Name: 완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 KRAS4b 단백질 고수율 정제 및 특성화 방법을 통해 암 연구에 활용 가능한 생물물리학 실험을 수행하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 막 환경에서의 단백질 상호작용 연구에 필수적입니다.

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우리는 카리사 그로스, 젠 멜할코, 맷 드류의 복제 및 발현 지원을 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소의 단백질 발현 실험실에서 인정합니다. 이 프로젝트는 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건원에서 연방 기금의 전체 또는 일부를 지원되었습니다. HHSN261200800001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 승인을 의미하지 는 않으며, 상품, 상업 제품 또는 조직에 대한 언급은 없습니다.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

대표 결과 섹션에서 언급한 바와 같이, 정제 시 가장 중요한 단계는 낮은 염분에 있는 시간 동안 시료의 취급이다. 시료가 200mM 미만NaCl에 노출되는 시간을 제한하면 강수량을 줄이고 샘플 수율을 높일 수 있습니다. 프로파일이 예상과 일치하지 않는 경우 CEX의 결과를 해석하기 어려울 수 있습니다(그림 2참조). 프로토콜이 일상화될 때까지, 앞으로 이동되지 않는 CEX 용출 분획은 적절한 물질이 앞으로 취해졌는지 확인하기 위해 손상되지 않은 질량 분석이 완료될 때까지 -80°C에서 보관하는 것이 좋습니다. CEX 단계에 대해 위에서 언급한 매개 변수 를 벗어나면 프로토콜은 용해 및 IMAC 단계에서 비교적 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한 프로토콜에 크기 배제 크로마토그래피(SEX) 분리 단계가 없다는 점도 주목할 필요가 있다. 이것은 초기 방법 개발 (게시되지 않은 결과) 동안 관찰 한 손실로 인해 생략됩니다. 단백질이 나노 디스크와 복잡 할 때 이러한 손실이 관찰되지 않...

