Name: 원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 생후 마우스 대뇌피질에서 성상세포와 미세아교세포를 동시에 분리하고 배양하는 방법을. Trypanosoma cruzi와 Toxoplasma gondii 등 원생동물 기생충 감염 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 mAb 2C2 안티 Ssp-4에 대한 상파울루 연방 대학 (UNIFESP)에서 교수 레나토 A. Mortara에게 감사드립니다. 이 작품은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Grant 2017/25942-0 to K.R.B.), 콘셀호 나시오날 데센볼비멘토 Científico e Tecnológico (CNPq, 부여 402100/2016-6 에 K.R.B.), 인스티투토 나시오날 드 시엔시아 e 테크놀로지아 드 바시나스 (INCTV/CNPq) 및 쿠르데나카오 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어 (CAPES, 금융 코드 001). M.P.A.는 CNPq로부터 펠로우십을 받고, A.L.O.P.는 CAPES로부터 펠로우십을 받고, I.S.F와 L.Z.M.F.B.는 FAPESP로부터 펠로우십을 받는다.

마우스를 관련시키는 모든 실험 절차는 브라질 국가 법에 따라 수행되었다 (11.794/2008) 상파울루 연방 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 (UNIFESP).
1. 신경교 세포 추출, 유지 보수 및 해리
참고: 신경교 세포 추출에 사용되는 마우스의 수는 원하는 실험을 수행하는 데 필요한 세포의 양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서, 총 2.7 x 107 성상 세포 및 4 x 106 마이크로 글리아 6 개의 신생아 C57BL/6 마우스로부터 수득하였다. 모든 절차는 클래스 II 생체 안전 성 캐비닛에서 멸균 조건하에서 수행되었다.
<ol><li>1일차
	<ol>
<li>순수 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 및 HBSS + 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS)의 10 %를 준비하십시오 (재료 표참조).</li>
		<li>보충 된 덜베코의 변형 독수리 매체 (DMEM)/F12 (10 % FBS + 0.08 mM 페니실린 + 0.09 mM Streptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mM 중탄산나트륨, pH Table of Materials7.2)을 준비하고 0.22 μm 필터로 여과하십시오(표 참조). 참고: 모든 배양 배지는 4°C에서 보관해야 하지만 실험을 시작하기 전에 37°C에서 20분 동안 미리 데워야 합니다.</li>
		<li>오토클레이브에서 모든 수술 기구(가위, 주걱 및 핀셋)를 살균하고 시술 중에 70% 에탄올을 사용하십시오.</li>
		<li>신생아 (최대 3 일 된) 마우스를 심도 마취를 위해 이소플루란으로 적신 면이 들어있는 밀봉 된 챔버에 5 분 동안 넣습니다.</li>
		<li>마우스 새끼에게 70% 에탄올을 뿌리고 가위로 동물을 참수합니다.</li>
		<li>두개골을 따라 가위로 시상 절단 (앞쪽 후방)을 열어 뇌를 노출시십시오. 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 분리하십시오. 두뇌 무결성을 유지하기 위해 마이크로 주걱을 사용하여 뇌를 제거하십시오.</li>
		<li>마른 페트리 접시 (직경 6cm)에 뇌를 놓습니다. 마이크로 주걱을 사용하여 후각 전구와 소뇌를 제거합니다. 피질을 HBSS + 10% FBS(2 mL/페트리 접시)를 포함하는 다른 페트리 접시(직경 6cm)로 옮니다.</li>
		<li>멸균 가위로 작은 조각으로 뇌 조직을 잘라 다른 15 mL 원엽 튜브에 HBSS + 10 % FBS로 각 뇌 조직을 전송 p1000 마이크로 파이펫을 사용하여. 최종 볼륨이 2 mL/튜브인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 HBSS + 10% FBS로 완성하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 그렇다면, CNS 조직을 가진 원엽 관은 1 시간까지 얼음에 두어야합니다.</li>
		<li>HBSS + 10 % FBS (튜브 당) 및 데넌트 후 3 mL로 절단 된 뇌 조직을 씻으십시오. 조심스럽게 장식품을 제거하십시오. 이 단계를 3번 반복합니다. 참고 :이 단계는 파편을 제거하고 추출 된 조직을 복구하는 것을 목표로합니다.</li>
