Name: 신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 대동맥 주변 지방 조직에서 신경 문장 유래 지방 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법을. 형광 표지를 활용한 FACS 분류와 지방 유도 기법으로 비만 및 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1312504), 중국 국립자연과학재단(81970378, 81670360, 81870293), 상하이시 과학기술위원회(17411971000, 1714090202) 기금 제공 .

동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학의 동물 관리 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. Wnt-1 Cre+/-세대; 로사26RFP/+ 마우스
<ol><li>크로스 Wnt-1 Cre+/- 마우스16 Rosa26RFP/+ 마우스18 Wnt-1 Cre+/-생성; Rosa26RFP/+ 마우스. 25°C에서 병원균이 없는 시설에서 12시간 의 빛/암흑 주기하에 마우스를 4-8주까지 습도가 높다.</li>
</ol>2. PAAT의 해부
참고: 그림 1을참조하십시오.
<ol><li>모든 수술 도구(예: 수술 용 가위, 표준 집게, 미세 수술 가위 및 집게)를 121 °C에서 30 분 동안 오토클레이브하여 살균하십시오.</li>
	<li>소화 배지(고당포도 덜베코의 변형 된 독수리 배지 [HDMEM]를 2 mg/mL 콜라게나제 타입 I을 함유합니다. 배양 배지(10% 태아 소 혈청 [FBS] 및 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신[PS]를 함유하는 HDMEM)을 준비한다. 사용하기 전에 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 살균하십시오.</li>
	<li>UV, 에탄올, 여과 또는 증기를 사용하여 세포 배양 시약을 적절히 살균하십시오.</li>
	<li>행크스의 균형 잡힌 식염수 용액(HBSS)과 10 mL의 HBSS가 있는 15mL 원추형 튜브로 페트리 접시를 준비하세요. 얼음에 모두 보관하십시오.</li>
	<li>자궁 경부 탈구에 의한 이소플루란및 희생으로 마우스15를 마취시. 75% 알코올(200 mL)으로 채워진 비커에 몸을 5분 동안 담그고 피부 표면을 살균합니다.</li>
	<li>복부의 피부를 잘라내고 골반에서 목까지 복부 중간선을 따라 자른다. 복부를 열고 간을 움직여 횡격막19에노출시다.</li>
	<li>다이어프램과 갈비뼈를 중간선의 양쪽에 잘라 갈비뼈를 벗겨 심장과 폐를 노출.</li>
	<li>폐와 흉선제거하고 대강과 심장과 함께 PAAT를 추출합니다.</li>
	<li>대동맥 뿌리에서 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다. 대동맥 아치와 내림차순 대동맥 사이의 절단을 확인하고 구조와 왼쪽 및 오른쪽 일반적인 경동맥을 후방 흉벽에서 둘러싼 지방 조직을 조심스럽게 분리합니다. 페트리 접시에 얼음 차가운 HBSS 버퍼로 조직을 전송합니다.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 혈관 구조 (예 : 대동맥, 일반적인 경동맥 및 기타 작은 혈관)와 근막을 가능한 한 많이 제거하고 지방 조직을 2 mL Eppendorf 튜브로 옮기면 얼음에 0.5 mL 얼음 차가운 HBS S 버퍼가 포함되어 있습니다.</li>
</ol>3. SVF의 격리
5-6 마우스의 PAAT를 1 mL의 미세원원원지 튜브로 모아 1 mL 신선하게 제조된 소화 배지를 함유하고 실온(RT)에서 Eppendorf 튜브에 외과용 가위를 사용하여 조직을 다듬는다.
<ol><li>혼합물을 소화 배지의 9 mL을 포함하는 50 mL 튜브로 옮김. 1 mL 파이펫 10x로 위아래로 파이펫팅하여 조직을 균질화합니다.</li>
	<li>튜브를 37°C에서 30-45분 동안 100 rpm에서 지속적으로 흔들어 놓고 5-10분마다 확인하여 과다 소화를 방지합니다. 이것은 세포 생존력과 수율을 향상시키는 데 중요합니다. 참고 : 좋은 조직 소화는 튜브를 부드럽게 소용돌이치면 육안으로 볼 수있는 균일하고 밝은 노란색 지방 조직을 초래할 것입니다.</li>
	<li>RT에서 10% FBS와 1% v/v PS를 함유한 HDMEM 5mL를 추가하여 소화를 멈추고 파이펫팅을 통해 잘 섞어보십시오.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 500 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다. SVF는 갈색 펠릿으로 표시됩니다. 조심스럽게 부동 지방세포를 흡인하고 SVF를 방해하지 않고 나머지 상급을 decant. SVF 펠릿을 배양 배지의 10 mL에 용해시키고 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상복부를 제거하고, RT에서 10분 동안 15 mL 원엽 튜브에서 적혈구 용해 완충액 5 mL에서 펠릿을 부드럽게 재중단시켰다.</li>
	<li>1% FBS를 포함하는 1x PBS의 10 mL를 추가하여 반응을 중단합니다. 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 세포 현탁액을 원심분리하고, 상체를 제거하고, 1% FBS를 함유하는 1x PBS의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 다시 세포를 원심 분리합니다. 상류를 제거하고 4°C에서 15 mL 원엽 튜브에서 배양 배지의 5 mL에서 펠릿을 다시 중단시켰다.</li>
