Name: 식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 식물 병원균의 RNA 침묵 억제제를 신속하게 선별하는 개선된 방법을 Nicotiana bethamiana를 이용하여. 이 기술은 식물 병리학 연구에서 방어 메커니즘 이해에 필수적인 억제제 식별 효율성을 높입니다.

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이 사업은 상하이 교육개발재단과 상하이시 교육위원회의 "슈광 프로그램"의 보조금으로 지원되었으며, 중국 의 국가 핵심 R&D 프로그램( 2018YFD0201500), 중국 국립자연과학재단(제31571696호 및 31660510호), 중국 청년전문가를 위한 천인재 프로그램, 상하이시 과학기술위원회(18DZ2260500).

참고 : 절차의 모든 단계는 실온 (RT)에서 수행해야합니다.
주의: 병원성 미생물을 함유한 모든 배지와 분석에 사용된 식물 및 식물 조직을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 용기 및 오토클레이브에 보관하십시오.
1. 퍼팅 이펙터를 포함하는 플라스미드 구조의 준비
<ol><li>RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해 결정된 바와 같이 감염 중에 고도로 발현되는 분비 이펙터를 선택하고, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 기술에 의해 추가로 결정됩니다.</li>
	<li>SignalP18과같은 소프트웨어 도구를 사용하여 각 이펙터의 신호 펩타이드 절단 부위를 결정합니다.</li>
	<li>프라이머를 설계하고 PCR을 수행하여 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 관심 있는 이펙터를 코딩하는 유전자를 증폭시한다. 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 PCR 생성물 확인후, 응찰이 없는 클로닝키트(표)를이용하여 pQBV3 게이트웨이 진입 벡터로 앰플리콘을 복제한 후, 이어서 LR 재조합반응(19)을이용하여 대상 발현 벡터 pEG100으로 들어간다.</li>
	<li>LR 반응 혼합물의 3-5 μL을 유능한 대장균 세포(예: TOP10, DH5α)의 100 μL로 변환하고, 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 한천 배지상에 형질전환된 세균 세포를 확산시키고, 16−20시간 동안 37°C에서 배양한다. 참고 : 포지티브 형질전환제는 콜로니 PCR20으로 식별될 수 있으며 플라스미드 미니프렙 및 시퀀싱으로 추가 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>화학적으로 유능한 A. tumefaciens 세포 (예 : GV3101 또는 C58C1)의 100 μL에 이펙터 단백질을 운반하는 재조합 플라스미드 50-100 ng를 도입한 다음 액체 질소를 1 분 동안 얼린 다음 37 °C 수조에서 세포를 5 분 동안 녹입니다.</li>
	<li>LB 국물 500 μL을 넣고 30°C에서 4-6시간 동안 부드럽게 흔들어 서 배양한 다음, 50 μg/mL 카나마이신과 30°C에서 30 μg/mL 리팜피신을 보충한 LB 한천 배지에 모든 농균 세포를 옮기고 퍼우습니다. 참고 : 포지티브 클론은 식민지 PCR에 의해 확인 될 수있다.</li>
	<li>달리 지시하지 않는 한 농업 침투 실험에 단일 변형 된 식민지를 사용하십시오. 참고: 본 연구에서, 테스트된 이펙터 유전자 중 어느 것도 예측된 인트론을 포함하지 않는다; 각각의 유전자는 피토프토라 소재분리의 게놈 DNA로부터 직접 증폭되었다. 태그가 없는 게이트웨이 식물 식 벡터를 사용하는 것이 좋지만 필수는 아닙니다.</li>
</ol>2. N. 벤타미아나 16c 식물의 준비
<ol><li>(부피) 50% 토탄 이끼, 30% 펄라이트, 20% 버미쿨라이트로 구성된 포팅 토양 혼합물을 준비하고, 20분 동안 120°C에서 오토클레이브를 준비한다.</li>
	<li>오토클레이브 토양 혼합물을 식물 비료 용액 (1 g / L)과 담그고 더 큰 트레이 (540mm x 285mm x 60mm)에 보관된 작은 냄비 (80mm x 80mm x 75mm)에 하위 포장하십시오.</li>