		<li>절단 된 뇌 조직을 순수한 HBSS (튜브 당) 3 mL로 씻고 데넌트 후 조심스럽게 상류자를 제거하십시오. 이 단계를 3번 반복합니다. 참고: 이 단계는 세포가 다음 단계에서 트립시네이드되기 때문에 이전 세마에서 나머지 혈청을 제거하는 것을 목표로합니다.</li>
		<li>튜브 당 트립신 3 mL을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 수조에 놓고 5 분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 튜브를 반전하거나 갑자기 혼합하여 거품을 피하십시오. 참고 : 이 단계는 수집 된 조직을 소화하는 것을 목표로합니다.</li>
		<li>트립신을 비활성화하려면 HBSS + 10 % FBS 튜브 당 3 mL로 조직을 씻고 조직의 데내디션 후 상류를 조심스럽게 제거하십시오. 이 단계를 3번 반복합니다.</li>
		<li>순수한 HBSS 튜브 당 3 mL로 조직을 씻고 조심스럽게 상류제를 제거하십시오. 이 단계를 2번 반복합니다.</li>
		<li>순수 HBSS 튜브 당 7 mL을 추가하고 파이펫의 연속통로를 통해 조직을 균질화하십시오 : 먼저 10 mL 의 혈청학적 파이펫을, 5 mL 다음에 마지막으로 p1000 마이크로 파이펫으로.</li>
		<li>균질화 후, 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리튜브.</li>
		<li>상급을 버리고 튜브 당 4 mL + 10 % FBS로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>최적의 세포 배양 접착을 위해 전처리된 T-75 플라스크로 세포를 이송합니다(재료 표참조). 참고: 플라스크당 각 동물의 조직을 처리합니다.</li>
		<li>플라스크를 인큐베이터에 37°C, 5%CO2를 30분 동안 인큐베이터에 놓습니다.</li>
		<li>플라스크당 10 mL의 DMEM/F12를 추가하고 37°C 및 5%CO2에서배양합니다. 참고: 최종 볼륨은 플라스크당 14mL입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3일차
	<ol>
<li>T-75 플라스크에서 배양 배지 7 mL를 제거하고 신선한 보충제 DMEM/F12 7 mL을 추가합니다. 참고: 플라스크에는 많은 세포 파편과 흐린 모양이 포함됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제 5일
	<ol>
<li>T-75 플라스크에서 모든 배지를 제거하고 신선한 보충제 DMEM/F12 14 mL를 추가합니다. 참고: 배지는 플라스크에서 대체되어 이물질과 부착되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
		<li>각 48 시간 후, 상급의 6 mL을 제거하고 문화의 14 일까지 신선한 보충 DMEM / F12 매체의 7 mL을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제 14일
	<ol>
<li>상급체 6 mL을 제거하고 신선한 보충 DMEM / F12 매체 7 mL를 추가 한 후 T-75 플라스크를 단단히 닫습니다.</li>
		<li>층궤도 셰이커를 200 rpm 및 37°C에서 하룻밤 동안 점성술로부터 기계적으로 미세글리아를 해리시다.</li>
	</ol></li>
	<li>제 15일
	<ol><li>셰이커에서 플라스크를 가져 와서 세포 해리를 최적화하고 최대 수의 마이크로 글리아를 수확하기 위해 자신의 매체로 적극적으로 씻으십시오. 이어서, 상급체(마이크로글리아 함유)를 수집하고 50 mL 원엽 관으로 옮김을 전달한다.</li>
		<li>다음으로, 각 플라스크에 4 mL의 트립신을 넣고 성상 세포체를 분리하기 위해 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>트립신을 비활성화하기 위해 보충된 DMEM/F12 플라스크당 5 mL를 추가합니다. 플라스크를 자체 매체로 세척하고 내용물 50mL 원추형 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 직접 세척합니다.</li>
		<li>4°C에서 5분 동안 450 x g에서 해리된 미세글리아 및 성상세포를 함유하는 모든 튜브를 원심분리기.</li>
		<li>상급제는 버리십시오. 1 mL에 있는 microglia 펠릿및 보충된 DMEM/F12의 10 mL에 있는 성상 세포에 다시 중단하십시오.</li>
		<li>Neubauer 챔버 또는 자동 셀 카운터에서 세포 계수로 진행합니다. 적절한 평평한 바닥 세포 배양 플레이트에서 원하는 밀도로 보충 된 DMEM / F12로 세포를 플레이트 (최적의 세포 부착을 위해 전처리; 재료 표참조). 37°C에서 세포를 배양하고 24시간 동안 5%CO2를 부착할 수 있도록 하였다. 참고 : 유세포 측정에 의한 순도를 확인하기 위해 각 세포 집단의 1.5 x 106을 예약하십시오.</li>