	<li>원심 분리의 최종 라운드 후 (500 x g 에 대 한 5 분 4 °C에서), FACS 버퍼의 5 mL에 펠 릿 세포를 다시 일시 중단 (PBS 포함 10% FBS, 100 단위/mL DNA I, 그리고 1% v/v PS) 얼음에, 그리고 hemocytometer로 세포를 계산.</li>
</ol>4. FACS에 의한 NCADSCs의 격리
<ol><li>사용 설명서에 따라 셀 선별기를 설정하고 최적화합니다. 100 μm 노즐을 선택하고, 수집 튜브를 살균하고, 필요한 수집 장치를 설치하고, 측면스트림(20)을설정한다.</li>
	<li>RFP+ 셀을 분류하는 데 는 561 nm 노란색/녹색 레이저 및 광학 필터 579/16이 권장됩니다. 음의 대조군 및 단일 염색 된 양성 대조군을 사용하여 보상을 수행합니다. 게이팅 방식에 대한 그림 2A를 참조하십시오.</li>
	<li>40 μm 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고, 5분 동안 500 x g에서 원심분리기를 하고, 0.5-1 x 107/mL의 밀도로 FACS 버퍼의 2 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 셀을 명확하게 라벨이 붙은 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 선별기로 로드합니다.</li>
	<li>실험용 샘플 튜브를 4°C에서 실행하고 편향 플레이트를 켜고 1% FBS 및 1% v/v PS를 포함하는 RPMI로 미리 코팅된 15mL 원추형 튜브로 분류합니다. 참고: RFP 담금질을 최소화하기 위해 강한 빛으로부터 시료를 보호하십시오.</li>
</ol>5. NCADSCs의 문화
<ol><li>12웰 배양판에서 5,000개의세포/cm2의 밀도로 정렬된 세포를 완전한 배양 배지에서 플레이트하고 20-24시간 동안 5%CO2로 습한 분위기에서 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>배양 배지를 제거하고, 미리 따뜻해진(37°C) PBS로 세포를 세척하여 세포 찌꺼기를 제거하고 신선한 배양 배지를 첨가한다.</li>
	<li>일단 세포가 80-90% 수렴되면, 3-5분 동안 인큐베이터에서 37°C에서 0.25% 트립신 EDTA 용액을 사용하여 단층을 소화하고, 배양 배지의 2 mL로 중화한다.</li>
	<li>RT에서 250 x g에서 15 분 동안 수확 된 세포를 원심 분리하고 상체를 제거하고 배양 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다. 혈세포계로 세포를 계산합니다.</li>
	<li>5,000 세포 /cm2의밀도에서 12 웰 배양 플레이트에서 세포를 종자.</li>
	<li>10% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 나머지 세포를 재중단하고, 동결시키고, 액체 질소에 저장한다.</li>
</ol>6. NCADSCs의 지광 유도
<ol><li>80-90% 동률 및 표준 배양 조건21에서NCADSCs의 지광 분화를 유도한다.</li>
	<li>갈색 지방 흡입의 경우 먼저 배양 된 세포를 갈색 지방 흡입 매체 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 0.5 mM / L IBMX, 0.1 μM / L 덱사메타 손, 1 μM / L 로시글리타존, 10 nmol / L triiodothyronine, 10 nmol / L triiodothyronine, 10 nmol / L triiodothyronines. PBS 2x로 세포를 세척하고 신선한 매체로 대체하십시오 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 1 μM / L 로시글리타존, 10 nmol / L 트리오도티로닌, 1 μg / mL 인슐린). 이 매체를 2일마다 총 3-5배씩 변경합니다.</li>
	<li>백색 지방 흡입의 경우, 먼저 백색 지방 흡입 매체 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS, 0.5 mM / L IBMX, 0.1 μM / L 덱사메타손 및 1 μg / mL 인슐린)로 세포를 2 일 동안 치료하십시오. PBS 2x로 세포를 세척하고 신선한 매체로 대체하십시오 (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v / v PS 및 1 μg / mL 인슐린). 이 매체를 2일마다 총 3-5배씩 변경합니다.</li>
	<li>적절 한 지방 세포를 분석. 참고: PBS로 셀을 세척할 때는 부드럽게 하십시오. 차별화 된 지방 세포는 쉽게 씻을 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 연구에서는 Wnt-1 Cre+/-PVAT에서 추출된 NCADSCs의 격리, 배양 및 지방 흡입에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. RfP +ADSC를 생산하도록 설계된 Rosa26RFP/+ 형질전환 마우스. 이전 보고서에 따르면 NCADSCs 및 비 NCADSCs22에서일반적인 다능성 중간엽 줄기 세포(MSCs) 마커의 발현에 유의한 차이가 없음을 보여주고, NCADSCs는 시험관 내 지방세포로 분화할 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있음을15,22,23. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 NCADSCs는 대부분의 ADSC 연구에 적합해야 한다.
본 방법의 장점은 형질전환 NCADSCs에 내재된 형광 리포터...