	<li>N. 벤타미아나 16c의 씨앗을 각 냄비의 토양 표면에 뿌리세요. 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 씨앗이 발아할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>트레이를 23-25°C, 50-60% 상대 습도 및 장시간 포토기간(130-150 μEm~2s-1)의온도로 가볍고 온도가 제어되는 성장 챔버 아래에 놓습니다.</li>
	<li>종자 발아 후 플라스틱 돔을 꺼내 (3−4 일) 모종은 발아 단계에 사용되는 동일한 조건에서 성장 할 수 있도록.</li>
	<li>적당한 양의 물을 첨가하여 토양을 촉촉하게 유지하면서 2-3 일마다 담그지 마십시오. 추가 성장을 촉진하기 위해 10 일마다 비료를 추가하십시오. 그들은 사용할 준비가 될 때까지 정상적인 조건에서 N. 벤타미아나 16c 식물을 유지; 이 단계에서 식물은 적어도 다섯 완전히 개발 진정한 잎과 눈에 보이는 차축 이나 꽃 봉오리가 있어야하며, 잎은 건강한 녹색 외관을 가져야한다).</li>
	<li>국부적인 RNA 침묵 분석에 N.benthamiana 16c의 3-4 주 된 잎을 사용하고, 젊은 N. 벤타미아나 16c 식물 (10-14 일) 전신 RNA 침묵 분석. 참고: 공장 성장 조건 및 시설은 실험실마다 다릅니다. 침투를 위해 건강하고 잘 발달된 완전히 확장된 잎을 선택하십시오.</li>
</ol>3. 침투를 위한 아그로박테리움 문화의 준비
<ol><li>LB 플레이트에서 양성 콜로니를 선택하고 50 μg/ mL 카나마이신 및 50 μg/mL 리팜피신을 보충한 LB 배지 5 mL을 함유한 유리 튜브에 세포를 접종합니다. 24-48 시간 동안 200 rpm에서 흔들어 30 °C에서 세포를 성장시.</li>
	<li>동일한 항생제로 보충된 LB 배지의 5 mL, 10 mM2-(N-morpholino) 에탄설포닉산(MES; pH 5.6) 및 20 μM 아세토시링곤(AS)으로 배양 100 μL을 옮니다. 16-20 h에 대 한 200 rpm에서 동요와 30 °C에서 박테리아를 성장.</li>
	<li>4,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리 세포를 부어 상구체를 붓고 10 mM MgCl2 버퍼의 2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>3.3 단계를 반복하여 항생제를 완전히 제거하십시오.</li>
	<li>600 nm(OD 600)에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의밀도를결정한다. 10 mM MgCl2 버퍼로 1.5-2.0의 OD600으로 조정합니다.</li>
	<li>최종 현탁액 배양에 10 mM MES(pH 5.6) 및 150 μM AS를 추가하고 흔들림 없이 RT에서 적어도 3시간 동안 세포를 배양한다. 참고: 최종 정지 문화를 하룻밤 동안 두지 마십시오.</li>
</ol>4. 공동 침투 N. 벤타미아나 잎
<ol><li>35S-GFP를 함유하는 아그로박테리움 배양체와 35S-오이 모자이크 바이러스 억제기 2b(CMV2b), 퍼팅 이펙터 또는 빈 벡터(EV)를 포함하는 아그로박테리움 배양과 동일한 부피를 혼합한다.</li>
	<li>N. 벤타미아나 16c 잎의 축측에 혼합 된 아그로 박테리움 현탁액을 1 mL 바늘없는 주사기를 사용하여 조심스럽게 천천히 침투시다.</li>
	<li>부드러운 티슈 와이퍼로 잎에서 남은 세균 현탁액을 제거하고 침입자 패치의 여백을 메이커 펜으로 동그라미를 친다.</li>
	<li>동일한 성장 조건하에서 성장 챔버에 침투 식물을 둡니다. 참고: 안전및 건강상의 이유로, 침윤 시 보호 용 눈 고글과 마스크를 착용해야 합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 장갑을 침투 사이에 에탄올로 교체하거나 살균해야 합니다. 일반적으로 적어도 1 잎 당 agrobacterium 현탁액의 mL 침투에 필요한. 전신 침묵의 경우, 침투를 위해 적어도 두 개의 잎이 필요합니다.</li>
</ol>5. GFP 화상 진찰 분석
