>HBSS/histopaque-1077 인터페이스에서 일회용 5mL 파스퇴르 파이펫을 사용하여 50mL 원소 튜브에 흡인하고, BSA-HBSS를 최종 부피 50mL에 추가하고, 4°C에서 750 x g의 펄스 원심분리기를 추가합니다.</li>
	<li>상급을 붓고 BSA-HBSS의 30 mL를 사용하여 섬을 씻으하십시오. 4 °C에서 750 x g에서 1 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>튜브 당 30 mL의 배양 배지 (10 % FBS-1 % P / S-CMRL-1066)를 사용하여 섬을 다시 중단하고 10cm 직경의 가벼운 단단한 배양 접시에 부어. 입체 현미경에서 200 μL 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 형태 (즉, 구형, 흰색)에 따라 용액에서 섬을 손으로 선택합니다. 10 mL의 배양 배지로 처리되지 않은 세포 배양 접시에 넣습니다. 참고 : 첫 번째 정제 된 작은 섬의 순도가 첫 번째 피킹 후 최적이 아닌 경우 두 번째 손 따기를 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>광 현미경으로 디티존 염색에 의해 엄선된 작은섬의 순도를 확인하고 형광 현미경으로 염색하는 플루오레세신 디아세테이트(FDA)-프로피듐 요오드화물(PI)에 의한 작은 섬의 생존 가능성을 감지합니다.</li>
	<li>이식 전 37°C에서 인큐베이터에서 배양배지(단계 1.13에서와 같이)에서 단리된 섬을 배양하고, 95% 공기-5%CO2를 배양하였다.</li>
</ol>2. ISWAT 아일렛 이식
<ol><li>연쇄상 구균 (STZ)의 단일 주입에 의해 8 주 된 남성 C57BL / 6 마우스 (22 ± 2g)에서 당뇨병을 유도합니다. 4일째에, 마우스를 ~4-6h에 빠르게 하고, 0.1 M 구연산염 완충제(pH 4.4)를 사용하여 2% STZ 용액을 준비한다. 무게를 달고, 버퍼에 다시 중단하고, 180 mg/kg의 용량으로 마우스를 복강 내 주사하십시오. 참고: STZ 솔루션은 사용 전에 신선하게 제조되어야 하며 빛 감도로 인해 알루미늄 호일로 덮여 있어야 합니다. 그것은 15-20 분 이내에 활동을 잃게되기 때문에 즉시 사용해야합니다.</li>
	<li>STZ-주입 마우스의 꼬리 정맥을 뚫어 1일 차 -1 및 0일의 약 10AM에 일부 혈액을 수집하고 시험 스트립 및 기본 혈당 모니터링 기구를 사용하여 비 공복 혈당 수준을 측정합니다. 마우스는 2회 연속 시험일의 혈당 수치가 둘 다 20 mmol/L 이상인 경우, 아일렛 이식 수용자로서 사용될 것이다.</li>
	<li>0일째에 모든 수령인 마우스의 무게를 측정하고 표시합니다. 각 수령인에게 60 mg/kg펜토바르비탈 나트륨을 심상으로 주입하여 마취시다. 참고 : 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락 핀치를 관리합니다. 수신자 마우스가 철수 반사가없는 경우, 마취의 수준은 수술에 충분하다. 그렇지 않은 경우, 추가로 10 mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 투여하십시오. 사용된 펜토바르비탈 나트륨은 2% 농도(m/v)의 농도에서 멸균 생리식염수로 희석하였다.</li>
