Name: 병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 병렬 반응 모니터링을 이용한 유비퀴틴 연쇄 토폴로지 정량 분석 방법을. 이 기술은 질량 분석 기반 표적 프로테오믹스로 특정 펩타이드 식별 및 정량화에 활용됩니다.

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저자는 대표 결과에 설명된 대로 MG-132의 처리를 가진 세포 펠릿의 창조에 있는 그녀의 도움에 대한 셀린 지티를 감사하고 싶습니다 및 프로토콜에 사용된 E. coli 펠릿의 그녀의 제공을 위한 Elise Mommaerts.

1. 무거운 펩타이드 표준의 준비
<ol><li>공급 업체및 구입 한 무거운 펩 티드의 품질에 따라, 무거운 펩 티드 희석 될 필요가 있을 것 이다. 이 프로토콜은 표 1에서보고된 펩티드 서열을 사용했으며, C-말단 아미노산은 리신(13 C615N2-lysine)또는 아르기닌(13 C615N4-아르기닌)으로변형되었다.<ol>
<li>무거운 펩티드를 혼합하여 50% 아세토닐릴(ACN)으로 혼합하여 10μM에서 각 펩타이드와 펩타이드 믹스를 만듭니다.</li>
		<li>펩티드 믹스의 알리쿼트를 만들고 -80°C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>샘플 리시스 참고: 유비퀴틴 체인의 안정성은 시료 준비 중에 고려해야 합니다. 생물학적 샘플과 버퍼를 4°C에서 냉각시키고 가능한 한 빨리 유비퀴틴 안정화 버퍼에 샘플을 추가합니다.<ol>
<li>1M NH4HCO3(중탄산암암염) 용액을 물에 준비하고 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정한다.</li>
		<li>물에 200mM N-ethylmaleimide (NEM)의 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>50mM NH4HCO 3/10m NEM에서 8M 우레아를 이용한 유비퀴틴 안정화 버퍼를 준비하십시오. 참고: 8M 우레아의 5mL 용액은 우레아가 있는 포화 용액에서 물의 팽창을 감안할 때 5mL 미만의 물이 상당히 필요합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 버퍼를 준비하지 마십시오.</li>
		<li>단백질의 0.5 μg/μL을 목표로 하는 유비퀴틴 안정화 완충제에서 조사되는 생물학적 샘플을 재중단하고 시료에 적합한 방법으로 세포를 용인한다. SFX 150 브랜슨 소니피어가 70% 강도로 설정된 3개의 10s 펄스로 구성된 초음파 처리 방법은 각 펄스 사이의 얼음에 10초의 브레이크를 사용하여, 이 프로토콜의 세포주에 사용되었다.</li>
		<li>원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.</li>
		<li>상신단백질을 신선한 저단백질 결합 마이크로센심분리기 튜브로 전달합니다. 필요한 경우 이 시점에서 샘플을 -20°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 및 제어 준비
	<ol>
<li>시료가 동결되면, 우레아를 빠르게 용해하기 위해 해동하는 동안(예: 열믹서와)를 혼합합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오.</li>
		<li>원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.</li>
		<li>20 μg의 시료를 신선한 저결합 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 유비퀴틴 안정화 버퍼로 부피를 50 μL로 조정합니다.</li>
		<li>유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피를 사용하여 음수 컨트롤을 만듭니다. 이 샘플에서는 각 펩타이드의 가벼운 버전이 없어야 하므로 스파이크인 무거운 펩타이드에서 발생하는 빛 오염을 관찰할 수 있습니다. 이러한 음수 제어는 섹션 3.1에 설명된 PRM의 보존 시간 스케줄링에도 사용되었습니다.</li>
		<li>유비퀴틴 안정화 버퍼와 유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피에 상용 체인 유형을 추가하여 양수 제어를 만들었습니다. 일반적으로 K63, K48 및 M1을 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과 K48, K63, M1의 20ng가 활용되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>감소, 알킬레이션 및 소화
	<ol>
<li>물에 50mM 암모늄 중탄산염(NH4HCO3)의용액을 준비하고 1M NaOH로 pH = 8로 샘플을 조정한다.</li>
