Name: 조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 조건부 Cas9 안정화를 활용한 CRISPR 유전자 편집 기법으로, Shield-1 소분자를 사용하여 오프타겟 효과와 세포 독성을 줄이고 필수 유전자 및 종양 생존 유전자의 특성 분석을 가능하게 합니다.

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우리는 전작에 대한 우리의 실험실과 과학자 세리프 Senturk의 이전 구성원에게 감사드립니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고 다닐로 세고비아 감사합니다. 이 연구는 가능하 고 미국 전역 수영과 국립 암 연구소 암 대상 발견 및 개발 센터 프로그램에 의해 지원.

1. DD-Cas9 벡터
<ol><li>Addgene (필러 서열 및 금성 (EDCPV), 플라스미드 90085와 DD-Cas9 벡터를 가져옵니다. 참고: 이것은 EFS 프로모터가 DD-Cas9 전사를 운전하는 동안 단일 가이드 RNA (sgRNA) 전사를 구동하는 U6 프로모터와 렌티바이러스 DD-Cas9 플라스미드입니다. DYKDDDDK 서열(flag-tag)은 Cas9의 C 단말에 존재하며, DD-Cas9및 변형형 형광 단백질 비너스(mVenus)를 분리하는 2A 자가 절단 펩티드(P2A)가 그 뒤를 잇고 있다.</li>
</ol>2. 소형 가이드 RNA(sgRNA) 설계
<ol><li>특정 게놈 영역을 대상으로 여러 알고리즘 중 하나를 사용하여 DD-Cas9 벡터로 복제될 작은 가이드 RNA(sgRNA)를 설계한다. 참고: 오프 타겟 효과를 줄이려면 웹 사이트인 http://crispr.mit.edu 사용하여 가장 높은 점수를 받은 sgRNA 서열을 선택합니다.</li>
	<li>sgRNA 서열당 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하고 주문하여 완전한 sgRNA를 만듭니다. 참고: 플라스미드는 BsmBI 효소에 의해 소화되기 때문에, SgRNA 서열에 BsmBI 소화 오버행을 추가하여 전방 및 역 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 표 1에서템플릿을 사용합니다.</li>
</ol>3. 렌즈피바이러스 DD-Cas9 벡터로 sgRNA 복제
<ol><li>탈포량은 제한 효소 소화 반응에서 알칼리성 인스파타제(FastAP)를 사용하여 DD-Cas9 플라스미드의 5′-ends를 사용한다. 참고: 벡터는 특히 단일 제한 효소에 의해 선형화될 때 결찰 중에 다시 순환할 수 있습니다. 벡터가 다시 순환되지 않도록 하기 위해 소화 반응에 직접 인산염을 추가하여 플라스미드를 인광합니다.<ol>
<li>DD-Cas9 플라스미드 5μg, 소화 버퍼 6μL(10x), DTT 의 0.6 μL(100mMMM), BsmBI 3μL, FastAP의 3μL, 최대 60μL 핵을 첨가하여 BsmBI 효소로 플라스미드를 분해하고 소화합니다. 참고: BsmBI 효소와 FastAP를 혼합물에 결국 추가합니다.</li>
		<li>37°C 열 블록 또는 열사이클러에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화된 DD-Cas9 플라스미드를 정화합니다.<ol>
<li>0.8% DNA 아가로즈 젤을 준비하여 불완전하게 소화된 플라스미드와 효소의 흔적을 제거합니다. 더 넓은 젤 콤을 사용하여 더 나은 분리를 하고 90 V에서 젤을 실행하십시오.</li>
		<li>360-365 nm UV 빛 아래에서 밴드를 시각화하고 젤에서 더 큰 플라스미드 밴드를 잘라냅니다. 필러에 해당하는 2kb 조각을 폐기합니다.</li>
		<li>상업용 젤 정제 키트를 사용하여 대형 컷 젤 밴드를 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리게이트는 소화된 DD-Cas9 플라스미드로 올리고를 안다했다.<ol>
<li>인광및 sgRNA 올리고를 음침.<ol>
<li>T4 리기션 버퍼(10x), 올리고 1μL 1μL(100 μM), 올리고 2(100 μM), 뉴클레아제 물 6.5 μL의 혼합을 준비한다. 마지막으로 T4 PNK의 0.5 μL을 추가합니다. 이 반응의 총 부피는 10 μL입니다.</li>