	<li>-20 °C 냉동고에서 하이드로겔을 꺼내서 해동할 수 있도록 얼음에 보관하십시오. 하이드로겔은 4-10 °C의 액체이며 더 높은 온도에서 고화됩니다.</li>
	<li>각 수령인에 대해 ~450-500개의 염두 등가물(IEQ)을 스테레오현미경(단계 1.13)에서 멸균 된 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 200 μL의 배양 배지로 선택하고 이식 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>75% 에탄올을 사용하여 수령인의 왼쪽 인구 영역을 면봉합니다. 수술 테이프를 사용하여 척추 위치에 놓고 네 개의 팔다리를 고정시다. 전기 클리퍼로 수술 부위 주변의 머리카락을 면도하고 Iodophor로 부위를 면봉하십시오.</li>
	<li>안과 가위와 비 침습적 인 마이크로 트위즈를 사용하여이 부위의 수직 피부 절개를 만들고 ISWAT에서 열등한 상복부 동맥과 정맥을 식별하고 혈관 위에 작은 주머니를 만듭니다.</li>
	<li>200 x g에서 30s의 섬 튜브를 회전시키고 가능한 한 상류자를 제거하십시오. 완전히 해동 된 하이드로 겔의 20 μL을 흡입하고 섬과 튜브에로드합니다. 거품을 피하면서 섬을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>200 μL 파이펫 팁으로 수령인의 포켓(단계 2.7)에 튜브 내의 전체 아일렛 하이드로겔 혼합물을 전달한다. 참고 : 이 과정은 두 명의 기술자가 필요합니다, 하나는 비 침습적 마이크로 트위즈를 사용하여 주머니의 가장자리를 따기위한 하나, 다른 하나는 주머니에 섬 혼합물을 전달하기위한.</li>
	<li>아일렛 하이드로겔 혼합물이 완전히 고형화된 후 이식 부위에 20 μL (~5-10 mg)을 추가한 다음 5-0 수술 봉합사를 사용하여 연속 봉합법으로 근육과 피부를 닫습니다. 참고 : 하이드로 겔은 체온으로 인해 고화하기 위해 약 3 분이 필요합니다.</li>
	<li>수령인을 깨끗한 케이지에 넣고 열 패드를 사용하여 따뜻하게 유지합니다. 받는 사람이 완전히 복구되고 자율적으로 이동하기 시작할 때까지 모니터링을 유지합니다. 그런 다음 0.1 mg / Kg 용량에 따라 멸균 생리식염수로 0.03 mg / ml Buprenorphine을 복강 내 투여하십시오.</li>
	<li>각 받는 사람 마우스에 대해 2.3-2.11 단계를 반복합니다.</li>
	<li>수용인 마우스의 비단식 혈당 수치를 측정(단계 2.2에서와 같이) 첫 달 동안 일주일에 3-4회, 그 후 일주일에 1회.</li>
	<li>후속 (이식 후 100 일)의 끝에서, 마취하에 (단계 2.3에서와 같이 수행됨) 단계 2.6에 기재된 멸균 단계를 따라 수령인으로부터 이식편을 베어링하는 ISWAT를 절제한다. 인슐린과 글루카곤의 헤마톡신 및 에오신(H&E) 염색 및 면역형에 대한 조직학적 프로토콜에 따라 포르말린과 파라포름알데히드에서 조직을 고정합니다.</li>
	<li>세팔로스포린을 추가하고 2.10 단계에서와 같이 받는 사람의 절개를 닫은 다음 2.11 단계에서와 같이 회복을 준비하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.