		<li>유세포 분석분석을 수행하여 세포 집단의 순도를 확인합니다. 참고 : 우리는 microglia CD11b+/ CD45+/ GFAP- 및 성상 세포 CD11b-/ CD45-/ GFAP+. Iba1 및 TMEM119 염색은마이크로글리아(22)를완전히 특성화하기 위해 고려될 수 있다.</li>
		<li>유세포분석법의 대조군으로서 각 세포 집단(성상세포 및 마이크로글리아)에 대해 FMO(형광 마이너스 원)23 및 비염색 샘플을 첨가한다.</li>
		<li>각 세포 집단에 대해, 스테인드 및 스테인드되지 않은 각 샘플에 대해 5 x 105 세포를 예약하십시오. FMO의 경우, 각각 2.5 x 105 세포를 포함하는 마이크로 글리아의 두 개의 다른 튜브를 예약하고 또한 5 x 105 성상 세포의 또 다른 튜브를 예약합니다. 참고: 마이크로글리아 숫자는 제한 요인이 될 수 있으므로 스테인드 및 FMO 컨트롤에 더 적은 셀을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>4 °C에서 5 분 동안 450 x g의 모든 마이크로 튜브를 원심 분리기. 상급체를 버리고 FACS 버퍼의 500 μL/마이크로튜브(인산완충식염수(PBS) + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2)로 펠릿을 다시 중단한다.</li>
		<li>4°C에서 450 x g의 모든 마이크로튜브를 450 x g에서 5분 동안 폐기하고 FACS 버퍼에서 희석된 100 μL/마이크로튜브의 안티 CD16/CD32(클론 93)로 펠릿을 다시 놓습니다. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>FACS 버퍼 500 μL/마이크로튜브를 모든 마이크로튜브와 원심분리기에 넣고 4°C에서 450 x g에서 5분 간 버금전을 버리십시오. 표면 마커 믹스의 50 μL / 마이크로 튜브와 성상 세포 FMO 튜브를 다시 일시 중단 : 안티 CD45 (PE, 클론 30-F11) 및 안티 CD11b (eFluor 450, 클론 M1/70) (둘 다 에서 희석 1 : 100 FACS 버퍼에서).</li>
		<li>스테인드되지 않은 셀의 경우 동일한 양의 FACS 버퍼로 다시 일시 중단합니다. microglia FMO의 경우, 각 마이크로글리아 튜브를 안티 CD45 또는 반대로 CD11b로 배양합니다.</li>
		<li>마이크로튜브당 FACS 버퍼 500 μL을 추가합니다. 450 x g에서 450 x g에서 5 분 동안 5 분 동안 상급물질을 버리고 100 μL / 마이크로 튜브의 고정 버퍼 (재료 표 참조)로 펠렛을 재중단하십시오 (재료 표참조) 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안.</li>
		<li>500 μL/마이크로튜브의 투과 버퍼를 1x(재료 표참조)를 넣고 어둠 속에서 5분 동안 4°C에서 배양합니다.</li>
		<li>4°C에서 450 x g의 모든 마이크로튜브를 5분 동안 원심분리기. 1x 투과성 완충액에서 1:100 희석에서 세포내 항체 항체 항체 의 50 μL/마이크로튜브를 가진 성상 세포 및 마이크로글리아 염색 튜브 및 또한 마이크로글리아 FMO 튜브를 재중단. 스테인드되지 않은 세포와 성상 세포 FMO의 경우 FACS 버퍼가 동일한 부피로 셀을 다시 일시 중단합니다. 모든 샘플을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>1x 투과 완충액의 500 μL/마이크로튜브를 추가하여 모든 튜브를 세척합니다. 4 °C에서 5 분 동안 450 x g의모든 마이크로 튜브를 원심 분리합니다. FACS 버퍼의 200 μL에서 각 마이크로튜브를 다시 일시 중단합니다. 유세포계에서 1 x 105 이벤트/샘플을 수집합니다.</li>
		<li>분석을 위해 세포는 CD11b x CD45에서 먼저 게이트한 다음 GFAP 히스토그램에 대해 문의해야 합니다. 참고: 얼룩이 없고 FMO 컨트롤은 게이트를 결정하는 데 유용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 감염율의 감염 및 평가
<ol><li>T. 곤디와 신경교 세포의 감염
	<ol>
<li>플레이트 3 x 104 마이크로글리아 또는 37°C에서 보충된 DMEM/F12및 5%CO2를 전처리된 96웰 플랫 플레이트에서 24시간 동안(재료 표참조).</li>
		<li>T에서 빈맥으로 각 세포 집단을 감염. 1:1의 복합감염(MOI)에서 황색 형광 단백질(YFP)을 발현하는 곤디RH 균주 (기생충:세포) 200 μL/웰에서 희석된 RPMI (3% FBS + 0.16 mM 페니실린 + 0.18 mM 스트렙토미신 + 12.5 mM HEM + HEM + 12.5 mm + HEM + 12.5 mm pH 7.2) (재료 표참조). 37°C에서 배양하고 48시간 동안 5%CO2를 배양한다.</li>