		<li>LB 국물에서 자란 대장균의 배양은 5분 동안 5,000 x g의 원심분리되어 펠릿을 형성했으며, 그 후 PBS로 2배 세척한 후 유비퀴틴 안정화 버퍼에서 5μg/μL로 재서스펜션을 했다.</li>
		<li>각 샘플 및 제어에 대장균 리세이트 1 μg를 추가합니다. 이 프로토콜은 대장균(DH10B)을 사용하지만 유비퀴틴이 없는 복잡한 용해재를 사용할 수 있습니다. 유비퀴틴은 모든 진핵생물에게 일반적입니다. 참고: 대장균 용해 매트릭스를 사용하면 플라스틱 제품에 대한 비특이적 접착으로 인한 펩티드의 손실이 줄어듭니다. 이는 단백질 함량이 제한된 음수 조절 또는 샘플에서 특히 두드러지며 K6312의관측에 강한 영향을 미친다.</li>
		<li>MS 급수에서 500mM 트리스(2-carboxyethyl)의 포스핀(TCEP)의 용액을 준비한다(DTT는 대안으로 사용될 수 있음).</li>
		<li>TCEP를 최종 농도 50mM에 추가하여 샘플 및 컨트롤을 줄입니다. 소용돌이는 실온 (RT)에서 30 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양합니다. DTT를 사용하는 경우 온도는 50 °C로 상승해야합니다. 주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오.</li>
		<li>NH4HCO3에서550mM 클로로아세타미드(CAA)의 용액을 준비한다. 어둠 속에서 보관하십시오.</li>
		<li>55mMM의 최종 농도에 CAA를 추가하여 샘플 및 컨트롤을 알킬레이트합니다. 소용돌이는 어둠 속에서 RT에서 20 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양했습니다. 참고: CAA는 -GG 수정(114.0429)13으로오인되는 리신 잔류물에서 이중 카르바미도메틸 수정(114.0429)의 가능성을 감소시키는 환원제로 요오도아세타미드 대신 사용된다.</li>
		<li>단백질 함량에 대한 1:25 (w/w) 비율로 샘플에 내분펩티다아제 LysC를 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>50mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)의 200 μL로 샘플 및 컨트롤을 희석시 희석시.</li>
		<li>단백질 함량에 대한 비율1:25에서 샘플에 트립신을 추가합니다. 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>각 시료및 대조군 시료에 1:10 비율 v/v로 MS 등급 물에 10% 포름산(FA) 용액을 추가합니다. C18 정리 전에 pH가 & 3) 있는지 확인하고 필요한 경우 포믹산을 더 추가하십시오.</li>
		<li>각 샘플 및 제어에 섹션 1에서 생성된 무거운 펩타이드 표준의 0.5 μL을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>펩타이드 정리
	<ol>
<li>몇몇 제조업체는 C18 정리 팁 또는 플레이트를 제공합니다. 사용 된 제품에 대한 제조업체의 지침을 따르고, 진공 원심 분리기에서 건조 에로티드 펩티드를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MS에 의한 분석
<ol><li>예정되지 않은 방식으로 무거운 펩타이드 표준에 대한 초기 PRM 분석을 실행합니다.<ol>
<li>말린 시료를 MS 로딩 버퍼 2% ACN/0.05% 트리플루오로아세산(TFA)의 10μL로 재연한다.</li>
		<li>HPLC에 역상 C18 분석 컬럼(75 μm x 15cm, 2 μm 100 Å C18 구슬)을 장착하여 나노플로우 MS를 위해 설계되었습니다. 분석 컬럼의 수명을 보존하기 위해 희생 트랩 컬럼(75 μm x 2cm, 3 μm, 100 Å C18 구슬)이 여기에 사용되었지만 필요하지 는 않다.</li>
		<li>고해상도 질량 분광계에 있는 나노 ESI 소스에 분석 컬럼의 출력을 결합합니다.</li>
		<li>질량 분광계에 적합한 표적 프로테오믹스 방법을 활용한다. 예를 들어 Q-Exactive 플러스 2실험 방법에서 Full MS와 PRM 실험 간에 순환합니다. Full MS 실험의 경우 최대 IT로 AGC 목표 1e6 및 240ms를 사용한 120,000개의 해상도가 사용되었습니다. PRM 실험의 경우 동일한 AGC 목표와 최대 IT가 60,000의 낮은 해상도와 1.2 m/z의 격리 창으로 사용되었습니다.</li>
		<li>HPLC 자동 샘플러를 사용하여 음수 제어의 200 ng를 분석 열에 삽입합니다. 분석 컬럼의 샘플에 선형 그라데이션을 적용하여 ACN 농도를 ~45분 동안 2~25%에서 증가시합니다. 참고: 25% ACN 농도는 일반적인 유비퀴틴 토폴로지 특성 펩타이드의 낮은 친성 특성으로 인해 프로테오믹스에 대해 평소보다 낮습니다. 다른 펩티드가 정량화될 경우, 더 높은 ACN 농도가 양호한 표적 분리를 달성하기를 원할 수 있다.</li>