비만의 보급은 심장 혈관 질병 및 당뇨병을 포함하여 관련 만성 질병의 리스크를 증가시키는 세계전반 증가하고 있습니다1. PVAT는 혈관을 포위하고 혈관 기능에서 관련시킨 내분비 및 paracrine 요인의 중요한 근원입니다. 임상 연구에 따르면 높은 PVAT 함량은 심혈관 질환2,3의독립적인 위험 인자이며, 그 병리학적 기능은 성분 지방 유래 줄기 세포(ADSCs)의 표현형에 따라 달라집니다 4.
뮤린 3T3-L1, 3T3-F442A 및 OP9과 같은 ADSC 세포주들은 지질발생 또는 지방발생을 연구하는 데 유용한 세포 모델이지만5,지질발생에 대한 조절 기전은 세포주와 1차 세포 간에 차이가 있다. 지체 성 혈관 세포 분획(SVF)에서 ADSCs는 지방 조직에서 직접 분리되고 지방세포로 분화하도록 유도되어 생체 내 지방형성 및 지방발생에서 가장 가능성이 높은 회생을유도한다 6. 그러나, 연약함, 부력 및 ADSCs의 크기 및 면역 표현형의 변화는 그들의 직접적인 격리를 어렵게 만듭니다. 또한, 상이한 절연 절차는 또한 이들세포의표현형 및 지방생성 전위 능력에 유의하여, 따라서 ADSC 무결성을 유지하는 프로토콜의 필요성을 강조할 수 있다.
지방 조직은 전형적으로 형태학적으로 및 기능적으로 구별되는 백색 지방 조직(WAT) 또는 갈색 지방 조직(BAT)8로분류되며, 이는 뚜렷한 ADSCs9를수용한다. 반면 아식스는 회항나달 및 인멸피하로부터 분리된 ADSC는 이전 연구에서특징이 있었지만9,10,11,12,BAT13으로주로 구성되는 PVAT로부터의 ADSCs에 대해서는 덜 알려져 있다.
최근 연구에서, 우리는 주경 아치 지방 조직 (PAAT)에 있는 RESIDENT ADSCs의 일부가 신경 문장 세포 (NCC)에서 파생된다는 것을 것을을 발견했습니다, ectoderm14,15에서유래하는 철새 전구 세포의 일시적인 인구. Wnt1-Cre 형질전환 마우스는 신경 문장 세포 개발16,17을추적하는 데 사용되었다. 우리는 Wnt-1 Cre+/- Wnt-1 Cre+/-생성Rosa26RFP/+ 마우스와 Wnt1-Cre + 마우스를 교차; Rosa26RFP/+ 마우스는 NCC와 그 후손이 적색 형광 단백질(RFP)으로 표시되어 생체 내 및 시험관 내15에서쉽게 추적됩니다. 여기서, 우리는 마우스 PAAT로부터 신경 문장 유래 ADSCs(NC-유래 ADSCs, 또는 NCADSCs)를 분리하는 방법을 설명하고 NCADSCs를 백색 지방세포 또는 갈색 지방세포로 분화하도록 유도한다.