		<li>이어서, 상판액을 버리고 24시간 동안 4°C에서 PBS에서 희석된 100 μL/well 의 1% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 세포를 고치십시오.</li>
		<li>PFA를 pH 7.2에서 PBS의 100 μL/well으로 교체하십시오.</li>
		<li>PBS pH 7.2(1:1,000)에서 희석된 DAPI(5 mg/mL)의 50 μL/well을 암흑 에서 실온에서 1분 동안 1분 동안 파이펫팅하여 상류및 얼룩 세포의 핵을 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>DAPI 염색 용액을 PBS(pH 7.2)의 100 μL/well으로 교체하고 형광 현미경으로 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>T. cruzi를 가진 신경교 세포의 감염
	<ol>
<li>플레이트 3 x 104 마이크로글리아 또는 37°C에서 보충된 DMEM/F12및 5%CO2를 전처리된 96웰 플랫 플레이트에서 24시간 동안(재료 표참조). 참고: 감염 시점마다 다른 접시를 사용하십시오.</li>
		<li>5:1의 MOI에서 T. cruzi Y 균주에서 trypomastigotes와 신경교 세포를 감염 5:1 (기생충:세포) 보충 된 RPMI의 200 μL /well에서 희석 하 고 37 °C에서 배양 하 고 5%CO2 에 대 한 2 시간. 참고: 이 단계는 기생충에 의한 세포 침입에 중요합니다.</li>
		<li>모든 상급체를 제거하고 모든 세포 외 기생충을 제거하기 위해 보충 RPMI의 200 μL / 웰을 추가하여 우물을 씻어. 상급제를 제거하고 신선한 보충 RPMI의 200 μL / 웰을 추가하십시오. 참고 :이 단계는 부착 세포를 침공하지 않은 모든 기생충을 제거하려고합니다.</li>
		<li>신경교 세포에서 T. cruzi 복제를 평가하기 위해 2 시간, 48 시간 및 96 h에 대한 감염된 세포를 배양합니다.11</li>
		<li>각 시점이후에 상온액을 제거하고 실온에서 15 분 동안 메탄올 100 μL / well로 세포를 고정한 다음 메탄올을 PBS (pH 7.2)의 100 μL / well으로 대체하십시오.</li>
		<li>고정 후, 면역형광 분석실험에 대한 세포를 다음과 같이 준비한다.<ol>
<li>자가 형광을 피하기 위해, 100 μL / well의 50 mM NH4Cl을 PBS (pH 8.0)에서 15 분 동안 희석 한 세포를 치료하십시오.</li>
			<li>다음으로, 100 μL/well 의 0.5% 트리톤을 PBS에서 15분 동안 희석하여 세포를 투과시켜, PBS의 100 μL/well을 첨가하여 세포를 세척하고 즉시 제거한다(이 단계를 3번 반복).</li>
			<li>이어서, 세포 배양을 100 μL/웰 의 차단 용액(5% 무지방 우유 + PBS[pH 7.2]에서 희석된 2% BSA)로 실온에서 1시간 동안 배양한다. PBS의 100 μL / well을 추가하여 세포를 씻고 즉시 제거하십시오 (이 단계를 3 번 반복하십시오).</li>
			<li>아마스티고테스를 염색하기 위해, 실온에서 1시간 동안 차단 용액으로 희석된 비상업적 단일클론 항체(mAb) 2C2 항 Ssp-4 단백질(1:200)의 30 μL/well으로 배양합니다.</li>
			<li>PBS의 100 μL / well을 추가하여 세포를 씻고 즉시 제거하십시오 (이 단계를 3 번 반복하십시오). 실온에서 1시간 동안 PBS에서 희석된 이차 항마우스 항체(1:500)의 30 μL/well으로 플레이트를 배양합니다. 참고: 비상업적인 mAb 2C2 항 Ssp-4 단백질은 상파울루 연방 대학의 미생물학, 면역학 및 기생충학과의 레나토 A. 모르타라 교수로부터 얻은 친절한 선물이었습니다.</li>
			<li>PBS pH 7.2(1:1,000)에서 희석된 DAPI(5 mg/mL)의 50 μL/well을 어둠 속에서 실온에서 1분 동안 1분 동안 첨가하여 상류및 얼룩 핵을 조심스럽게 제거합니다.</li>
			<li>DAPI 염색 용액을 PBS pH 7.2의 100 μL/well으로 교체하고 형광 현미경으로 분석하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

뚜렷한 생물학적 맥락에서 분리된 신경교 세포 기능을 연구하는 것의 중요성은 지난 2년간 확대되고 있습니다. 뉴런을 넘어 CNS를 이해하는 것은 여전히 세포 생물학에서 성장 분야, 특히 감염 또는 염증 조건 하에서8,,9,,24. 신경교세포는 뉴런 의 물리적 지원(이전에 알려진 바와 같이)뿐만 아니라 뉴런 에너지 공급, 신경대사, 면역감시, 시냅스 가지치기, 성형 및 조직 변조 와 같은 많은 다른 생리적 상황에서도33,25,,26,,27,,,28,<sup c...