		<li>섹션 4.2에 설명된 대로 일정 실행 결과를 분석하여 예약된 포함 목록을 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 분석<ol>
<li>섹션 4.2에서 작성된 예약된 포함 목록의 사용과 별도로 3.1에서 일정에 대해 설명된 나머지 샘플을 실행합니다. 참고: 후속 샘플에서 이전 실행에서 이월이 감지되지 않도록 양수 제어 후 공백을 실행해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 소프트웨어 분석
<ol><li>활용된 MS에 적합한 서식 포함 목록을 만듭니다. 이 프로토콜은 잘 문서화 된 지원과 도움을 제공하는 오픈 소스 소프트웨어 스카이 라인 (버전 19.1.0.193)(https://skyline.ms)을 사용했다. 내보내기 격리 목록 기능을 사용하여 여러 질량 분광기에 대해 포함 목록을 만들 수 있습니다.<ol>
<li>새 스카이라인 문서를 엽니다.</li>
		<li>무거운 토폴로지 특성 펩티드에 적합한 무거운 동위원소 변형을 선택합니다. 설정에서| 수정 탭 에서 펩티드 설정, 잠재적인 수정을 보려면 이름 필드를 클릭합니다. 선택은 구입 한 무거운 펩티드의 동위원소 상태를 기반으로합니다. 이 예에서, 중류리신(13C615N 2-lysine) 또는 C-종산시 중형아르기닌(13C615N4-아르기닌)을운반하는 합성 펩티드가 사용되었다. 적절한 레이블은 "라벨:13C(6)15N(2) (C-term K)" 및 "라벨:13C(6)15N(4) (C-term R)"입니다.</li>
		<li>설정을 선택합니다| 전환. 필터 탭에는 전구체 요금 2, 3, 4가포함됩니다.</li>
		<li>편집을 선택하여 펩티드를 삽입합니다| 삽입| 펩타이드.</li>
		<li>토폴로지 특성 펩티드 서열 및 단백질 이름(예: "Chain-K63")을 포함한 관련 분야를 채우는 다.</li>
		<li>이제 대상 패널에 표시된 각 펩티드를 확장합니다. 원치 않는 충전 상태를 삭제합니다. 사용되는 질량 분광계에 따라 다를 수 있는 바람직한 전하 상태 및 충돌 에너지는 각 토폴로지 특성 펩타이드에 대해 표 1에도시된다.</li>
		<li>각 토폴로지 특성 펩티드(GG가 서열에 포함된 M1 제외)에 대해 시퀀스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 수정을 선택합니다. 이름 필드를 클릭하고 모든것을 표시하여구조 수정으로 GG를 추가 ... > 선택하기 전에 "글리글리 (K)".</li>
		<li>격리 목록 파일 내보내기| 수출| 격리 목록,계측기 유형을 선택하고 메서드 유형을 표준으로 설정합니다. 확인을 선택하면 PRM 메서드를 만드는 데 사용할 수 있는 *.csv 파일을 저장하는 프롬프트가 열립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>오픈 소스 스카이라인 소프트웨어를 사용하여 여기에 설명된 무거운 펩타이드 스케줄링 실행에 따라 예약된 포함 목록을 만듭니다.<ol>
<li>섹션 4.1에 설명된 대로 대상 목록을 만듭니다.</li>
		<li>파일을 선택하여 예약 실행을 3.1로 가져옵니다| 가져오기| 결과.</li>
		<li>신분증을 검토합니다. 각 펩티드에 대한 무거운 신호는 각 무거운 펩티드 항목에 대한 질량을 클릭하여 관찰할 수 있습니다. 피크의 올바른 인식은 종종 자동으로 결정되지만 x 축 아래에서 클릭 및 드래그를 사용하여 피크를 선택하여 소프트웨어에 수동 큐레이션이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>무거운 변형에 대해 선택된 보존 시간도 라이트 버전에 적용되므로 PRM에 대한 일정이 생성됩니다. 설정에서 일정 창을 수정할 수 있습니다| 시간 창을변경하여 예측 탭을 사용하여 펩타이드 설정.</li>
		<li>이제 File을 사용하여 예약된 포함 목록을 내보낼 수 있습니다| 수출| 격리 목록 및 예약된 대로 적절한 계측기 유형 및 설정 방법 유형을 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터를 분석합니다.<ol>
<li>섹션 4.2에서 일정 실행 분석과 동일한 방식으로 샘플을 가져옵니다.</li>
		<li>모든 샘플을 완전히 가져온 후에는 전환큐레이션을 하는 것이 좋습니다. 간섭또는 신호 대 잡음 비율이 불량하여 전환되는 프로세스입니다. 큐레이션 전후의 크로마토그램의 예가 도 4에도시된다.</li>
		<li>이제 관련 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 데이터를 선택하거나 파일을 선택하여 데이터를 내보낼 수 있습니다| 수출| 결과.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