<table><tbody><tr><td>4 % PFA</td><td>BBI 생명 과학</td><td>E672002-0500</td><td>Lot # : EC11FA0001</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ABCONE (중국)</td> <td>A47902</td><td>1 % 작동 농도</td></tr><tr><td>Anti-cebp /&alpha;</td><td>ABclonal</td><td>A0904</td><td>1:1000 작동 농도</td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG, HRP 연결</td><td>CST</td><td>7076</td><td>1:5000 작업 농도</td></tr><tr><td>안티 페리 핀</td><td>Abcam</td><td>AB61682</td><td>1 &mu; g/mL 작동 농도; lot # : GR66486-54</td></tr><tr><td>Anti-PPARy</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-7273</td><td>0.2 &mu; g/mL 작업 농도</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP 연계</td><td>CST</td><td>7074</td><td>1:5000 작업 농도</td></tr><tr><td>항-&beta;-Tubulin</td><td>CST</td><td>2146</td><td>1:1000 작업 농도</td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR 생명 과학</td><td>0332-100G</td><td>50 mg/mL 작업 농도; lot #: 0536C008</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4902</td><td>0.1 &마이크로; M 작업 농도</td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>R35-076-CV</td><td>50 mg/mL 작업 농도; 로트 #: R2040212FBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Gelifesciences</td><td>SH30243.01</td><td>로트 #:</td></tr><tr><td>AD20813268</td><td>IBMX Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>0.5 mM 작업 농도</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3536</td><td>1 &mu; g / mL 작업 농도</td></tr><tr><td>Microsurgical 겸자</td><td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (중국)</td> <td>MR-F201A-1</td><td></td></tr><tr><td>미세 수술 가위</td><td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (중국)</td> <td>MR-H121A</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ø1516</td><td>0.3 % 작동 농도</td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)</td> <td>ABCONE (중국)</td> <td>P41970</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토 마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 시약 키트</td><td>TAKARA</td><td>RR047A</td><td>Lot # : AK4802</td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>TAKARA</td><td>9767</td><td>Lot # : AHF1991D</td></tr><tr><td>Rosa26RFP / + 마우스</td><td>JAX</td><td>No.007909</td><td>C57BL / 6 backgroud; 남성 및 여성</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>R2408</td><td>1 &뮤; M 작업 농도</td></tr><tr><td>표준 집게</td><td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (중국)</td> <td>MR-F424</td><td></td></tr><tr><td>외과 용 가위</td><td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (중국)</td> <td>MR-S231</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR420A</td><td>Lot # : AK9003</td></tr><tr><td>Triiodothyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2877</td><td>10 nM 작업 농도</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre+; PPAR&감마; flox/flox 마우스</td><td>JAX</td><td>No.009107</td><td>C57BL/6 backgroud; 수컷과 암컷</td></tr></tbody></table>