CNS는 주로 뉴런및신경교세포1,,2,,3으로구성된다. 미세글리아 및 성상 세포는 CNS에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다. 상체세포가 항상성을 유지하고 지지 기능을 발휘하는 동안, 마이크로글리아는, 상체 세포가 항상성을 유지하고 지지하는 기능을 발휘하는 동안, CNS3,,4에서면역적격 및 식세포 신경세포이다.5
신경교 세포에도 불구하고 고전적으로 뉴런의 지지 및 보호를 담당하는 것으로 알려져 있음에도불구하고,,7,이들 세포의 새로운 기능은 감염에 대한 그들의 반응을 포함하는 최근 문헌에서 기술되고 있다8,,9,,10,,11. 따라서, 개별적으로 그들의 기능을 이해 하기 위해 이러한 신경 교 세포를 격리 하는 방법을 개발 하는 푸시가 있다.
불멸세포계및 생체내 모델과 같은 1차 배양보다는 신경교세포를 연구하는 몇 가지 대체 모델이 있습니다. 그러나, 불멸의 세포는 생체 내 연구에서 제한된 조작 조건을 부과하는 동안, 유전 표류 및 형태학적 변화를 겪을 가능성이 더 높습니다. 반대로, 1차 배양은 다루기 쉽고, 생체내 세포와 더 잘 닮으며, 또한 우리가 실험인자12,,13을조절할 수 있게 한다. 여기에서, 우리는 동일한 프로토콜에 있는 뮤린 성상 세포 및 microglia 1 차적인 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법에 대한 지침을 기술합니다. 또한, 우리는 또한 이 문화에서 원생 동물 감염으로 작동하는 방법에 대한 예를 제공합니다.
신생아 마우스로부터 추출된 CNS 세포(최대 3일 령)는 성상세포 및 미세글리아 세포의 우대성장을 허용하는 차동 배지상에서 14일 동안 배양하였다. microglia는 부착된 성상 세포 위에 있기 때문에, 세포 집단은 궤도 인큐베이터에서 기계적으로 해리되었다. 다음으로, 우리는 마이크로글리아를 함유하는 모든 상상체를 수집하고 성상 세포체를 분리하기 위해 트립신을 첨가했습니다. 단리된 신경교 세포는 유세포측정에 의해 전형적으로 평가되었고 원하는 실험에 따라 도금하였다.
우리는 또한 원생 동물 기생충으로 이 고립된 microglia 및 성상 세포를 감염하는 방법에 대한 예를 제공했습니다. T. gondii는 톡소플라즈마증14를담당하는 고도로 신경성 원생동물이며, T. 크루즈i는 CNS15,,16에서신경 장애의 발달로 이어질 수 있는 샤가스 질환에 대한 책임이 있다. 더욱이, 또한 T. 곤디17,17,18 또는 T. cruzi19,20,,,21에 의한 감염이 면역손상 환자에서 사망의 추정된 원인이었다는 보고가 있다. 따라서 원생동물 감염을 조절하는 과정에서 CNS로부터 신경교 세포의 면역학적 역할의 해명이 매우 중요하다.