<ol><li>새로 자란 식물의 새로 자란 잎에서 GFP 형광을 시각적으로 검출2 주 후 침투 (전신 RNA 침묵) 또는 잎의 침투 패치 3−4 dpi 잎 수집없이 긴 파자외선 (UV) 램프를 사용하여.</li>
	<li>UV 및 노란색 필터가 장착된 디지털 카메라로 수집된 식물 및/또는 분리된 잎을 촬영합니다. 참고 : 국소 침묵 억제의 분석의 경우, N. 벤타미아나 16c 잎의 침투 패치를 조사, 반면 전신 침묵 억제 활동에 대한, 새로 재배 된 잎을 조사. RNA 침묵 억제 활성은 개별 이펙터에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 3 dpi에서 시작하여 며칠 동안 패치 또는 잎을 관찰하십시오. CMV2b와 EV를 각각 양수 및 음성 대조군으로 사용합니다.</li>
</ol>6. 침투 된 잎에서 GFP mRNA 수준의 북부 얼룩 분석
<ol><li>RNA 분리 시약을 사용하여 잎 조직에서 총 RNA의 분리(재료 표)<ol>
<li>4-7 dpi에서 침투 N. benthamiana 16c 패치에서 잎 조직을 수집, 미세 분말에 액체 질소에서 분쇄, 멸균 2 mL 튜브에 분말을 전송.</li>
		<li>RNA 분리 시약(1 mL/100 mg 조직)을 후드의 샘플링 튜브에 즉시 추가하고, 균질화하기 위해 힘차게 흔들고, RT에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>후드의 각 튜브에 클로로폼 (200 μL/ 1 mL RNA 분리 시약)을 추가하고, 15 s를 위해 힘차게 흔들고, 5 분 동안 RT에서 배양하십시오. </li>
		<li>상급체를 새로운 RNase 가없는 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 상급체에 0.7 부량의 이소프로판올을 넣고 부드럽게 여러 번 반전시키고 RT에서 혼합물을 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 15 분 동안 12,000 x g에서 원심 분리에 의해 RNA 펠릿을 침전시.</li>
		<li>상급제를 버리고 펠릿을 70 % 에탄올로 씻고 펠릿을 후드에 공기 건조시십시오. RNA를 디에틸 파이로카보네이트(DEPC) 처리된 물에 10-20분 동안 65°C 수조에서 배양하여 용해시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>침투 된 잎에서 GFP mRNA 수준의 북부 얼룩 분석<ol>
<li>1x MOPS 실행 완충액에서 아가로즈 겔을 분해하는 1.2% 포름알데히드를 준비한다.</li>
		<li>RNA 1:1을 RNA 로딩 염료와 혼합하고 65°C에서 10분 동안 배양하여 변성한 후, 변성된 샘플을 얼음 위에 1분 동안 즉시 식힙니다.</li>
		<li>RNA가 잘 분리될 때까지 50분 동안 겔 및 전기 포어에 샘플을 100V로 로드합니다.</li>
		<li>젤을 20x 식염수-구연산나트륨(SSC) 완충액으로 헹구어 포름알데히드를 제거하고 밤새 20x SSC 버퍼에서 모세관 전달에 의해 나일론 멤브레인으로 겔을 옮긴다. 2x SSC에 멤브레인을 담그고 젖은 막을 UV 가교에 노출시켜 멤브레인에 RNA를 고정시킵니다.</li>
		<li>적절한 양의 혼성화 버퍼를 추가(100 cm2 멤브레인당 10 mL; 재료 표) 혼성화 튜브에 넣고 60°C에서 교반하여 혼성화 오븐에</li>
		<li>멤브레인을 혼성화 튜브에 넣고 60°C에서 60분 동안 배양합니다. 미리 온난한 혼성화 완충액을 함유하는 혼성화 용액에 5'DIG 라벨이 붙은 DNA 프로브(최종 농도, 50 ng/mL)를 희석합니다.</li>
		<li>프리혼성화 버퍼를 폐기하고 즉시 DIG 라벨이 부착된 프로브를 포함하는 미리 웜된 하이브리드화 솔루션으로 교체합니다. 부드러운 교반과 함께 밤새 60 °C에서 프로브로 블롯을 배양합니다.</li>
		<li>혼성화 후, 멤브레인을 각각 20분 동안 60°C에서 증가시완충으로 2회 세척한다. 멤브레인을 부드럽게 닦아 여분의 세척 버퍼를 제거하고 화학 발광 혼성화 및 검출 키트(재료 표)에서제안 된 시약을 추가하십시오.</li>
		<li>이미징 시스템과 결합된 화학 발광 반응에 의한 혼성화된 신호를 감지합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