췌장 췌도 이식은 T1DM을 치료하는 유망한 치료법입니다. 이 치료의 효과는 많은 요인에 의해 영향을 받고 아일렛 이식을위한 최적의 부위를 선택하는 것은 매우 중요합니다. 아일렛 이식에 대한 이상적인 해부학 적 부위는 다음과 같은 특성을 가져야합니다 : 간단한 이식, 생검 및 이식 편이식 검색 절차에 대한 접근성; 감소 합병증; 혈액 포도 당 제어의 높은 성공률; 및 섬 이식편15,16의장기 생존.
우리 팀은 이전에 뮤린 모델17에서오멘텀에서 의식을 이식하기 위한 프로토콜을 기술했다. omentum에서, 일반적인 혈액 포도당은 신장 캡슐의 밑에 섬 이식에 비교된 나중에 달성되었습니다. 그 결과, 섬을 이식하기위한 다른 사이트를 탐구했다.
ISWAT는 간에서 이식에 비해 수령인의 고혈당...

국제 당뇨병 연맹 (IDF)1의통계 데이터에 따르면 타입-1 당뇨병 (T1DM)의 세계적인 부각 그리고 보급은 급속하게 상승하고 있습니다. 아일렛 이식은 T1DM4를 치료하기위한 가장 유망한 접근 법 중 하나입니다. 에드먼튼 프로토콜2를 이용한 임상 섬 이식에서 큰 돌파구가 보고된 이후, 5년 후 T1DM 수혜자에서 기능하는 섬 이식 생존은 이제 약 50%3에도달한다.
과거에는 간, 신장 캡슐, 비장, 근육 내 부위, 피하 공간, 골수 및 오멘탈 파우치와 같은 여러 이식 부위가 실험적인 췌도이식을위해 탐구되었다5,6,7. 위의 사이트 중 일부는 임상 설정에서 테스트 되었습니다8. 췌도 이식은 현재9에서임상 적용에서 가장 널리 사용되는 방법으로 남아 있지만,이 사이트를 사용할 때 해결해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 예를 들어, 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)과 가난한 산소화공급(10,11)에 의해 야기된 이식된 작은 섬들의 조기 손실을 감소시키는 방법및필요한 경우 췌도 이식편을 회수하는 방법, 그들은 간에서 확산되기 때문에. 신장 캡슐 설치류 수용자에 대 한 이상적인 사이트 수 있습니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 인간에서 충분한 동종 아일렛의 이식을 제한하지만, 고도로 정제된 돼지 섬 제제로 인해 아일트종이식에 더 적합할 수 있지만 임상적으로5,12. 따라서, 아일렛 이식에 적합한 부위에 대한 탐색이 진행되고 있다.
피하 공간은 접근성으로 인해 아일렛 이식에 임상적으로 적용 가능한 부위로서 사용될 수 있다. 그러나, 피하 공간으로의 섬 이식의 효율은 매우 낮으며, 따라서고혈당증(13)을역전시키기 위해 상대적으로 많은 수의 섬을 필요로 한다. 최근 일본의 한 연구팀은간(14)과비교했을 때 뮤린 모델에서 췌도 이식에 우수한 새로운 피하 부위인 ISWAT를 발견했다. ISWAT는 상복부 동맥과 정맥을 포함하므로 풍부한 혈액 공급은 아일렛 이식편 재혈관화를 보장 할 수 있습니다. 이 원고에서는 ISWAT에서 합성 뮤린 섬을 고정하기 위해 지하 막 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 쉬운 이식 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 아일렛 이식에 효과적임을 증명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m 주사기 구동 필터 유닛</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심 분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 파스퇴르 피펫</td><td>JingAn Biological, 중국</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td>Szboon, 중국</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 외과 봉합사</td><td>sh-Jinhuan, 중국</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 주사기</td><td>Szboon, 중국</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>75% 에탄올</td><td>LIRCON, 중국</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스 IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>희석 (1:200)</td></tr><tr><td>안티 마우스 글루카곤 항체</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>희석 (1:100)</td></tr><tr><td>안티 마우스 인슐린 항체</td><td>세포 Signaling Technology</td><td>3014s</td><td>Dilution (1:100)</td></tr><tr><td>뭉툭한 관류 바늘</td><td>Oloey, China</td><td>005</td><td>32G, 노란색</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune, 중국</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 광</td><td>동성</td><td></td> 생쥐 의료 동물 센터 <td>8~10주</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>BIOFIL, 중국</td><td>TCD000100</td><td>일반, 비처리, 직경 87.8mm</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>세팔로스포린</td><td>루캉 의료, 중국</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>코도스 애완 동물 클리퍼</td><td>슈코도스, 중국</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 V형</td><td>시그마</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-hank's buffer</td><td>Coolaber, 중국</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>디티존</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>에오신 염색 매체</td><td>Beyotime Biotech, 중국</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>fluorescein diacetate (FDA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 피펫 팁</td><td>Corning</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>헤마톡실린 염색 매체</td><td>세포 신호 기술</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>시그마-알드리치</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>하이드로겔</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>지하 멤브레인 매트릭스</td></tr><tr><td>요오도퍼</td><td>LIRCON, 중국</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>광밀폐 배양 접시</td><td>DVS, 중국</td><td>AN-5058548</td><td>자체 제작, 검은 페인트</td></tr><tr><td>스프레이 유리 접시 의료 접착 테이프</td><td>Cofoe, 중국</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>비침습적 마이크로핀셋</td><td>RWD Life Science</td><td>F11033-11 및 F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>원터치 초경량 기본 혈당 모니터링 시스템</td><td>Johnson & Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>안과 가위</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S12012-12 및 S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P / S (페니실린 / 스트렙토 마이신)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>펜토 바르비탈 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>요오드 프로 피듐</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (스트렙토 조토신)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>테스트 스트립</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 활용 염소 안티 토끼 IgG(H+L)</td><td>proteintech</td><td>SA00007-2</td><td>희석(1:200)</td></tr><tr><td>혈관 클램프</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (iswat) 이식 모형