프로테오메 내의 유비퀴틴 상태의 분석은 다양한 생물학적 질문에 대한 중요성을 증가시고 있다. 샘플의 유비쿼터티션 상태에 대한 설명은 단백질의 프로파일뿐만 아니라 이러한 유비쿼터티화의 토폴로지에도 초점을 맞추어야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 표적 MS에 의한 이 토폴로지의 평가는, 생물학 조사의 넓은 범위에 있는 역할이 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜이 전역 토폴로지 프로필을 제공한다는 것을 이해해야 합니다. 상향식 프로테오믹스 접근법을 사용하면 유비퀴틴 펩타이드를 포함하여 유비퀴티나이드된 펩타이드의 판정을 가능하게 한다. 유비퀴틴 펩티드의 유비퀴티옹의 관찰은 사슬 토폴로지의 결정을 허용하지만, 유비퀴틴의 표적에 대한 링크는 손실된다. 따라서, 주어진 단백질에 대한 특정 사슬 토폴로지는 결정할 수 없지만 글로벌 토폴로지 프로파일이 도출된다. 이 방법을 더 많은 표적 결과를 제공하기 위해 농축 전략과 결합될 수도 있습니다. 이러한 농축은 체인 안정성과 체인 포스트 농축의 풍요...

단백질 기능 과 안정성의 가까운 조절은 가장 중요 한 중요 한, 그들은 생물학의 phenotypic 제어의 주요 드라이버로. 단백질의 기능은 두 가지 구성 요소로 구성됩니다: 본질적인 폴리펩티드 서열 및 번역 후 변형(PTM). 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화1을포함한 다양한 화학적 PTM이 확인되었다. 1975년, Goldstein외. 2는 작은 단백질을 확인하고 유비쿼터스 특성으로 인해 유비퀴틴이라고 명명했습니다. 유비퀴틴은 단백질 분해3에서중요한 것으로 나타났다. 그러나, 그 이후로 신호 분자로서의 유비퀴틴의 기능이 단백질 안정성조절을 훨씬 뛰어넘는 것으로 확립되었다. 유비퀴틴 시그널링은 단백질 안정화, 자가식, 세포 주기 제어 및 단백질 인신 매매4와같은 광범위한 다른 생물학적 기능에 관여한다.
다른 PtM은 일반적으로 이진 (즉, 단백질은 변형되거나 수정되지 않은 상태로 방치됨)이지만, 유비퀴틴은 단량제 또는 폴리머 체인으로 단백질을 수정할 수 있으며, 부착된 유비퀴틴 자체가 유비퀴티드화된다. 또한, 이러한 폴리비비퀴티닝 체인은 8개의 연계부위5,6중 하나에 부착된 이전 유비퀴틴의 유비퀴티닝을 통해 여러 토폴로지에서 개발할 수 있다. 유비퀴틴은 유비퀴틴의 C-terminus가 7개의 리신 잔기(K06, K11, K27, K29, K33, K48, K48, K63) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin, U63)의 N-터미널(Mquitin) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin) 또는 N-터미널(Mquitin)에 의해 전달된다. 이 사슬 토폴로지는 수정 하에 단백질의 운명에 열쇠입니다. 예를 들어, K48 또는 K11 연결 체인을 사용하여 수정하면 프로테솜에서 변형된 단백질의 분해를 초래하며, NF-kB 시그널링의 활성화를 위해 선형 체인이 필요하다. 따라서, 이러한 사슬 토폴로지의 상대적 분포는 다양한 생물학적 질문과 관련이 있다.
질량 분광법(MS)의 사용은 항체 기반 또는 친화성 기반 상호 작용7,8에의존하지 않기 때문에 유비퀴틴 사슬 토폴로지 분석에 특히 유익하며, 그 중 상당수는 특이성이 제한되어 있으며 다양한 사슬 유형 사이에서 분화하지 않는다. 다른 검출 가능성은 유전자 변형 유비퀴틴 돌연변이를 사용하고 있습니다. 여기서, 특정 리신은 유비퀴틴에 의한 수정을 지원할 수 없는 아르기닌으로 교환된다. 기판 단백질에 유비퀴틴 사슬 형성의 부족은 다음 특정 토폴로지9에대한 증거로 해석된다.
유비퀴티드 단백질의 MS 기반 식별은 유비퀴틴의 C-종물이 MS 분석을 위한 시료의 프로테오리틱 준비 중에 트립신에 의해 인식되는 위치(74)에 아르기닌 잔류물을 함유하고 있으며, C-말단 이중 글리신을 분리한다는 사실에 근거한다. 이 글리글리(-GG)는 기판 단백질의 리신 잔류물의 ε 아미노 그룹에 부착된 채로 남아 있다. 유비퀴틴 토폴로지 분석을 위해, 유비퀴틴의 7개의 리신 잔류물 중 하나에서 수정이 발생합니다. 이것은 GG에 의해 변형되는 리신 잔류물을 운반하는 7개의 키 펩티드 세트를 생성하며, 각 토폴로지(그림2)에특이적으로 변형된다. 예를 들어, K06 토폴로지를 사용하면 아미노산 서열의 위치 6의 리신은 이 리신에 첨가된 114Da의 -GG 변형으로 트립틱 소화로부터 보호됩니다.