번역 후 변형은 단백질의 기능적 활성을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 인산화 및 당화와 같은 변형은 잘 확립됩니다. 지질 수정은 덜 잘 특징입니다, 그러나. 모든 세포 단백질의 0.5%가1. 전조는 CAAX 모티프2를함유하는 수용자 단백질로 15탄소 파네실 또는 20탄소 제라닐라닐 지질 사슬을 전달하는 것입니다. 조기 노화3,알츠하이머4,심장 기능 장애5,중증 혈증6,암7을포함한 여러 인간 질병의 진행에 전산 단백질이 연루되어 있다. 작은 GTPases, HRAS, NRAS 및 KRAS1,핵 라미닌, 및 키네토초레 CENP-E 및 F는 기초 조건 하에서 farnesylated 단백질입니다. 다른 작은 GTPas, 즉 로아, 로C, Rac1, cdc-42 및 RRAS는 제라냐게니라니어8,반면 로브는 farnesylated 또는 제라뉴어니어9 .
작은 GTPase KRAS4b분자 스위치로 기능, 본질적으로 세포 내 성장 인자 신호 세포 성장 및 확산을 자극 하는 세포 내 신호 전달 경로 전송, 여러 단백질-단백질 상호 작용을 통해. KRAS4b 생화학의 활동에 필수적인 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫째, 단백질은 비활성 GDP와 활성 GTP 경계 상태 사이의 주기로 이펙터와 적극적으로 관여합니다. 둘째, C 말단 폴리리신 영역과 원거리 및 카르복시스테인이 단백질을 혈장 막으로 유도하여 하류 이펙터의 모집 및 활성화를 가능하게 한다. 돌연변이 KRAS4b는 췌장, 대장암 및 폐암10의내인성 동인이며, 이와 같이 치료적 개입은 엄청난 임상적 이점을 가질 것이다. 원거리 및 카르복시메틸화된 본성 변형 재조합 단백질의 생산은 리포좀 또는 지질나노디스크(11,12)와같은 막 대리체와 조합하여 KRAS4b를 이용한 생화학적 스크리닝을 가능하게 할 것이다.
파네실 트랜스퍼라제(FNT)는 KRAS4b의 CAAX 모티프에서 C 말단 시스테인에 파네실 파이로포스페이트를 첨가하는 촉매제. prenylation 후, 단백질은 Ras 변환 효소 (RCE1)가 3개의 C 말단 잔기를 절단하는 안구 성 망막 (ER)으로 인신매매됩니다. 처리의 마지막 단계는 ER 막 단백질에 의한 새로운 C 말단 파네실시스테인 잔기의 메틸화, 이소프렌시스테인 카르복실 메틸트랜스퍼라제(ICMT)이다. 대장균에서 재조합KRAS4b의 발현은 변형되지 않은 단백질의 생산을 초래한다. 이전에는 처리된 KRAS4b를 생산하려는 시도가 구조적 또는 약물 스크리닝 실험에 대한 수율이 부족하여 제한되었거나 네이티브 전체 길이 성숙단백질(13,14)을재량화하지 못했다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포 배양의 5 mg/L의 수율에서 고도로 정제되고 완전히 처리된 KRAS4b를 생성하는 엔지니어링된 바쿨로바이러스 기반 곤충 세포 발현 시스템 및 정제 방법을 이용한다.
신중한 단백질 특성화는 구조 생물학 또는 약물 스크리닝 연구에 착수하기 전에 재조합 단백질의 품질을 검증하는 데 필수적입니다. 완전히 처리된 KRAS4b의 두 가지 주요 파라미터는 막 대용품 또는 지질과의 상호 작용을 위한 올바른 프레닐 변형 및 카르복시내화 C-종단(FMe)의 가용성검증이다. KRAS4b-FMe의 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 분자량을 측정하고 파네실 및 카르복시메틸 변형의 존재를 확인하기 위해 사용되었다. 시료가 비분폐 용매로 분무되는 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b-FMe가 GDP 보조 인자에 묶여 있음을 입증하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 표면 플라스몬 공명 분광법은 고정된 리포솜을 이용한 KRAS4b-FMe의 직접 결합을 측정하는데 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, 천연</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 mm Cl SS 연동 인서트 자동시료주입기 바이알</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI</td> <td>극성 지질</td><td></td> 850457 클로로포름 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS)의 <td>액체 스톡으로 구매</td></tr><tr><td></td><td> 극성 지질840034</td><td></td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>5427R 원심분리기</td>, <td>에펜도르프</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, HPLC 등급</td><td>피셔 케미컬</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>아르곤 가스</td><td>에어가스</td><td>ARUP</td><td></td></tr><tr><td>분석 플레이트 384</td><td>코닝</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 기기</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블루 스냅잇 씰, T/S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>Branson 초음파 수조</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose 고성능</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>시그마</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro 플레이트 리더</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>시약 등급 이상</td></tr><tr><td>사용 Gilson 바이알 7x14mm 튜브</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 폼 라이너</td><td>가 있는 유리 나사산 바이알Scientific Specialities</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>고속/탁상형 원심분리기</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td> 최대 <td>4,000xg</td></tr><tr><td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) 프로테아제</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>Purified as according according to Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. 에서: Burgess-Brown N. (eds) E.coli의 이종 유전자 발현. 분자 생물학의 방법, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td></tr><tr><td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>In-house Water Supply, Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Resistivity of 18 M&Omega; 홀더</td></tr><tr><td>가 있는 0cm 지질 압출기 세트</td>, <td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td></td></tr> 610023 <tr><td>액체 질소</td>, <td>에어가스</td>, <td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH 미세유체역학</td>, <td>미세유체역학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC 컬럼, 4um, 3.0 x 50mm</td><td>, Thermo Scientific</td><td></td> 088645 <td></td></tr><tr><td>MabPac SEC-1 컬럼, 5μm, 300 &Aring;, 2.1 x 150mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>MagTran 소프트웨어</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올, HPLC 등급</td><td>VWR 화학 물질</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>NGC 크로마토그래피 시스템</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 크로마토그래피 시스템</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 또는 기타 킬레이터가 없는</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>고무 캡 유형 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>시리즈 S 센서 칩 L1</td><td>GE Healthcare</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>280nm</td></tr><tr><td>Ultra-15 원심 필터 장치에서 흡수, 10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>PES 멤브레인</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 원심분리기 필터</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima -</td><td>100,000xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC(펌프, 컬럼 하터 및 LC 시스템)</td>가 가능한 L80KThermo <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>물, HPLC 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>자체 수원 사용 가능(아래 참조)</td></tr><tr><td>Whatman GD/XP PES 0.45mm 주사기 </td><td>필터 GE 헬스케어 - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>단백질체학 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