<table><tbody><tr><td>70% 에탄올</td><td>Din&acirc; 운모 Qu&iacute; 운모 컨템포러&acirc; nea</td><td>Cat: 2231</td><td>살균</td></tr><tr><td>75cm2 플라스크</td><td>코닝</td><td>고양이: 430720U</td><td>플라스틱 재료</td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>염화암모늄(NH4Cl)</td><td>Din&acirc; 운모 Qu&iacute; 운모 컨템포러&acirc; nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>자가형광</td></tr><tr><td>Anti-GFAP 항체</td><td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>면역형광 antidoby</td></tr><tr><td>병 상단 필터 0.22 &mu; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>배양 배지 필터</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS 완충액</td></tr><tr><td>준비 CD11b(FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>CD45(PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td>원심</td></tr><tr><td>분리 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>Class II 생물안전 캐비닛</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>멸균 절차용 생물안전성 캐비닛</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>ThermoScientific</td><td>모델: 3110</td><td>Primary cells maintenance</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>플라스틱 재질</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>플라스틱 재질</td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>세포 계수기</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>면역형광 antidoby</td></tr><tr><td>디지털 현미경 카메라</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>현미경으로 이미지 캡처</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: E9884</td><td>FACS 완충액</td></tr><tr><td>준비 F12 영양소 혼합물</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>사용할 수 없는</td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>LGC 생명공학</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Flow Jo (소프트웨어)</td><td>Flow Jo</td><td>버전: Flow Jo_9.9.4</td><td>데이터 분석</td></tr><tr><td>형광 intenselight</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>형광 소스</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>염소 - 항-마우스 IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>면역형광 antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>IC 고정 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>유동 부피 측정을 위한 세포 고정</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>모델 : ECLIPSE TS100</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist &aacute; lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>흡입 마취제</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Synth</td><td>Cat: 01A1085.01.BJ</td><td>면역형광을 위한 고정</td></tr><tr><td>마이크로 주걱</td><td>ABC 스테인리스</td><td>사용 불가</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>마이크로튜브 1.5mL</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>플라스틱 재료</td></tr><tr><td>단클론 항체(mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>비상업적</td><td>비상업적</td><td>면역형광 antidoby</td></tr><tr><td>다중 채널 피펫 (p200)</td> <td>Corning</td><td>Cat : 751630124</td><td>피펫 시약</td></tr><tr><td>NIS 요소 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>버전 4.0</td><td>이미지 획득 및 분석</td></tr><tr><td>무지방 우유</td><td>Nestl &eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>면역형광을 위한 차단 솔루션</td></tr><tr><td>Orbital Shaker Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td>모델: 481 Cat: 11</td><td>성상세포에서 미세아교</td></tr>세포 <tr><td>분리 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P6148</td><td>면역형광 PBS를 위한 고정</td></tr> 비<tr><td></td><td>상업적</td><td>비상업적</td><td>중성 완충액</td></tr><tr><td>페니실린 G</td><td>시그마 알드리치</td><td>Cat: P-7794</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>투과화 완충액(10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>유동 구도계를 위한 세포 투과화</td></tr><tr><td>페트리 접시 60mm x 15mm(일회용, 멸균)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>플라스틱 재료</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>pH 용액 보정</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>가위</td><td>ABC 스테인리스</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>플라스틱 재료</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>플라스틱 재료</td></tr><tr><td>단일 채널 피펫 (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>피펫 시약</td></tr><tr><td>단일 채널 피펫 (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>피펫 시약</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>스트렙토마이신 황산염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>을 위한 투과화Trypsin</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>소화 효소</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>ABC 스테인리스</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>수조</td><td>Novatecnica</td><td>모델: 09020095</td><td>37°C의 소화 조직; C와 트립신</td></tr></tbody></table>

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 microglia의 수반되는 격리

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

성상 세포와 미세 글리아는 가장 풍부한 신경교 세포입니다. 그들은 중추 신경계 (CNS)의 생리 적 지원 및 항상성 유지 보수에 대한 책임이 있습니다. 전염병의 통제에 있는 그들의 관여의 증가 기록은 CNS에 영향을 미치는 감염에 그들의 반응을 평가하기 위하여 1 차적인 성상 세포 및 microglia를 격리하는 방법론의 개선에 있는 새로운 관심을 정당화합니다. 트리파노소마 크루지(T. cruzi)와 톡소플라즈마 곤디(T. gondii) 감염의 영향을 고려하여, 여기서 우리는 원생동물 기생충으로 뮤린 천상세포 및 미세글리아 세포를 추출, 유지, 해리 및 감염시키는 방법을 제공한다.T. gondii 신생아 피신자에서 추출 된 세포는 주기적인 차동 매체 교체와 함께 14 일 동안 시험관 내에서 유지됩니다. 성상 세포 및 미세 글리아는 기계적 해리에 의해 동일한 추출 프로토콜로부터 수득된다. 유세포분석으로 자형질이 나는 후, 세포는 원생동물 기생충에 감염된다. 감염율은 다른 시점에서 형광 현미경 검사법에 의해 결정되므로 원생 동물 침입 및 복제를 제어하는 신경교 세포의 차동 능력의 평가가 가능합니다. 이 기술은 감염에 성상 세포와 microglia의 반응을 공부하는 간단하고 저렴하고 효율적인 방법을 나타냅니다, 추가 신경 면역학 분석을위한 필드를 열어.