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

췌도 이식은 타입-1 당뇨병을 위한 잘 확립된 치료 처리입니다. 신장 캡슐은 설치류 모형에 있는 아일레 이식을 위해 일반적으로 이용되는 사이트입니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 큰 동물 및 인간에 있는 충분한 작은 작은 것의 이식을 제한합니다. 새로운 피하 공간인 인큐니얼 피하 백색 지방 조직(ISWAT)은 저도 이식에 잠재적으로 귀중한 부위인 것으로 나타났습니다. 이 사이트는 다른 피하 공간보다 더 나은 혈액 공급이 있습니다. 더욱이, ISWAT는 신장 캡슐보다 더 큰 작은 덩어리를 수용하고, 그것으로 이식하는 것은 간단하다. 이 원고는 합성 당뇨병 마우스 수용자의 ISWAT 부위에서 마우스 췌도 격리 및 이식의 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 뮤린 췌도는 표준 콜라게나아제 소화에 의해 분리되었고 지하 막 매트릭스 하이드로겔은 ISWAT 부위에서 정제된 섬을 고정하는데 사용되었다. 수용자 마우스의 혈당 수준을 100일 이상 모니터링하였다. 아일렛 이식편은 조직학적 분석을 위해 이식 후 100일째에 회수되었다. 이 원고에 설명된 ISWAT 사이트에서 의정서는 간단하고 효과적이다.

이 프로토콜에는 두 가지 절차가 도입됩니다: 뮤린 아일렛 제제 및 ISWAT 부위에 의한 아일렛 이식. 첫 번째 절차에서, 타입 V 콜라게나아제 용액으로 정독 및 소화한 후, 히스타크-1119 및 히스타크-1077및 추가의 손 따기 단계로 정화한 후, 분리된 뮤린 섬은 이식에 충분히 순수할 것이다(도 1에도시된 바와 같이) 및 높은 생존율을 가지는 고립된 섬이 이식에 사용될 것이다(도 2에도시된 바와 같이). 두 번째 절차에서는 STZ 화학 물질을 가진 당뇨병 유도가 중요합니다. STZ의 최적 복용량은 마우스 긴장및 나이에 달려 있고, 당뇨병의 성공적인 유도는 2 일 연속에 동시에 16.7 mmol/L 이상의 비 빠른 혈액 포도당 수준에 의해 정의됩니다. 당뇨병 마우스는 몇 주 동안 췌도 이식없이 살아남을 수 있습니다. ISWAT 부위로 이식되기 전에 아일렛 이식편을 하이드로겔과 완전히 혼합해야 하며, IWSAT에 이식이 ...