RNA 침묵은 바이러스성, 세균성, 난균체 및 곰팡이 병원균에 대처하기 위해 식물에 의해 사용되는 주요 방어 메커니즘입니다. 차례로, 이들 미생물은 항바이러스 침묵을 중화하기 위해 침묵 억제 단백질을 진화시키고, 이들 RSSs는 RNA 침묵 경로22,23의상이한 단계를 방해한다. RSSS10을확인하기 위해 여러 스크리닝 검거가 개발되었습니다.
여기서, 우리는 P. sojae에 의해 분비된 이펙터 단백질을 숙주에서 RNA 침묵을 억제하는 그들의 능력에 대한 감염 시 숙주 세포내로 분비하는 개선된 프로토콜을 설명한다. 이 수정된 분석은 바이러스성 공동 침투 분석에 기초하지만 몇 가지 중요한 방법으로 다릅니다. 첫째, 박테리아와 N.benthamiana 16c 식물 모두 활발하고 건강해야합니다. 이것은 박테...

지난 2년간 식물 질환을 유발하는 미생물의 게놈 염기서열 분석이 가속화되면서 서열 정보와 인코딩된 단백질의 생물학적 기능 사이의 지식 격차가 계속 증가하고 있다1. 시퀀싱 프로젝트에 의해 밝혀진 분자 중에는 선천성 면역을 억제하고 숙주 식민지화를 촉진하는 이펙터 분자가 있습니다. 이 요인은 박테리아, 선충 및 필라멘트 미생물을 포함하여 파괴적인 식물 병원체에 의해 분비됩니다. 이러한 위협에 대응하기 위해 숙주 식물은 이러한 이펙터를 인식하는 새로운 수용체를 진화시켜 면역 반응을 회복시냅니다. 따라서, 이펙터는 병원체 계보 중 이펙터 레퍼토리의 다양화로 이어지는 다양한 선택적 압력의 대상이 된다2. 최근 몇 년 동안, 식물 병원균에서 putative 이펙터는 신호 경로의 dysregulation, 전사, 세포 내 수송, 세포 내 수송, 소포 인신 매매 및 RNA silencing3,4,5를포함하여 다양한 방법으로 미생물에 혜택을 호스트 세포 프로세스를 방해하여 식물 선천적 면역을 방해하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 병원체 이펙터의 대다수, 특히 필라멘트 병원체에서 그, 수수께끼 남아 있다.
RNA 침묵은 진핵생물 사이에서 보존되는 상동성 중재한 유전자 불활성화 기계입니다. 이 과정은 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 트리거되고 상동성 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 서열특이적 방식으로 표적으로 하며, 항바이러스 방어6을포함하는 광범위한 생물학적 과정을 조작한다. 호스트의 타고난 면역 반응을 극복하기 위하여는, 몇몇 바이러스는 세포내 구획 안쪽에 복제하거나 침묵 개편된 신호에서 탈출하는 기능을 포함하여 RNA 침묵을 상쇄하기 위하여 발전했습니다. 그럼에도 불구하고, 바이러스가 유전자 기능의 RNA 침묵 의존적 손실에 대하여 그들의 게놈을 보호하는 가장 일반적인 전략은 RNA 침묵7,8을억제하는 특정 단백질을 인코딩하는 것이다. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양, 이식 및 세포 배양 을 발현하는 형질전환 식물의 공동 침투를 포함하여 RNA 침묵(VSRs)의 바이러스 억제제를 스크리닝하고 특성화하기 위해 여러 기계적으로 다른 접근법이 확립되었다9,10,11,12,13.
이러한 각 연구는 장점과 단점을 가지고 있으며, 그 자체로 VSR을 식별합니다. 가장 일반적인 접근법 중 하나는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S의 통제 하에 GFP를 구성하는 니코티아나 벤타미아나 16c 식물에 잠재적인 바이러스 단백질 및 리포터 유전자(전형적으로 녹색 형광 단백질 [GFP])를 품고 있는 개별 A. tmuefaciens 배양물의 공동 침윤에 기초한다. 활성 바이러스 침묵 억제제의 부재에서, GFP는 숙주 세포에 의해 외인성으로 확인되고 침투 후 3일 이내에 침묵된다(dpi). 대조적으로, 바이러스 성 단백질이 억제 활성을 가지고 있다면, GFP의 발현 수준은 3−9 dpi9를넘어 꾸준히 유지됩니다. 이 공동 침투 분석은 간단하고 빠릅니다. 그러나 매우 안정적이지도 않고 민감하지도 않습니다. 그럼에도 불구하고, 분석은 많은 RNA 바이러스7,8에서다양한 단백질 서열 및 구조를 가진 수많은 VSR을 확인하였다.
최근에는 세포RNA 침묵 활성을 억제할 수 있는 여러 가지 이펙터 단백질이 세균, 오미세테 및 곰팡이 식물 병원균14,15,16으로특징지어지고 있다. 이 사실 인정은 RNA 침묵 억제가 대부분의 왕국에 있는 병원체에 의해 이용되는 감염을 촉진하기 위한 일반적인 전략이다는 것을 암시합니다. 이론적으로, 많은, 전부는 아니지만, 이펙터의 RNA 침묵 억제기를 인코딩 할 수있다 (RSSs); 그러나 현재까지 는 신뢰할 수 있고 일반적인 선별 전략의 부족으로 인해 소수의 사람만이 확인되었습니다. 더욱이, RNA 침묵의 억제제는 식물병원체(17)의대다수에서 조사되지 않았다.
이 보고서에서는 농업 침투 분석을 사용하여 국소 및 전신 RNA 침묵을 억제할 수 있는 식물 병원균 이펙터를 식별하기 위한 최적화되고 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 이 연구의 가장 중요한 목적은 프로토콜의 주요 측면을 강조하고 단계를 상세히 설명함으로써 식물 병원균의 거의 모든 이펙터에 적합한 스크리닝 분석기를 제공하는 것이었습니다.