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

혈관을 둘러싼 지방 조직의 과도 한 금액 (주위 지방 조직, 일컬어 PVAT) 심혈 관 질환의 높은 위험과 관련 된. 상이한 지방 조직에서 유래한 ADSC는 뚜렷한 특징을 나타내며, PVAT로부터의 특징은 잘 특성화되지 않았다. 최근 연구에서, 우리는 periaortic 아치 지방 조직에 있는 몇몇 ADSCs가 보고했습니다 (PAAT) 신경 문장 세포에서 내려 (NCC), ectoderm에서 유래하는 철새 세포의 일시적인 인구.
이 백서에서는 Wnt-1 Cre+/-PAAT로부터 적색 형광 단백질(RFP)으로 표지된 NCC를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. Rosa26RFP/+ 마우스 및 시험관내에서 그들의 지방분화 분화를 유도한다. 간략하게, 기질 혈관 분획(SVF)은 PAAT로부터 효소적으로 해리되고,RFP+ 신경 문장 유래 ADSCs(NCADSCs)는 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리된다. NCADSCs는 갈색과 흰색 지방 세포로 분화하고, 저온 보존 될 수 있으며 , ~ 3-5 구절에 대한 지경 잠재력을 유지합니다. 우리의 프로토콜은 시험관 내 PVAT 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 PVAT로부터 풍부한 ADSC를 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 NCADSCs는 PVAT 분화에 관여하는 분자 스위치를 연구하기 위한 귀중한 시스템을 제공할 수 있다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 5-6 Wnt-1 Cre+/-에서~ 0.5-1.0 x 106 ADSC를 얻었습니다. Rosa26RFP/+ 마우스 (48 주 오래 된, 남성 또는 여성).
마우스에서 PAAT 컬렉션의 흐름도는 그림 1에표시됩니다. NCADSCs의 형태는 다른 마우스 지방 조직으로부터의 ADSC와 유사하였다. 배양된 NCADSCs는 7-8일 의 배양 후 80-90%의 동률에 도달했으며, NCADSCs는 섬유아세포와 유사한 형태를 확장하였다(그림2B,C).
NCADSCs가 지멸 잠재력을 가지고 있음을 추가로 확인하기 위해, NCADSCs를 백색 또는 갈색 지방세포로 분화시키는 것이 유도되었다. 오일 적색 염색은 성숙한 지방세...