MS에 의한 특정 소정의 펩타이드의 식별은 표적 프로테오믹스, 또는 보다 구체적으로, 표적 펩티드획득(10)이라고한다. 사용되는 질량 분광계의 성능에 따라 두 가지 방법이 개발되었습니다. 이들은 선택된 반응 모니터링(SRM), 또한 다중 반응 모니터링(MRM) 및 병렬 반응 모니터링(PRM)이다. SRM은 전구체 m/z 및 제품 이온 m/z로 구성된 전환 선택을 포함합니다. 반대로 PRM은 전구체 m/z만 필요합니다. 포스트 선택, 제품 이온의 전체 측량 스캔이 수행됩니다. 이는측정(11)에앞서 특정 질량 분광계에 대한 수량에 적합한 제품 이온을 선택하지 않는다는 장점이 있다. SRM과 PRM 은 기기에 따라 예약할 수 있습니다. 스케줄링은 펩타이드가 크로마토그래피 시스템에서 정의된 보존 시간에 용례하기 때문에 분석에 특정 이온이 포함되는 시간 창을 할당하는 관행이다. 지정된 시간에 심문되는 이온 수를 줄이면 해당 이온의 심문 빈도가 증가하여 데이터 정확도를 향상시킵니다.
일반적으로, 유비퀴틴 토폴로지대상표적프로테오믹스의 적용은 다른 표적 프로테오믹스 실험과 동일하다. 그러나 두 가지 주요 차이점이 중요합니다: 첫째, 유비퀴틴 체인의 안정성을 고려해야 합니다. 세포 리시스시 사슬을 빠르게 저하시키는 여러 가지 강력한 비쿼터팅 효소(DUBs)가 있습니다. 유비퀴틴 특이적 프로테아제는 티오에스테르아제와 메탈로로테아제의 두 가지 범주로 나뉩니다. 유비퀴틴 하이드로라제의 대부분은 티오스테라아제이며 활성 센터에서 시스테인 잔류물을 운반합니다. 이 시스테인 잔류물을 알킬 수 에 의해, 그들은 비활성화 될 수 있습니다. 이와 같이, N-ethylmaleimide (NEM)와 같은 알킬라팅 에이전트를 포함하는 유비퀴틴 안정화 버퍼의 사용, 고도로 데스팅 화학 물질, 냉각 샘플을 유지하는 것은 성공적인 분석에 필수적이다. 둘째, 다른 표적 실험과 달리 펩타이드 선택은 고정된다. 일반적인 표적 실험에서, 좋은 크로마토그래피 및 이온화 성능을 위해 프로테오티픽 펩티드를 선택할 수 있다. K48과 같은 일부 토폴로지 특성 펩티드의 경우 이러한 특성은 좋으며 다른 제품은 덜 바람직합니다. 예를 들어, 전형적인 역상 설정에서 K33 크로마토그래피는 확장된 용출 프로파일의 형성으로 인해 불량하며, K27 펩티드의 열악한 이온화 특성으로 인해 MS12에의한 가시성을 감소시킵니다.
이 프로토콜에서, 우리는 PRM에 의하여 생물학 견본의 유비퀴틴 토폴로지 평가를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 절차에 대한 예 데이터는 여러 상이한 세포 유형에서 MG-132 억제제 치료를 사용하여 프로테좀의 교란을 사용하여 제시된다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴(ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate(ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>헤비 펩타이</td>드 <td>JPT 펩타이드 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide(NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>양성 대조 사슬 K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>양성 대조 사슬 K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>양성 대조 사슬 M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>소네트</td><td>Branson 소닉</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>써모믹서</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &mu; 용리 C18 플레이트</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