<table><tbody><tr><td>2-모르폴리노에탄술폰산(MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>2xTaq 마스터 믹스</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS 버퍼</td></tr><tr><td>아세토시링곤(AS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D134406-5G</td><td>아그로박테리움</td></tr><tr><td>한천</td> <td>유도Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>전기영동</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern 블롯</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>카메라</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>사진</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학 발광 감지 모듈 dafa 키트의 구성 요소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>발광 감지</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>ClonExpress II 원스텝 클로닝 키트</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>결찰</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>시그마-알드리치</td><td>11603558001</td><td>하이브리드화 버퍼</td></tr><tr><td>Easypure 플라스미드 Miniprep 키트</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>플라스미드 추출</td></tr><tr><td>EasyPure 퀵 젤 추출 키트</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>젤 추출</td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨 염 이수화물</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS 완충기</td></tr><tr><td>전기 이동법 전력 공급</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>핵산 전기 이동법.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>벡터 소화</td></tr><tr><td>젤 이미지 시스템</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>이미지</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>항생제</td></tr><tr><td>LR Clonase II 효소</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>LR 반응</td></tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 블로팅 멤브레인 0.45um</td><td>GE 헬스케어</td><td>10600002</td><td>북부</td></tr><tr><td>NORTH2south 비오틴 랜덤 프라임 DNA 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>비오틴 라벨링</td></tr><tr><td>PCR 열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>이탄 이끼</td><td>PINDSTRUP</td><td>다크 골드 + 점토</td><td>식물</td></tr><tr><td>Peters 수용성 비료</td><td>ICE</td><td>Peter Professional 20-20-20</td><td>비료</td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA 중합효소</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>효소</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>항생제</td></tr><tr><td>RNA 겔 로딩 염료 (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>RNA 겔 로딩 염료</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 수화물</td><td>Amresco/VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS 버퍼</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrate</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC 완충액</td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>RNA 절연 시약</td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>관찰</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker 오븐</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Northern</td></tr></tbody></table>