			<li>다음 조건으로 써모사이클러에 반응 혼합을 추가하십시오: 30분 동안 37°C, 5분 동안 95°C, 5°C의 속도로 25°C까지 경사로. 참고: PNK는 올리고뉴클레오티드가 결찰에 투입되기 전에 열활성화되어야 하며 그렇지 않으면 PNK가 벡터를 인계합니다. 인산화 단계 및 어닐링 단계는 열순환기에서 함께 수행됩니다. 5' 인산염이 sgRNA 올리고뉴클레오티드에 첨가되는 인산화 단계는 결찰이 발생하기 위해 요구된다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligate DD-Cas9 소화 플라스미드 와 sgRNA 올리고.<ol>
<li>아닐드 올리고를 핵이 없는 물에서 1:200으로 희석하고 결찰 반응에서 플라스미드 DNA 50 ng를 사용합니다. 참고: 6 인서트: 1 벡터의 어금니 비율을 사용하여 삽입 통합을 촉진하거나 계합 계산기를 사용하여 어금니 비율을 계산합니다: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.</li>
			<li>결찰 반응 혼합준비: 소화 및 정제D-Cas9 벡터의 50 ng, 희석 된 어닐 리고의 적절한 부피, T4 리깅 버퍼 (10x), T4 DNA 리간제의 1 μL, 최대 10 μL 뉴클레아제 프리 워터의 총 부피를 얻기 위해 반응 10L μμ.</li>
			<li>"고농도" 리갈아제를 사용하는 경우 실온에서 5분 동안 반응을 배양한다. 그렇지 않으면, 2 h에 대한 실온에서 배양하거나, 또는 결찰의 높은 수율을 달성하기 위해, 하룻밤 16 °C에서 배양. 참고: 표준 T4 DNA 리개아제(65°C)를 20분 동안 사용하는 경우 열비활성화. 리구아제 마스터 믹스를 사용하는 경우 열 비활성화하지 마십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세균 변환
<ol><li>실온에서 10cm LB-암피실린 아가르 플레이트를 미리 따뜻하게 합니다.</li>
	<li>얼음에 "한 샷 Stbl3"유능한 세균 세포의 50 μL을 해동.</li>
	<li>유능한 세균 세포의 50 μL에 2-3 μL의 결찰 혼합물을 넣고 손가락으로 튜브의 바닥을 4 번 가볍게 눌러 부드럽게 섞습니다. 30 분 동안 얼음에 배양.</li>
	<li>타이머를 사용하여 40초 동안 정확히 42°C에서 세포를 열 충격. 얼음에 세균 세포를 5 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>세균 세포에 항생제없이 SOC 매체의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 45 분 동안 250 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 성장합니다.</li>
	<li>전침이 나는 LB-암피실린 플레이트에 변형된 박테리아 100 μL을 확산시키고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. 리그 플라스미드의 미니 /맥시 준비
<ol><li>맥시/미니 준비 스타터 문화를 준비합니다.<ol>
<li>다음날 하나의 세균 클론을 선택하고 ampicillin을 포함하는 LB 미디어의 8 mL로 스타터 문화를 접종합니다.</li>
		<li>10-12 h에 대한 250 rpm, 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에서 박테리아를 성장시다.</li>
		<li>미니 준비에 박테리아의 3-5 mL을 사용 하거나 맥시 준비에 대 한 스타터 문화로 사용. 세균 배양비에 글리세롤을 100% 첨가하여 세균글리세롤 육수로 박테리아의 나머지 부분을 사용하십시오:글리세롤은 1:1이다. 참고 : 여기에, 우리는 미니 준비 절차를 설명합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미니 준비 절차<ol>
<li>세균 세포와 원심분리기의 3-5mL를 1분 동안 12,000 x g에서 수확하십시오.</li>
		<li>RNase A를 함유하고 4°C에 저장되는 P1 버퍼의 200 μL로 세균 세포의 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
		<li>완충 P2의 200 μL을 추가하고 액체가 명확해질 때까지 튜브를 10번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>완충 P3의 300 μL을 추가하고 튜브를 10 번 반전하여 혼합합니다. 액체는 흐리게 됩니다. 10 분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심 분리하여 즉시 진행하십시오.</li>
		<li>투명 상체를 스핀 컬럼과 원심분리기로 1분 간 12,000 x g로 옮긴다. 흐름을 삭제합니다. 참고: 상체가 명확히 되었는지 확인합니다. 파티클은 스핀 열을 막고 열 효능을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>1분 동안 PD 버퍼와 원심분리기 400μL을 12,000 x g에 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.</li>