14일째에, 신경교세포 배양(도1A)은기계적 해리를 겪었다. 단리된 세포 집단은 CD11b, CD45 및 GFAP 마커에 따라 유세포측정에 의해 분석되었다. 성상 세포 집단에 대한 89.5 %의 순도를 관찰 할 수 있었고 미세 글리아 인구에 대한 96.6 %를 관찰 할 수 있었습니다(그림 1B). 격리 후, 세포는 96웰 플랫 플레이트에 도금되었고 24시간 후에 각각의 감염 프로토콜에 따라 T. cruzi 또는 T. gondii에 감염될 준비가 되었다. 여기에서 우리는 이 신경교 세포에 있는 감염비율 평가의 보기로 T. cruzi의 시간 과정 감염을 제공했습니다.
성상 세포 및 마이크로글리아(3 x 104 세포/웰)는 MOI =...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 뮤린 성상 세포와 미세 글리아 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법을 지시하고 원생 동물 기생충에 감염하는 것입니다.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

이 프로토콜은 산후 마우스에서 가장 풍부한 두 개의 가장 풍부한 신경교 세포 인구, 성상 세포 및 미세 리아를 병렬로 추출하는 데 초점을 맞춘 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 우리가 같은 조건에서 동일한 추출에 있는 두 세포 모형을 얻고 격리에 집중하기 때문에 성상 세포 및 microglia 격리를 위한 이전에 기술된 프로토콜과 다릅니다, 따라서 실험적인 동물의 사용을 최적화하고 면역학적 맥락에서 이 세포에 대한 상대적 역할의 연구를 향상. 이 프로토콜은 예를 들어 원생동물 기생충 또는 바이러스에 의해 알츠하이머, 파킨슨 및 감염과 같은 중추 신경계의 많은 문맥과 질병에서 microglia 및 성상세포 역할을 더 잘 조사하는 데 유용할 수 있습니다.동일한 추출에서 두 세포 유형을 획득하고 격리하는 것은 감염 또는 염증과 같은 각 세포 하위 집합 면역 학적 맥락의 비교 역할을 평가하는 것이 바람직하다. 사람들은 특히 뇌 제거 와 신경 조직 세차하는 동안주의해야한다, 그러나 나는이 프로토콜과 비디오 샷으로, 사람들은 투쟁하지 않을 것이라고 생각합니다. 이 프로토콜은 코르티체를 추출하는 동물의 수에 따라 길수 있으므로 약 4 시간 이상을 보낼 준비가되어 있습니다.첫날에는 순수 HBSS 및 HBSS와 10%의 열 비활성화 FBS를 준비하십시오. 보충 DMEM F12를 준비하고 0.22 미크론 필터로 필터링합니다. 오토클레이브에서 모든 수술 기구를 살균하고 시술 중에 70 %의 에탄올을 사용합니다.신생아 쥐를 이소플루란으로 담근 면이 들어 있는 밀폐된 챔버에 5분간 심오한 마취를 하십시오. 마우스 새끼를 70%에탄올로 스프레이하고 가위로 동물을 참수합니다. 두개골을 따라 가위로 처릿 컷을 만들어 뇌를 드러내십시오.뇌의 무결성을 유지하기 위해 마이크로 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 마른 6센티미터 직경페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 마이크로 주걱을 사용하여 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오.피질을 HBSS 2밀리리터와 10%의 FBS가 포함된 다른 페트리 접시로 이동합니다. 멸균 가위로 뇌 조직을 잘라내고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 각 뇌 조직을 HBSS플러스 10%FBS로 다른 15밀리리터 원문 튜브로 옮길 수 있습니다. 필요한 경우 HBSS와 10%FBS를 사용하여 최종 볼륨을 2밀리리터로 채웁니다.각 튜브에 대해 3 밀리리터의 HBSS와 10%의 FBS로 절단 된 뇌 조직을 씻으십시오. 절충 후, 신중하게 상체를 제거합니다. HBSS와 10%FBS를 3회 추가로 세척합니다.그런 다음 순수 HBSS 3 밀리리터로 세 번 씻으시면 됩니다. 절충 후, 신중하게 상체를 제거합니다. 다음으로, 트립신 3밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 37도에서 30분간 수조에 넣고 5분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 놓습니다.이것은 수집된 조직을 소화합니다. 거품을 피하십시오. 트립신을 비활성화하려면, HBSS의 세 밀리리터 플러스 10 %FBS와 조직의 감소 후 조직을 씻어, 신중하게 상체를 제거합니다.이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 순수 HBSS의 3 밀리리터로 조직을 씻고 두 번 더 반복하십시오. 조직의 절제 후, 신중하게 상체를 제거합니다.순수 HBSS 의 일곱 밀리리터를 추가하고 파이펫의 연속 구절을 통해 조직을 균질화, 먼저 10 밀리리터 세로지 피펫, 그리고 5 밀리리터 파이펫, 그리고 마지막으로 P1000 마이크로 파이프로. 