식물 병원균의 분비 이펙터에서 rna 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA 침묵은 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된, 서열 특정 유전자 규칙 기계장치입니다. 몇몇 식물 병원체는 숙주 식물 RNA 침묵 통로를 억제하는 기능을 가진 단백질을 진화했습니다. 바이러스 이펙터 단백질과 는 달리, 단지 몇몇 분비 이펙터 단백질은 세균, 오미세테 및 곰팡이 병원체에서 RNA 침묵을 억제하는 능력을 보여주었으며, 대부분의 이펙터의 분자 기능은 크게 알려지지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 RNA 침묵을 관찰하고 식물 병원체에 의해 분비되는 이펙터 단백질을 특성화하는 일반적인 방법으로 작용할 수 있는 병입 분석법의 약간 변형된 버전을 상세히 기술한다. 접근법의 주요 단계는 건강하고 완전히 발달된 잎을 선택하고, 박테리아 배양을 600 nm에서 적절한 광학 밀도(OD)로 조정하고, 침윤에 대한 최적의 시간에 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 관찰하는 것입니다. 억제 활동이 약한 이펙터를 생략하지 않도록 합니다. 이 향상된 프로토콜은 RNA 침묵 억제제의 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝에 기여하고 이러한 단백질의 분자 기능을 조사하기 위한 훌륭한 출발점역할을 할 것입니다.

상술한 바와 같이, P. 소재 RxLR 이펙터의 RSS 활성을 평가하기 위한 개선된 스크리닝 분석에 대한 단계별 절차를 설명한다. 전부, 실험은 5-6 주가 걸립니다. 이어서, 분석에 의해 확인된 RSSs는 기능 및 분자 메커니즘의 측면에서 더욱 특징화될 수 있다. 우리의 접근의 일보기로, 우리는 감염 도중 haustoria를 통해서 분비되고 전달되는 RNA 침묵 1 (PSR1)의 P. sojae RxLR 이펙토 피토프토라 억제기를 사용했습니다.
PSR1이 RSS 활성을 가지고 있고 이 방법에 따라서 적합하다는 것을 확인하기 위해, 각각의 변형된 아그로박테리움 균주는 35S-GFP를 항하는 균주와 혼합하고 N. 벤타미아나 16c의 잎으로 침투하였다. EV 및 CMV2b는 각각 음극 및 양성 대조군으로 사용하였다(도<...