		<li>PW 버퍼 600 μL을 추가하여 스핀 컬럼과 원심분리기를 1분 동안 12,000 x g로 세척합니다. 흐름을 삭제합니다.</li>
		<li>원심분리기는 버퍼 잔류물을 제거하기 위해 3분 동안 최고 속도로 스핀 컬럼을 다시 제거합니다. 흐름을 버리고 2 분 동안 앉게하십시오.</li>
		<li>스핀 컬럼을 신선한 튜브에 놓고 50 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 5분 동안 배양하고 원심분리기는 최고 속도로 2분 동안 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>나노 드롭 장치를 사용하여 sgRNA 인서식 (ng/μL)을 사용하여 정제 된 DD-Cas9 플라스미드의 농도를 측정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD-Cas9 플라스미드의 DNA 염기서열분석에 의한 sgRNA 복제를 검증한다. 표 2에서U6 프라이머 시퀀스를 사용합니다.</li>
</ol>6. 렌티바이러스 제제
<ol><li>FEK293T 패키징 셀을 준비하여 트랜스페트합니다.<ol>
<li>건강한 HEK293T를 10번 통로까지 사용하고 10cm 조직 배양판당 밀도 1-2 x 106 세포에서 균등하게 시드하십시오. 포도당 덜벡코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)의 10 mL을 사용하여 10 % 여과 된 태아 소 세럼 (FBS)을 사용하십시오. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 20시간 동안 5% CO2 및 37°C로 배양한다.</li>
		<li>다음 날, 세포가 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 70%의 합류에 도달하고 그(것)들이 접시를 통해 고르게 분산된다는 것을 확인합니다. 10mL의 최종 부피로 전환하기 전에 1h의 세포로 미디어를 변경합니다. 참고: 미디어는 항생제와 항균제가 없어야 합니다.</li>
		<li>따뜻한 매체(예: OptiMEM)의 500μL로 2개의 튜브의 혼합물을 준비한다.<ol>
<li>25 μL의 형질 전환 시약을 튜브 1에 추가하여 따뜻한 500 μL의 미디어를 포함하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>한편, 플라스미드를 튜브 2에 혼합하여 복제된 sgRNA를 함유한 DD-Cas9, 포장 플라스미드(psPAX2)의 6μg, 봉투 플라스미드(pMD2.G)의 3μg을 포함하는 튜브 2를 사용하여 따뜻한 500μL의 미디어를 준비한다.</li>
			<li>튜브 1과 튜브 2를 혼합하여 형질 혼합물을 형성하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>HEK293T 세포에 대한 배설 혼합물을 드롭와이즈 방향으로 하고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양하고, 하룻밤 사이에 5% CO2 및 37°C로 한다.</li>
			<li>18h 이후, 10% FBS로 미디어를 10mL의 신선한 DMEM으로 조심스럽게 변경하여 경질 시약을 제거합니다. 다음 48 h에 대한 인큐베이션.</li>
			<li>48h 후, 10 mL 주사기로 상체를 수집하고 0.45 μm 필터를 통과합니다.</li>
			<li>Aliquot 및 -80 °C에 바이러스 상체를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 유동 세포측정을 통해 바이러스 성도 및 트랜스듀션 효능 결정
<ol><li>HEK293T 세포를 5 x 105 셀/웰로 6웰 플레이트에 시드합니다. 종자 세포는 두 개의 6 웰 플레이트로. 다음 날 계산에 하나의 접시를 사용합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플레이트를 37°C, 습도 95%, CO2 5%로 배양하여 다음날 50-60%에 도달합니다.</li>
	<li>다음 날, 6 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 6 개의 우물에서 세포를 계산하십시오.</li>
	<li>직렬 희석을 수행하는 데 사용되는 바이러스 알리코트를 해동하고 폴리브레인 시약의 8 μg/mL을 추가합니다.</li>