균질화 후, 4섭씨에서 5분간 450배g의 원심분리합니다. 상체를 버리고 각 튜브에 대해 HBSS 4 밀리리터와 10 %의 FBS로 펠릿을 다시 중단하십시오.최적의 세포 배양 접착을 위해 상업적으로 전처리된 T75 플라스크로 세포를 이송한다. 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 30분간 보관하십시오. 그런 다음 플라스크에 보충된 DMEM F12 10밀리리터를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 2박 동안 배양합니다.셋째 날에는 T75 플라스크에서 7밀리리터의 배양 배지를 제거하고 7밀리리터의 신선한 보충 DMEM F12를 추가합니다. 플라스크를 인큐베이터에 반환합니다. 5일째에는 파편과 비부착 세포를 제거하기 위해 T75 플라스크에서 모든 배지를 신선한 DMEM F1214 밀리리터로 교환합니다.그런 다음 48시간마다 상체6밀리리터를 제거하고 14일째까지 신선한 보충 DMEM F12 배지 7밀리리터를 추가합니다. 14일, 6밀리리터의 상체를 제거하고 7밀리리터의 신선한 보충 DMEM F12 매체를 추가한 후, T75 플라스크를 플라스틱 포장으로 단단히 닫습니다. 200 RPM과 37°C의 바닥 궤도 셰이커에 배치하여 성상세포에서 기계적으로 미생물을 해리시합니다.15일째에 셰이커에서 플라스크를 꺼내 서 열렬히 씻어 내어 세포 해리를 최적화하고 최대 수의 마이크로글리아를 수확하십시오. 그런 다음 상체를 수집하고 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오. 다음으로, 각 플라스크에 4 밀리리터의 트립신을 추가하고 성상세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 트립신을 비활성화하기 위해 보충 된 DMEM F12의 5 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 자신의 매체로 씻고 내용물들을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮겨보십시오. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 450배 g에서 해리된 마이크로글리아 또는 성상세포를 함유한 모든 튜브입니다.상부체를 폐기합니다. 보충 DMEM F12의 1 밀리 리터와 성상 세포10 보충 DMEM F12의 밀리리터에서 마이크로 글리아 펠릿을 다시 중단. Neubauer 챔버 또는 자동 셀 카운터에서 셀 카운트로 진행합니다.전처리된 평평한 바닥 세포 배양판에서 원하는 밀도로 DMEM F12를 보충하여 세포를 플레이트. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양하여 부착할 수 있도록 합니다. 14일째에, 신경교 세포 배양은 기계적인 해리를 겪었습니다.그것은 성상세포 인구에 대한 89.5 %와 microglia 인구에 대한 96.6 %의 순도로 관찰되었다. C57BL6 마우스의 성상세포및 마이크로글리아는 T.cruzi Y.에 감염된 후 2시간, 48시간, 96시간 후, 챔버는 메탄올로 고정되어 세포 핵마커 DAPI 및 안티 GFAP로 염색하였다. 특정 형광 항체로 표지된 형광 기자 또는 기생충을 표현하는 유전자 변형 기생충의 사용은 세포 핵과 더 잘 구별되기 때문에 면역 형광 현미경 검사를 향상시켰다.여기에 두 가지 예가 표시됩니다. T.곤디 RH 균주는 비상업적 단일 클론 항체 2C2 항 SSP4 단백질로 염색된 YFP 및 T.cruzi Y 균주를 구성적으로 표현합니다. 세포 응집체를 잃지 않도록 세포를 조심스럽게 씻는 것이 중요합니다.신경교 세포 감염 후, 다른 파라미터는 상류체에 존재하는 사이토카인 생산을 위한 ELISA, 단백질 발현을 위한 서양 블로팅, RNA 전사 평가를 위한 실시간 정량적 PCR 과 같은 평가될 수 있다. 신경교 세포의 기능에 관련 된 많은 질문, 예를 들어 그들의 신진 대사, 면역 반응, 그리고 세포 생물학 자체는 해결 하 고이 기술에 의해 혜택을 받을 수 있습니다. 모든 원생동물 기생충은 인간 세포뿐만 아니라 배양 마우스 세포를 감염시킬 수 있으므로 이 기생충을 다룰 때주의하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한...

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

배우세요 생후 마우스 대뇌피질에서 성상세포와 미세아교세포를 동시에 분리하고 배양하는 방법을. Trypanosoma cruzi와 Toxoplasma gondii 등 원생동물 기생충 감염 연구에 활용할 수 있습니다.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

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