프로테오메 내의 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 글로벌 프로필에 대한 평가는 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 관심이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사슬에 통합된 유비퀴틴의 트립틱 소화 후 남은 디 글리신(-GG) 수정을 활용합니다. 이러한 토폴로지 특성 펩티드를 정량화함으로써 각 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 상대적 풍부를 결정할 수 있다. 병렬 반응 모니터링 실험에 의해 이러한 펩티드를 정량화하는 데 필요한 단계는 유비퀴틴 사슬의 안정화를 고려하여 보고된다. 무거운 컨트롤, 세포 리시스 및 소화의 준비는 적절한 질량 분광계 설정 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 설명됩니다. 유비퀴틴 토폴로지에 대한 혼란을 가진 예제 데이터 세트가 제공되며 프로토콜의 최적화가 결과에 미치는 영향에 대한 예제가 함께 제공됩니다. 설명된 단계를 수행함으로써 사용자는 생물학적 맥락에서 유비퀴틴 토폴로지 환경에 대한 글로벌 평가를 수행할 수 있습니다.

PRM에 의한 유비퀴틴 사슬 분석의 사용을 입증하기 위해 마우스 흑색종 세포주 B16, 및 2개의 일반적인 인간 세포주 A549(아데노카르시노믹 폐포기 기저 상피세포) 및 HeLa(자궁 경부암세포)를 3개의 세포주를 선택하였다. 이러한 배양은 수확 하기 전에 4 시간 동안 0, 10, 또는 100 mM MG-132로 처리되기 전에 적절한 매체에서 중간 기하 단계로 성장했다. MG-132는프로테좀(14)에의한 유비퀴틴-컨쥬게이트 단백질의 분해를 방지하는 프로테좀 억제제이다. 이러한 점을 감안할 때, 유비퀴틴 연쇄 분석을 입증하는 적절한 테스트 조건입니다. K48 체인의 증가는 그림 3에서볼 수 있다. 프로테모솜 억제제 치료는 K48사슬(15)의증가를 유도했다.
소개에 설명된 바와 같이, SRM 또는 MRM과 달리, PRM은 전구체 이온을 선택한...