	<li>바이러스의 직렬 희석을 위해 10% FBS로 DMEM을 준비하고 폴리브레인 시약의 8 μg/mL을 추가합니다.</li>
	<li>폴리브레인 함유 매체에서 렌티바이러스의 10배 직렬 희석 2mL를 1 x10-1 ~ 1 x10-4에서 준비한다.</li>
	<li>6웰 플레이트에서 미디어를 제거하고 우물에 바이러스 희석 1mL을 추가합니다. 부정적인 제어로 혼자 미디어와 함께 하나를 잘 두고 100% 바이러스와 잘 하나.</li>
	<li>24 시간 동안 인큐베이터에서 바이러스를 가진 세포를 배양한다.</li>
	<li>다음 날, 6 웰 플레이트에서 바이러스로 미디어를 제거하고 10 % FBS와 신선한 DMEM의 2 mL에 대해 변경합니다. 48-72 h용 배양 세포. 매일 형광 현미경을 사용하여 GFP를 관찰하십시오.</li>
	<li>48-72 h 후, 세포를 분리하고 MACS 버퍼에서 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>흐름 사이토미터를 사용하여 GFP 식의 백분율을 결정합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 바이러스 티터를 계산: TU/mL = (세포 수 x % 형광 x 희석 계수)/(mL의 트랜스듀션 볼륨)</li>
</ol>8. 표적 세포의 렌즈피바이러스 변환
<ol><li>관심있는 세포줄을 10cm 플레이트로 플레이트하고 다음 날 50-60 %의 합류에 도달하기 위해 하룻밤 동안 배양하십시오. 참고 : 우리는 DD-Cas9와 두 개의 독립적 인 RPA3 유전자 sgRNA를 표현하는 A549 세포주를 사용했습니다. 우리는 또한 레닐라 제어와 벡터를 표현하는 A549 세포주를 사용했다. 우리는 2 x 103세포 /cm2의 밀도로 그 세포를 시드하고 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO2 하룻밤50-60 %의 합류에 도달하여 배양했습니다. 우리는 10 % 필터링 된 FBS와 RPMI 미디어를 사용했다. 다음과 같이 다음 단계를 진행했습니다.</li>
	<li>다음 날, 배양 배지의 총 부피 10mL에서 바이러스 입자의 500-2000 μL로 세포를 감염시킵니다. 24 시간 동안 바이러스 성 미디어를 인큐베이션합니다.</li>
	<li>다음 날, 바이러스 성 매체를 배양 매체로 변경하고 유동 세포 측정을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정합니다.</li>
	<li>FACS 셀 정렬 또는 bleomycin 선택을 사용하여 GFP 양수 셀을 선택합니다.</li>
	<li>긍정적으로 선택된 셀을 확장하고 재고를 동결합니다.</li>
</ol>9. Cas9 중재 유전자 편집의 조건부 유도
<ol><li>플레이트는 감염 후 24h의 세포뿐만 아니라 12웰 플레이트에 별도로 분리된 분리된 세포를 선택하였다. 세포가 부착하고 쉴드-1의 200 nM을 포함하는 세포 배양 매체로 미디어를 변경할 때까지 기다립니다. 플레이트의 미디어를 변환 및 변환되지 않은 셀로 교체하여 플레이트당 2개의 우물을 음수 제어로 일반 미디어로 남깁니다.</li>
	<li>웰에 쉴드-1을 추가한 후 시간 0, 2h, 6h, 12h, 24h, 48h 및 72h의 서로 다른 시점에서 각각의 잘 단백질을 배양하고 추출합니다.</li>
	<li>그런 다음 나머지 우물에서 Shield-1로 미디어를 제거하고 일반 세포 매체를 변경합니다.</li>
	<li>미디어를 변경한 후 2시간, 6시간, 12h의 우물에서 단백질을 수집합니다.</li>
	<li>서부 블롯분석에 의해 시각화하여 리간드, Shield-1을 첨가하고 철수한 후 불안정한 DD-Cas9 단백질 조절의 가역성과 급속성을 분석한다. DYKDDDDK 태그를 향한 항체를 사용하여 단백질과 조절 항체 표적화를 예로 들 수 있습니다.</li>
	<li>웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰된 용량 반응 곡선에 의해 쉴드-1의 최적 용량을 결정한다.</li>
</ol>10. 유전자 편집의 검증
참고: 유동 세포측정 분석 및 bleomycin 선택 마커와 같은 GFP 식 분석은 성공적인 CRISPR 시약 전달을 확인하지만 원하는 시퀀스가 성공적으로 표적화되었는지 는 결정하지 않습니다. CRISPR 실험에 의한 성공적인 유전자 표적화를 확인하는 가장 일반적인 분석은 Sanger DNA 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 측량자 핵분석, 분해(TIDE) 분석, 또는 서부 블롯분석에의한 인델의추적이다.