우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

우리의 간단하고 실용적인 방법론은 체외에서 PVAT 분리 발생을 연구하고 비만 및 관련 심혈관 질환에 대한 정상적인 약물을 테스트하기 위해 풍부한 ADSCS를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 FACS, 또는 자기 활성화 세포 분류에 대한 플루 크롬 공주 항체로 세포를 라벨링할 필요가 있는 비오틴의 NCADS의 내재된 형광이다. 이 방법은 ECtoderm에서 신경 문장 세포로부터 유래된 풍부한 ADSC를 획득하여 PVAT 증분 발생, 또는 시험관내 리포발생을 연구하는 데 사용될 수 있다.젊은 마우스를 사용하고 소작과 유도 된 송포 발생을 경험하는 것은 3T3 세포가이 프로토콜의 성공에 중요하다는 것을 의미합니다. 절차를 시연하는 것은 대학원 생인 이딩 치(Yiding Qi)와 제 실험실의 기술자인 Lian Xu가 될 것입니다. PAAT 해부의 경우 마우스 시체를 75%에탄올로 5분간 살균한 후 가위를 사용하여 복부에 피부를 잘라내고 분리합니다.복부 중간선을 골반에서 목으로 자르고 복부를 엽니다. 간을 움직이면 다이어프램을 노출시키고, 중간선 양쪽의 다이어프램과 갈비뼈를 잘라냅니다. 갈비뼈를 벗겨서 심장과 폐를 노출시합니다.그리고 폐와 흉구를 제거합니다. 대자와 하트와 함께 PAAT를 페트리 접시에 넣습니다. 그리고 대동맥 뿌리에서 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다.그런 다음 대동맥 아치와 내림차순 대동맥 사이에 잘라냅니다. 두 구조를 둘러싼 지방 조직과 왼쪽과 오른쪽 공통 경동맥을 후방 가슴 벽에서 조심스럽게 분리합니다. PAAT를 뿌리에서 분리하고 더 큰 혈관 혈관으로서 신중하게 분리하는 것이 중요하며, 혈관 벽 세포의 존재는 FACS 효율성에 영향을 미칠 수 있다.얼음 차가운 HBSS 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 조직을 놓습니다. 그리고 멸균 집게를 사용하여 가능한 한 많은 혈관과 근막을 제거하십시오. 그런 다음, 얼음에 얼음 차가운 HBSS 버퍼의 포인트 5 밀리리터를 포함하는 2 밀리리터 Eppendorf 튜브로 지방 조직을 전송합니다.PAAT가 모두 수집되면 수확한 지방 조직을 새로 준비된 소화 매체 1밀리리터를 포함하는 새로운 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그리고 조직을 다진 외과 가위를 사용합니다. 조직 슬러리를 신선한 소화 배지9밀리리터를 포함하는 50mm 튜브로 옮기.그리고 조직을 10 번 세트리술하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 균질한 용액을 얻었을 때, 튜브를 섭씨 37도에서 30~45분, 분당 100회 회전으로 배양하여 5~10분간격으로 과다소화를 방지합니다. 가벼운 노란색 균질 성 지방 조직 용액이 튜브의 부드러운 소용돌이시 관찰 할 수 있을 때, 10 %의 태아 소 혈청으로 보충 된 HDMEM의 5 밀리리터로 소화를 중지합니다.철저한 혼합 후, 원심분리기는 지방 조직 샘플을 원심분리합니다. 기질 혈관 세포 분수는 갈색 펠릿으로 볼 수 있습니다. 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 필터링한다.다른 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 적혈구 용해 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.10 분 후, PBS의 10 밀리리터에서 두 개의 원심 분리로 반응을 중지, 1 %의 태아 소 혈청으로 보충. 두 번째 원심 분리 후, 얼음에 문화 배지의 다섯 밀리리터에 펠릿을 다시 중단. 그리고 최종 원심분리로 세포를 수집한다.그런 다음, 계산을 위해 FACS 버퍼의 5밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 표준 프로토콜에 따라 FACS에 의해 격리된 후, NCADSC 배양을 설정하려면 세포를 각 우물에서 3센티미터 제곱농도로 5배 10에 배치하여 12개의 잘 배양플레이트를 배치한다. 불완전한 배양 배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 20~24시간 동안 가능합니다.다음 날, 37섭씨 PBS로 세포를 씻고, 신선한 배양 배지로 배양에 먹이를 주세요. 배양이 80~90%에 도달하면 섭씨 37도에서 3~5분 동안 잘 하면 0.25%의 트립신 EDTA2밀리리터로 세포를 치료한다. 세포가 플레이트의 바닥에서 분리되었을 때, 배양 된 배지의 2 밀리리터로 효소를 중화시키고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다.계산을 위한 신선한 배양 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 새로운 12 개의 잘 배양 플레이트에서 세포를 5 회 10 내지 제3 세포에 제곱 농도로 시드한다. 이어서, 액체 질소의 냉동 저장을 위해 10%디메틸 설옥산화물으로 보충된 배양 배지에서 남은 세포를 다시 중단한다.세포가 80~ 90%의 합류에 도달하면, 세포가 80~90%의 합류에 도달하면, 적절한 2일 동안 갈색 또는 백색 증식 유도 배지로 세포를 치료한다. 인큐베이션이 끝나면, PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 후 적절한 신선한 흡착 유도 배지를 각 우물에 추가하고, 세포를 추가로 3~5일 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 배양 된 NCADS는 문화의 7 ~ 8 일 후 80 ~ 90 %의 합류에 도달합니다.그리고 형태와 같은 확장 된 유리 섬유를 시연합니다. 그들의 비대화 잠재력을 더욱 확인하기 위해, 차별화된 NCADS의 오일 레드 스테인링은 성숙한 지방세포들을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 전형적으로, 성숙한 지방세포는 NCADSC의 60% 이상이 선화분화를 나타내는 백색 또는 갈색 유도8일 후에 관찰된다.NCADS는 합격 후 크게 감소 된 성포성 잠재력을 보여줍니다. 면역 블로팅 및 정량적 실시간 PCR은 백색 아디포겐성 유도8일 후에 인디포겐화 특이적 인 NCADSCs에서 지방분화 특이적 상대 단백질 및 유전자의 발현이 현저하게 증가한다는 것을 밝힙습니다. 유사하게, 지방세포 특이적 유전자의 발현, 및 갈색 지방세포 특이적 유전자는, 또한 갈색 아디포겐성 유도의 8일 후에 현저하게 증가합니다.대부분의 NCADSC 격리 프로토콜은 간단하고 경제적이며 항체의 사용을 요구하지 않기 때문에 IFP의 강력한 유체 강도는 FACS 영양 효율을 향상시킬 수 있습니다.

isolation-culture-adipogenic-induction-neural-crest-original-adipose

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

배우세요 대동맥 주변 지방 조직에서 신경 문장 유래 지방 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법을. 형광 표지를 활용한 FACS 분류와 지방 유도 기법으로 비만 및 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

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