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

서로 다른 유비퀴틴 사슬 토폴로지는 광범위한 생물학적 효과를 가지고 있기 때문에 그 존재 함의 변화를 이해하는 것은 다양한 생물학적 상태와 관련이 있습니다. 유비퀴틴 사슬 분석에 병렬 반응 모니터링을 적용하면 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 특정 식별 및 정량화가 가능합니다. 일반적인 PRM 실험과 달리, 유비퀴틴 사슬 토폴로지 분석은 특정 변형 펩타이드로 제한되며, 이들 중 다수는 MS 분석에 적합하지 않습니다.이 기법을 시각적으로 시연하면 이러한 비이상적인 펩타이드에 대해 관찰된 조정 및 예상 결과를 강조할 수 있습니다. 본문 원고에 설명된 대로 ammonium bicarbonate 용액, n-ethylmaleimide 용액 및 유비퀴틴 안정화 완충액을 준비하는 것으로 시작합니다. 생물학적 시료를 유비퀴틴 안정화 완충액에 재현탁하고 적절한 방법으로 세포를 용해합니다.세포 용해 후에, 18, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 10 분 동안 표본을 분리기하고 신선한 낮은 단백질 결합 microcentrifuge 관으로 상등액을 옮깁니다. 필요한 경우 계속하기 전에 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 샘플을 해동하려면 ThermoMixer로 빠르게 혼합하고 섭씨 50도 이상의 온도를 사용하지 마십시오.한 번 해동해, 18, 000 시간 G에 표본을 4 섭씨 온도에 10 분 동안 원심 분리하고 새로운 낮은 결합 마이크로 분리기 관으로 20 마이크로그램을 옮기고, 그 후에 ubiquitin 안정화 완충액을 가진 50 마이크로리터에 양을 조정하십시오. 정규화된 부피의 유비퀴틴 안정화 완충액으로 음성 대조군을 준비하고, 완충액 및 상업적으로 이용 가능한 사슬 유형으로 양성 대조군을 준비합니다. 물에 50 밀리몰의 중탄산 암모늄 용액을 준비하고 1 몰의 수산화 나트륨으로 pH를 8로 조정하십시오.E.coli 배양을 5, 000 배 G에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 밀리리터당 5마이크로그램의 유비퀴틴 안정화 완충액에 재현탁합니다. 각 샘플과 대조군에 1마이크로그램의 E.coli 용해물을 첨가합니다.그런 다음 MS 등급 물에 500 밀리몰 TCEP를 준비하고 각 샘플에 최종 농도 50 밀리몰까지 추가합니다. 샘플을 잠시 와류로 만들고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 500 밀리몰의 클로로아세트알데히드와 중탄산암모늄의 용액을 준비하고 이를 샘플과 대조군에 첨가하여 최종

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

분자 도킹 및 탈유비퀴틴 효소 프로브 기술을 기반으로 UCHL3 활성을 억제하기 위한 전통 한의학 화합물 스크리닝

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

배우세요 병렬 반응 모니터링을 이용한 유비퀴틴 연쇄 토폴로지 정량 분석 방법을. 이 기술은 질량 분석 기반 표적 프로테오믹스로 특정 펩타이드 식별 및 정량화에 활용됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

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