<ol><li>플레이트는 긍정적으로 선택된 세포를 포함하고 있는 쉴드-1의 200nM으로 미디어를 변경한다. 5 일 동안 세포를 배양하여 3 일마다 Shield-1로 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>상기 검증 기술을 DD-Cas9 유도 후 5일 쉴드-1에 사용한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

CRISPR/Cas9 기술은 게놈2를기능적으로 심문하는 기능에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 유전자의 불활성화는 종종 세포 치사성, 기능적 적자 및 발달 결함을 초래하여 유전자 기능을 연구하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 제한한다7. 또한, Cas9의 구성 발현은 독성 및 오프 타겟 효과6의생성을 초래할 수 있다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 기술6을일시적으로 제어하기 위해 다양한 접근법이 개발되었다. 이들 시스템은 Cas9 및/또는 sgRNA 또는 Cas9 전사 후 및 번역 후활성화(21,22,23)의전사 제어를 기반으로 한다. 이러한 시스템의 대안으로 Cas9의 조건부 불안정화를 ...

CRISPR-Cas9는"정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 관련 단백질 9"을의미하는 CRISPR-Cas9는 세균 적응 면역1,2에대한 연구의 일환으로 처음 발견되었다. 오늘날 CRISPR/Cas9는 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 위한 가장 인정받는 도구가 되었으며 시스템의 상이한 반복은 전사 및 후성 유전학 변조3을허용하도록 개발되었다. 이 기술은 DNA 4의 거의 모든 순서의 매우 정밀한 유전 조작을 가능하게합니다.
CRISPR 유전자 편집의 필수 성분은 사용자 지정 가능한 가이드 RNA 서열 및 Cas9 nuclease5이다. RNA 가이드는 DNA내의 표적-보완 서열에 결합하여 Cas9 뉴클레아아아제에게 게놈3,4의특정 지점에서 이중 가닥 브레이크를 수행하도록 지시한다. 그 결과 골짜기 부위는 비동종 최종 결합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR)에 의해 수리되며, 결과적으로 표적 DNA 서열5의변화가 도입된다.
CRISPR/Cas9 계 유전자 편집은 사용하기 쉽고, 이전 유전자 편집 기술에 비해 상대적으로 저렴하며, 시스템2,4,5의복합성에서 효율적이고 견고하다는 것이 입증되었다. 그러나 시스템은 몇 가지 제한을 제시합니다. Cas9의 구성 발현은 종종 오프 타겟의 증가 수와 높은 세포 독성4,6,7,8의증가를 초래하는 것으로 나타났다. 추가적으로, Cas9에 의하여 필수 및 세포 생존 유전자의 구성 적인 표적은 세포 사멸의 운동 연구 결과와 같은 기능적인 연구의 특정 모형을 능력을 멀리취합니다 7.
Tet-ON 및 Tet-Off9와같은 이러한문제를해결하기 위해 다른 유도성 또는 조건부 제어 CRISPR-Cas9 도구가 개발되었습니다. 사이트별 재조합10; 화학적으로 유도된근접성 11; 인테인 종속 접합3; 및 4-하이드록시타목시펜 에스트로겐 수용체(ER) 기반 핵 국소화시스템(12). 일반적으로, 이러한 절차의 대부분(인테인 접합 및 화학적으로 유도된 근접 분할 시스템)은 가역적 제어를 제공하지 않으며, 약물 치료에 매우 느린 운동 반응을 제시하거나(Tet-On/Off 시스템), 또는 고처리량 조작6에의존하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 빠르고 강력한 측두식 유전자 편집을 제공 할뿐만 아니라 추적성, 튜닝성 및 높은 처리량 유전자 조작에 대한 편의성을 보장하는 새로운 툴킷을 개발했습니다. 이 새로운 기술은 세포주, 오르가노이드 및 동물 모델에서 사용할 수 있습니다. 우리의 시스템은 Cas9에 융합 될 때 엔지니어링 된 도메인을 기반으로, 그것은 그것의 급속한 저하를 유도. 그러나, 고도로 선택적, 비독성, 세포 투과성 소분자로 빠르게 안정화될 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 FKBP12 돌연변이 "불안정 도메인"(DD)을 Cas9로 설계하여, 포유류세포(13)에서발현될 때 유비퀴틴-프로테솜 시스템을 통해 신속하고 구성적인 분해를 위해 Cas9를 표시하였다. DD 합성 리간드, 쉴드-1은 DD 변형을 안정화시켜 DD(Cas9 와 같은)에 융합된 단백질의 분해를 매우 효율적인 방식으로, 그리고 빠른 운동반응(14,15)으로방지할 수 있다. 참고로 Shield-1은 야생형 대응14보다돌연변이 FKBP12에 3배 더 단단하게 결합합니다.