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

이 방법은 식물 병원체에 의해 분비된 RNA 침묵 억제제를 검열하는 방법에 대한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 침묵 억제제 식별에 대한 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝 분석법을 제공하는 것입니다. 20분 동안 120도에서 50%의 토탄 이끼, 30%의 펄라이트, 20%의 버미쿨라이트 및 오토클레이브로 구성된 포팅 토양 믹스를 준비합니다.오토클레이브 토양 믹스를 식물 비료 용액과 리터당 1그램에 담그고 더 큰 트레이에 저장된 작은 냄비에 서브패키지로 넣습니다. 니코티아나 베타미안나 16c의 한두 씨앗을 각 냄비의 토양 표면에 뿌리세요. 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 씨앗이 발아하도록 합니다.트레이를 23~25도, 상대 습도 50~60%, 장시간 광등도의 온도 조절된 성장 챔버 아래에 놓습니다. 3~4일 후에 씨앗이 발아됩니다. 플라스틱 돔을 벗고 발아 단계에 사용되는 것과 동일한 조건에서 모종이 성장할 수 있도록 하십시오.2~3일마다 적당량을 추가하여 토양을 촉촉하게 유지하지만 담그지 않도록 합니다. 10일마다 비료를 추가하여 추가 성장을 촉진합니다. 니코티아나 베타미안아나 16c 식물을 정상적인 조건에서 유지하면 식물이 눈에 보이는 축또는 꽃봉오리가없는 적어도 5 개의 완전한 진정한 잎을 가지고 잎은 건강한 녹색 모양을 가지고 있습니다.전신 RNA 침묵 분석에 10-14일 된 니코티아나 벳타미안16c 식물을 사용하고 현지 RNA 침묵 분석에 니코티아나 벳하미안나 16c의 3~4주 된 잎을 사용하십시오. 팁을 사용하여 LB 플레이트에서 양성 식민지를 선택하고 셀을 LB 배지 5밀리리터를 포함하는 유리 튜브에 밀리리터 카나마이신 당 50 마이크로그램과 밀리리터 리팜피신 당 50 마이크로그램을 함유한 유리 튜브로 접종하십시오. 24 ~48 시간 동안 200 RPM에서 흔들어 30섭씨에서 세포를 성장시다.배양금 100마이크로리터를 동일한 항생제로 보충한 LB 배지 5밀리리터, pH 5.6의 밀리모어 MES 10개, 마이크로몰라 AS 20개소로 이송한다. 16~20시간 동안 200RPM에서 30도에서 박테리아를 성장시다. 세포를 4, 000배에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 10 밀리머 마그네슘 염화물 완충제의 두 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다.항생제의 완전한 제거를 보장하기 위해 세척을 반복합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의 밀도를 결정한다. 10 밀리머마그네슘 염화물 완충제로 세포 배양을 1.5 ~2.0의 OD 600으로 조정한다.최종 현탁액 배양에 pH 5.6 및 150 마이크로몰러 AS에 10 밀리모어 MES를 추가하고 흔들림없이 적어도 3 시간 동안 실온에서 세포를 배양합니다. 35S 녹색 형광 단백질을 함유한 Agrobacterium 배양의 동일한 볼륨을 35S 오이 모자이크 바이러스 억제기 2b, 퍼티티 이펙터 또는 빈 벡터를 함유한 Agrobacterium 배양과 혼합합니다. 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용하여 니코티아나 벳타미안 16c 잎의 축축 측면에 혼합 된 Agrobacterium 현탁액에 신중하고 천천히 침투합니다.연조직 물티슈로 잎에서 남은 세균 현탁액을 제거하고 마커 펜으로 침투패치의 여백을 동그라미로 만듭니다. 3~4일 후, 긴 파 자외선 램프를 사용하여 잎의 침투 패치에서 GFP 형광을 시각적으로 감지합니다. 2 주 후 침투, 전신 RNA 침묵에 대 한 전체 식물의 새로 성장 된 잎을 감지 하는 램프를 사용 하 여.4~7일 후 잎 조직에서 총 RNA를 분리하려면 침투한 니코티아나 베타미안나 16c 패치로부터 잎 조직을 박격포로 수집한다. 액체 질소를 박격포에 넣고 조직을 연삭 막대로 미세 한 분말로 갈아서 분말을 멸균 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 즉시 RNA 격리 시약을 100 밀리리터 당 1밀리리터의 부피에 후드의 샘플 튜브에 추가하고, 소용돌이를 적극적으로 균일하게 하고, 실온에서 5분 동안 배양한다.RNA 격리 시약 1밀리리터당 200 마이크로리터의 부피에 클로로폼을 후드의 각 튜브에 넣고 15초 동안 격렬하게 흔들고 실온에서 5분간 배양합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 배 g에서 동종. 상체를 새로운 RNase 가 없는 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기합니다.상체에 0.7부분량의 이소프로판올을 넣고 여러 번 부드럽게 반전시키고 실온에서 10분 동안 혼합물을 배양합니다. RNA 펠릿을 12, 000배 g에서 섭씨 4도에서 15분간 경전적으로 침전시합니다. 상부체를 폐기합니다.펠릿을 70% 에탄올로 씻고 후드에 펠릿을 건조시키십시오. RNA를 다이틸 파이로카보네이트처리수에 10~20분 동안 섭씨 65도의 수조로 배양하여 용해하십시오. GFP 메신저 RNA 수준의 북부 블롯 분석을 수행하기 위해 1X MOPS 실행 버퍼에서 1.2%포름알데히드 분해 식 아가로즈 젤을 준비한다.RNA를 RNA 로딩 염료와 1대 1로 혼합하고 10분 동안 65도에서 잠복하여 RNA를 변성시한다. 즉시 1 분 동안 얼음에 변성 샘플을 냉각. 파이펫을 사용하면 RNA가 잘 분리될 때까지 100볼트에서 젤 및 감전의 우물에 샘플을 50분 간 적재합니다.포름알데히드를 제거하기 위해 20배 식염수 나트륨 완충제로 젤을 헹구는다. 20배 식염수 나트륨 구연산 버퍼, 종이 타월 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 젤 1층, 나일론 막 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 마른 Whatman 종이 2층, 유리 판 1개 및 무게를 설정하여 하룻밤 사이에 모세관 이송을 수행합니다. 아침에, 젤내의 RNA는 나일론 막으로 옮겨집니다.구연산 나트륨 2X에 멤브레인을 담그고 젖은 멤브레인을 UV 교차 링크에 노출시킴으로써 RNA를 막에 고정시킵니다. 원고에 따라 진행합니다. 3~4주 된 니코티아나 베타미안나 16c 식물의 완전히 발달된 잎은 35S GFP를 운반하는 아그로바테리움 혼합물로 패치에 공동 침투했습니다.4일 후 침투후, 침투된 부위의 GFP 형광은 자연광과 긴 파도 자외선 아래에서 이미지화되었다. 북부 블롯은 GFP 메신저 RNA가 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 EV를 표현하는 잎보다 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 35S PSR1을 표현하는 잎에서 더 높은 축적된 것으로 나타났다. 아그로인침 분석은 2주 된 니코티아나 베타미안나 16c 묘목의 잎에 침묵 신호의 확산을 평가하기 위해 수행되었다. 14일 만에 침투 후 EV의 98% 이상이 전신 잎에 명백한 GFP 신호를 보이지 않았습니다.CMV2b와 PSR1 모두 침묵 신호의 전신 확산을 효율적으로 억제하는 반면. GFP 형광은 공동 침투 식물의 약 80 %에서 관찰되었으며, 새로 나타난 잎에 몇 개의 붉은 정맥만있는 침투 식물의 나머지 20 %에서 관찰되었습니다. 이 기술은 많은 식물 병원체에 의해 분비된 새로운 RNA 침묵 억제제를 확인하는 연구원을 위한 도로를 포장합니다.식물과 적절한 OD의 조합은이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것입니다. 이 절차에 따라, RNA 침묵 억제제의 기능적 특성화는 이러한 억제제가 숙주 RNA 침묵을 누르는 방법과 출력의 메커니즘을 탐구하기 위해 수행 될 수있다. 식물에 침투할 때 안전 고글을 착용하고 모든 실험 단계에서 라텍스 장갑을 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