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

아슬렛 이식은 타입-I 당뇨병 을 치료하기위한 가장 유망한 접근 중 하나입니다. 그리고 아일렛 이식에 적합한 부위에 대한 검색이 진행 중입니다. 유상증자 백색 지방 조직에 대한 아슬렛 이식은 임상적 영향을 미칠 수 있는 간단하면서도 효과적인 방법입니다.클리닉에이 절차의 외삽은 타입 I 당뇨병 환자에 대한 치료의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 언어가 islet 이식에 이상적인 사이트가 아니라고 결정되었기 때문에 임상 적 이식에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 절차의 모든 단계, 특히 췌장 소화와 같은 주요 단계를 신중하게 따르는 것이 중요합니다.시각적 데모는 이 기술을 새로 접한 연구원들이 이 슬레치 격리 및 변환을 수행하는 방법을 더 잘 결정하는 데 도움이 됩니다. 아슬렛 수확을 위해 먼저 10주 된 C57 블랙 6 마우스의 털을 75%에탄올로 분사하고, 갓 준비된 콜라게나제 용액으로 5밀리리터 주사기를 채웁니다. 주사기를 32게이지 굽힘 무딘 뾰족한 관류 바늘로 장착하고, 얼음 가방에 마우스를 척추 위치에 놓습니다.직선 뾰족한 안과 가위를 사용하여 음모 부위의 피부에 횡단 개방을 하고 동물의 머리를 향해 절개를 확장하십시오. 음모 부위에서 xiphoid 과정에 V 절개를 통해 복부를 완전히 열고 간을 움직여 담낭과 일반적인 담관의 전체 길이를 노출시합니다. 그런 다음 혈관 클램프를 사용하여 일반적인 담관의 십이지장 개구부를 닫고 담낭의 작은 개구부를 자른다.이전에 준비된 관류 바늘로 개구부를 통해 일반적인 담관을 캔누레이하고, 췌장에 콜라게나아제 용액의 약 2밀리리터를 주입한다. 모든 콜라게나아제가 전달되면 두 쌍의 비침습적 마이크로 핀셋을 사용하여 내장, 위 및 비장에서 퍼프드 췌장을 분리하고 췌장을 얼음 위에 50 밀리리터 원원 튜브에 넣습니다. 모든 샘플을 채취하면 췌장당 100마이크로리터를 췌장당 100마이크로리터를 50밀리리터 튜브에 넣고 10초 동안 각 튜브를 약 40회 흔들어 적당한 흔들림으로 3~5분 동안 3~5분간 수수 욕조에 넣습니다.인큐베이션이 끝나면 소화를 막기 위해 50밀리리터의 최종 볼륨을 추가합니다. 그리고 펄스 원심 분리는 신속하게 원심 분리기를 중지하기 전에 4 섭씨에서 750 배 G의 속도로 튜브를 원심 분리합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, 펠릿을 15~25밀리리터의 스톱 액액을 세척당 2회 세척한 후 동일한 원심분리 조건에서 세척합니다.두 번째 세척 후 튜브 당 3 개의 펠릿을 새로운 50 밀리리터 원내 튜브로 당기십시오. 그리고 히토파크 1119의 총 10 밀리리터의 부피에서 췌장 세포를 다시 중단한다. 다음으로 각 튜브의 측면에 히토파크 1077의 5 밀리리터를 조심스럽게 추가하고 HBSS의 5 밀리리터가 뒤따릅니다.세포를 원심분리로 분리하고 5밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HBSS Histopaque 1077 인터페이스에서 섬을 수집합니다. 펄스 원심분리를 위한 스톱 솔루션 50밀리리터의 최종 부피로 새로운 50밀리리터 원모형 원적 튜브에 섬을 풀로 붙이고, 상체를 폐기한다. 1분 원심분리를 위해 30밀리리터의 신선한 스톱 솔루션으로 펠릿을 재중단하고, 30밀리리터의 배양 배지에서 섬을 재보설한다.섬을 튜브 당 10센티미터 의 가벼운 문화 접시에 넣습니다. 그리고 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 200 마이크로리터 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 용액에서 흰색 스페로이드 섬을 손으로 선택합니다.섬들을 수확할 때 배양 배지 10밀리리터를 함유한 처리되지 않은 세포 배양 접시에 넣습니다. 가벼운 현미경으로 염색하는 디티존에 의해 손으로 수확한 섬의 순도를 확인하십시오. 그리고 형광제 제비에 의해 섬의 생존가능성을 검출하여 유안증이 플로리스트 현미경으로 염색한다.그런 다음 분리된 섬을 신선한 배양 배지에서 섭씨 37도에서 95%의 공기와 이식전까지 이산화탄소 5%로 배양합니다. 당뇨병 유도 후 3일과 4일을 시작으로, 각 연쇄상 조토신 주입 8주 된 남성 C57 블랙 6 마우스의 소달 정맥을 10:00 a.m 주위로 천자합니다.기본 혈당 모니터링 기구를 사용하여 각 마우스의 비 금식 혈액 포도당 수준을 결정한 다음 개별 검사 스트립에 혈액을 추가하십시오. 