DD-Cas9/Shield-1 쌍은 이전에 미토콘드리아대사에 중요한 역할을 하는 CypD 유전자를 조건부 대상으로 한 것으로 이전에 보여준 바와 같이 배양 세포 및 동물 모델에서 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. EGFR, 온코겐 변환의 핵심 플레이어; 및 Tp53, DNA 손상 반응에 있는 중앙 유전자. 시간적 및 조건부 제어 유전자 편집 외에도 DD-Cas9의 안정화가 전사와 무관하다는 것이 방법의 또 다른 장점이 있습니다. 이 기능은 에스트로겐 수용체 의존성 재조합, CRE ER과 같은 추적 가능한 마커뿐만 아니라 재조합의 동시 발현을 가능하게한다. 이 작품에서, 우리는 우리의 방법이 성공적으로 시험관 내에서 사용될 수있는 방법을 보여줍니다, 예를 들어 조건부 대상, DNA 복제 유전자, RPA3.

<table><tbody><tr><td>100mM DTT</td><td>Thermosfisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X FastDigest 버퍼</td><td>Thermosfisher</td><td>B64</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 결찰 버퍼</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>비색 BCA 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 글루타Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566024</td><td></td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermosfisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermosfisher</td><td>FD0454</td><td></td></tr><tr><td>Flag [M2] 마우스 mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 추출 키트</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.1</td><td></td></tr><tr><td>lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드,</td><td>시그마, 알드리치</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>pMD2.G</td>, <td>애드겐</td>, <td>12259</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리브레네</td>, <td>시그마, 알드리치</td><td>, TR-1003-G</td><td></td>,</tr><tr><td>psPAX2</td>, <td>애드진</td><td>, 12260</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAquick PCR & 겔 클린업 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr>, <tr><td>2차 항체</td>, <td>LICOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shield-1</td>, <td>Cheminpharma</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Stbl3, 적격 박테리아 세포</td><td>, Thermofisher</td><td>C737303</td><td></td></tr>, <tr><td>SURVEYOR 돌연변이 검출 키트</td>, <td>형질전환유전체학/IDT,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4, PNK</td>, <td>NEB</td><td>, M0201S,</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin [DM1A] 마우스 mAb</td><td>Millipore</td><td>CP06-100UG</td><td></td></tr></tbody></table>

조건부 cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

클러스터된 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 기술은 게놈에 있는 정확하고 표적으로 한 수정을 소개하는 널리 퍼진 실험실 공구가 되었습니다. 그것의 엄청난 인기와 급속한 확산은 그것의 전임자에 비해 그것의 쉬운 사용 및 정확성에 기인한다. 그러나 시스템의 구성 활성화는 제한된 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 논문에서는 Cas9 단백질의 조건부 안정화에 기초하여 CRISPR/Cas9 활성을 측두식할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 라파마이신 결합 단백질 FKBP12의 엔지니어링 된 돌연변이를 Cas9 (DD-Cas9)에 융합하면 FKBP12 합성 리간드 (Shield-1)의 존재에 의해 안정화 될 수있는 Cas9의 급속한 분해를 가능하게합니다. 다른 유도 가능한 방법과 는 달리, 이 시스템은 두 번째 유전자의 조건부 조절 없이 다른 관심사 유전자와 DD-Cas9를 공동 발현하기 위해 바이 시트론 시스템을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있다. 이 방법은 Cas9 뉴클레아아아제에 의해 표적화된 항선의 병렬, 독립적인 조작뿐만 아니라 추적 가능한 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 방법의 플랫폼은 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화 및 시험관 내 및 생체 내 환경에서 유전자의 기능적 상호 작용의 심문을 위해 사용될 수 있다.