출처: Shi, J. 외. 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 확인. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 Nicotiana benthamiana 16c에서 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과 단백질을 규명하기 위한 공동 침투 분석 방식을 보여줍니다. 형광 리포터와 후보 효과기 유전자가 아그로박테리움 을 통해 식물 잎에 전달됩니다. 일반적으로 RNA 침묵은 보고자 전사체를 분해하여 형광을 감소시킵니다. 억제 효과기가 이 반응을 차단하여 형광을 보존합니다. 이 분석법은 숙주 방어를 방해하는 미생물 효과자를 빠르고 시각적으로 스크리닝하는 방법을 제공합니다.

식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

여기, 우리는 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA "ubiquitome"화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

업데이트된 식물 miRNA 기준과 철저한 알고리즘을 갖춘 생물정보학 파이프라인, 즉 miRDeep-P2(짧은 경우 miRDP2)는 식물의 microRNA 전사체, 특히 복잡하고 큰 게놈이 있는 종의 경우 정확하고 효율적으로 분석할 수 있습니다.

식물의 MicroRNA 전사체를 정확하고 효율적으로 분석하는 생물정보학 파이프라인

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

우리는 애기장대 식물의 잎 표면과 아포라스트에서 세포외 RNA를 분리하는 간단하면서도 재현성이 높은 방법을 설명합니다.

애기장대 로제트를 이용한 잎 표면 및 아포플라스틱 RNA의 분리 및 분석에 대한 단계별 가이드

학습하세요 식물 병원균의 RNA 침묵 억제제를 신속하게 선별하는 개선된 방법을 Nicotiana bethamiana를 이용하여. 이 기술은 식물 병리학 연구에서 방어 메커니즘 이해에 필수적인 억제제 식별 효율성을 높입니다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

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