동물이 이틀 연속 리터당 적어도 20 밀리몰의 혈당 수준을 입증했을 때, 계량 및 수신자 마우스를 표시하고 마취 된 동물의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 해빙을 위해 얼음위에 영하 20도의 하이드로겔을 보관합니다.그리고 수용자당 450~500개의 섬 등가물을 얼음에 튜브당 200마이크로리터를 함유한 멸균 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다. 75%에탄올로 받는 사람의 왼쪽 잉구영역을 스와브하고 마우스를 스핀 위치에 놓습니다. 수술 용 테이프로 팔다리를 고정하고 클리퍼를 사용하여 수술 부위 주변의 머리카락을 제거하십시오.요오도프터로 수술 부위를 면봉하고 소독된 피부에 수직 절개를 합니다. ISWAT 내의 열등한 상복부 동맥과 정맥을 식별하고 혈관 위에 작은 주머니를 만듭니다. 원심분리에 의해 섬의 퇴적물을 제거하고 가능한 한 많은 상퍼를 제거하십시오.각 튜브에 해동 된 하이드로겔 20 마이크로 리터를 추가하고 거품을 피하기 위해 섬을 부드럽게 다시 중단합니다. 균질현탁액이 얻어지면 200마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 한 튜브에서 전체 슬레톤 하이드로겔 혼합물을 주머니에 조심스럽게 전달한다. 하이드로겔이 완전히 고화되면 이식 부위에 세팔로스포린 20 마이크로리터를 추가하고 5-0 연속 수술 봉합사로 근육과 피부를 닫습니다.그런 다음 수신자를 완전한 재조정이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 열 패드의 깨끗한 케이지에 넣습니다. 뮤린 섬 처리 후 입증 된 바와 같이, 고립 된 뮤린 섬은 이식을 위해 충분히 순수할 것이다. 생존가능성이 높은 고립된 섬만 이식에 사용해야 합니다.하이드로겔과 함께 이목 이식편을 철저히 혼합한 후, 이식편은 ISWAT 부위에 이식될 수 있다. ISWAT로 이식한 지 약 1개월 후, 아슬렛 이식편은 고혈당증을 역으로 바꾸고 받는 마우스의 체중이 점차 증가한다. 이식 후 100일 후에 이식편을 제거하면 10:00 a.m 즉시 증가합니다.비 금식 혈액 포도 당 수준. 이 시점에서 조직학적 분석은, 이 슬레그래프가 그대로 남아 있음을 보여준다. 그리고 인슐린과 글루카곤 면역형광염색은 이식된 섬도 이식 후 100일 후에 기능한다는 것을 나타낸다.숙련 된 췌장 세포를 너무 강하게 흔들지 않도록주의하거나 얻어진 섬의 능력이 손상됩니다. 격리된 섬은 현장에서 분리된 이식의 효과를 현장에서 잉게인 피하 백색 지방 조직으로 비교하기 위해 신장 캡슐 하에서 이식될 수 있다. 절차는 간 외에 다른 사이트에 islet 이식의 임상 시험의 개시를 추가할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

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흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

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본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

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[18F]FDG 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 마우스의 갈색 및 베이지 지방 조직의 시각화 및 정량화

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CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사

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조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기에서 우리는 당뇨병 및 비만 BTBR 마우스의 신장 기능을 개선하면서 난임, 비만 및 고혈당증을 역전시키는 유망한 전략을 제공하는 흰색 및 갈색 지방 조직 이식 프로토콜을 제시합니다.

백색 및 갈색 지방 이식편: 흑색 및 황갈색 완장(BTBR) 비만 마우스의 생식, 대사 및 신장 결핍을 교정하기 위한 접근 방식

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뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

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