Cas9의 조건부 발현을 가능하게 하기 위해, DD-Cas9 융합단백질(도 1A)19의발현을 구동하기 위해 U6 구동 프로모터로 구성된 이중 렌티바이러스 벡터 구조를 개발하였다. 시스템의 견고성과 효율성을 보여주는 패러다임으로서 폐 암종 A549 세포주와 렌티바이러스 구조를 변형시켰습니다. 리간드 쉴드-1의 존재 또는 부재에서 Cas9의 수준은 항플래그 특이적 항체를 이용하여 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 서양 블롯 분석에 의해 측정되었다. 우리는 감염되지 않은 세포와 모의 감염 세포 (차량)를 대조군으로 사용했습니다. 세포는 7d에 대해 10에서 1000 nM에 이르는 쉴드-1의 농도로 처리되었다. 도시된 바와 같이, Shield-1을 통한 치료는 강력한 투여량 의존방식으로 DD-Cas9의 발현을 조절할 수있었다(도 1B...

여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.

조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

이 방법은 작은 분자, Shield-1하에서 빠른 온도 조절 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 제공합니다. 또한 Cas9의 구성 활성화와 비교할 때 더 적은 오프 타겟 효과, 낮은 세포 독성, 또한 더 높은 내부적으로 통제 된 유전자 편집을 제공합니다. 이 입자의 주요 장점은 종양 생존 유전자뿐만 아니라 필수 유전자의 특성화에 사용될 수 있다는 것입니다.DD-Cas9의 불안정화는 발현과 무관하며, 이를 통해 관심 유전자가 동일한 프로모터하에서 공동 발현될 수 있습니다. 이 방법은 생체 내 및 시험관 내 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 쉴드-1은 또한 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투할 수 있습니다, 이는 또한 두뇌 발달에 관련시키는 유전자를 공부하기 쉽게 만드는.10% 여과된 FBS를 가진 포도당 DMEM의 10 밀리리터를 사용하여 10센티미터 조직 배양 판당 1~2백만 개의 세포밀도로 건강한 HEK293T 세포를 균등하게 종자하였다. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 20시간 동안 이산화탄소 5% 및 섭씨 37도로 배양합니다. 다음 날, 세포가 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 70 %의 합류에 도달하고 그(것)들이 접시를 통해 고르게 분산된다는 것을 확인합니다.10 밀리리터의 최종 볼륨으로 트랜스퍼션 1시간 전에 미디어를 변경합니다. 따뜻한 매체의 500 마이크로 리터와 두 개의 튜브를 준비합니다. 25 마이크로리터의 트랜스페트 시약을 튜브 1에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.다른 튜브에 플라스미드를 혼합하여 넣습니다. 튜브 2와 튜브를 혼합하여 형질 혼합물을 형성하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. HEK293T 세포에 속하면 배설 혼합물을 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.18시간 후, 10%의 FBS로 미디어를 10밀리리터의 신선한 DMEM으로 조심스럽게 변경하여 트랜스페트 시약을 제거합니다. 다음 48 시간 동안 세포를 배양합니다. 48시간 후, 10밀리리터 주사기로 상수체를 수집하고 0.45 마이크로미터 필터를 통과합니다.Aliquot 바이러스 상체를 인용 하 고 영하 80 섭씨에 저장. 바이러스 티터를 결정하기 위해, 씨앗 5 백만 HEK293T 세포 는 두 개의 6 웰 플레이트로 잘 당. 두 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 하룻밤 사이에 배양하여 50~60%의 인플루엔자에 도달합니다.다음 날, 6 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 6 개의 우물에서 세포를 계산하십시오. 직렬 희석을 수행하고 폴리브레인 시약의 밀리리터 당 8 마이크로 그램을 추가하는 데 사용되는 바이러스 알리코트해, 바이러스의 직렬 희석을 위해 10 %의 FBS로 DMEM을 준비하고 폴리 브레인 시약을 추가합니다. 미디어를 포함하는 폴리브레네에서 렌티 바이러스의 10배 연속 희석제 2밀리리터를 0.1에서 0.0001로 준비합니다.6웰 플레이트에서 미디어를 제거하고 우물에 바이러스 희석1 밀리리터를 추가하여 부정적인 제어로 미디어를 잘 만들고 100 % 바이러스가 잘 결합됩니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 6 웰 플레이트에서 바이러스로 미디어를 제거하고 10 %의 FBS와 신선한 DMEM의 두 밀리리터로 변경합니다.세포를 48~72시간 동안 배양하여 매일 형광 현미경으로 GFP를 관찰합니다. 48~72시간 후에는 세포를 분리하고 최대 버퍼로 다시 일시 중지합니다. 흐름 사이토미터를 사용하여 GFP 식의 백분율을 결정하고 텍스트 원고에 제공된 수식을 사용하여 바이러스 티터를 계산합니다.10센티미터 플레이트에 관심 있는 세포줄을 플레이트하고 하룻밤 동안 배양하여 50~60%의 합류에 도달한 다음, 10밀리리터의 배양 배지에서 바이러스 입자의 500~2, 000 마이크로리터로 세포를 감염시킵니다. 바이러스 성 미디어를 24 시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 바이러스 성 매체를 배양 매체로 변경하고 유동 세포 측정을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정합니다.세포 정렬을 위해 BD FACSAria II를 사용하여 GFP 양성 셀을 선택합니다. 긍정적으로 선택된 셀을 확장하고 재고를 동결합니다. 12웰 플레이트에서 양적으로 선택된 세포와 추론되지 않은 세포를 감염 후 24시간 별도로 플레이트한다.세포가 200 나노 몰러 쉴드-1을 포함하는 세포 배양 매체로 미디어를 연결하고 변경할 때까지 기다립니다. 플레이트의 미디어를 변환및 변환되지 않은 셀로 교체하여 플레이트당 두 개의 우물을 음수 제어로 일반 미디어로 남깁니다. 우물에 Shield-1을 추가한 후 0, 2, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 각 우물에서 단백질을 배양하고 추출합니다.그런 다음 나머지 우물에서 Shield-1로 미디어를 제거하고 일반 세포 매체를 변경합니다. 미디어를 변경한 후 2시간, 6시간, 12시간 후에 해당 우물에서 단백질을 수집합니다. Cas9 단백질의 유도는 Shield-1의 존재 또는 부재에도 불구하고 유도된 세포 및 차량 사이에서 유사한 발현 수준에 의해 확인되었다.쉴드-1을 통해 치료 후 2시간 후에 트랜스유도된 A549 세포주에서 Cas9 발현의 충분한 유도가 있으며, 이는 Shield-1의 철수 후 6~12시간 이내에 무시할 수 있게 된다. Shield-1 은 고갈된 RPA3 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 블로팅을 사용하여 검증된 리넬라 샘플에 영향을 미치지 않고 48시간 후에 A549 세포를 배설하였다. 유전자 편집 반전 또는 인델 돌연변이는 측량체 핵세아제 어세약를 사용하여 확인되었다.설계된 렌즈바이러스 벡터 구조는 동일한 EF-1a 프로모터하에서 다른 관심 유전자를 베어링하는 이두근 시스템이었습니다. 변형된 형광 단백질인 P2A가 감염된 세포를 추적하기 위해 첨가되었습니다. mVenus 단백질의 발현은 DD-Cas9 발현 및 쉴드-1 처리와 무관한 차량 및 A549 트랜스듀싱 된 세포에서 관찰되었다.DD-Cas9 벡터를 갖는 세포주의 효율적인 트랜스포메이션은 건강한 HEK293T 세포를 갖는 데, 낮은 통로 수를 사용하기 위한 속도 제한 단계 중 하나입니다. DD-Cas9 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 봉투 플라스미드 사이의 비율의 최적화는 최적의 트랜스펙트에 매우 중요합니다. 그러나 그 옆에, 또한 DD-Cas9 표적 세포를 안정화하는 데 필요한 쉴드-1의 양은 조심해야 할 것입니다.Cre-plasmid와 DD-Cas9도 사용할 수 있습니다., 그리고 그것은 Cre-lox 시스템에 따라 생체 내 연구에서 유전 상호 작용을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는  확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

배우세요 조건부 Cas9 안정화를 활용한 CRISPR 유전자 편집 기법으로, Shield-1 소분자를 사용하여 오프타겟 효과와 세포 독성을 줄이고 필수 유전자 및 종양 생존 유전자의 특성 분석을 가능하게 합니다.

조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷

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