완전히 가공된 재조합 kras4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

단백질 prenylation는 세포내 막에 단백질을 표적으로 하는 책임 있는 중요한 수정입니다. 인간 암의 22%에서 돌연변이되는 KRAS4b는 C-종단에 'CAAX' 박스 모티프가 존재하기 때문에 패네실화와 카르복시메틸화에 의해 처리됩니다. 엔지니어링 된 바쿨로 바이러스 시스템은 곤충 세포에서 farnesylated 및 카르복시 메틸화 KRAS4b를 발현하는 데 사용되었으며 이전에 설명되었습니다. 여기서, 우리는 단백질의 상세하고 실용적인 정제 및 생화학적 특성을 설명합니다. 구체적으로, 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피는 균질성으로 단백질을 정제하는 데 사용되었다. 손상되지 않은 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b의 올바른 변형을 검증하고 뉴클레오티드 결합을 검증하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 피네시레이트 및 카르복시메틸화된 KRAS4b의 막 체내를 리포솜으로 표면 플라스몬 공명 분광법을 사용하여 측정하였다.

프로토콜에서 가장 큰 변수 중 하나는 발현된 표적 단백질의 양(His6-MBP-tev-KRAS4b)이다. 이 프로토콜은 트리코플러스니아 ni 세포주, Tni-FNL17로부터분리된 것을 이용하여 개발되었으며, 현탁액 성장에 적합하고 혈청으로부터 제거되었다. 바쿨로바이러스 발현 시스템을 통해 다양한 곤충 세포주전반에 걸쳐 보고된 광범위한 결과를 감안할 때, 적어도 초기에는 KRAS4b-FMe를 생산하기 위해 Tni-FNL을 사용하는 것이 바람직하다.
~65 kDa로 이동하는 어두운 단백질은 용출 분획뿐만 아니라 정제 된 용해물에서도 명백해야합니다(도 1A). 융합 단백질은 ~48 kDa에서 comigrates 공동 표현된 FNTA/B인 다른 것과 함께 용해에서 2개의 가장 눈에 띄는 염색된 밴드 중 하나이어야 합니다.
<p class=...

전조는 말초 막 결합 단백질에 대한 중요한 변형입니다. 곤충 세포는 단백질 단백질과 단백질 지질 상호 작용의 생물 물리학 측정을 가능하게 하는 양으로 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS4b를 생성하기 위하여 조작될 수 있습니다

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

우리의 프로토콜은 높은 수율에서 제대로 처리 된 KRAS의 격리 및 분리를 허용합니다. 정통 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS의 생산은 포유류 세포에서와 같이 그들의 막에 KRAS가 있는 실험을 능력을 발휘할 수 있게 합니다. 프로토콜의 높은 수율은 이전 작업과 차별화됩니다.우리는 일반적으로 발현 물질의 리터 당 단백질의 3 ~ 5 밀리 그램을 정화. 이를 통해 다양한 생물물리학 및 구조 생물학 실험을 수행할 수 있습니다. KRAS는 암의 20%와 췌장암에서 90%에서 돌연변이됩니다.따라서 진정으로 가공된 단백질을 생산하는 프로토콜을 갖는 것은 암세포의 막에 있을 때와 같이 실제 단백질을 연구할 수 있도록 약물 스크린 개발에 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 또한 세포에서 파네산되고 완전히 가공되는 그밖 단백질을 공부하기 위한 아주 유용합니다. 그리고 따라서, 당신이해야 할 모든 관심의 단백질로 KRAS를 교환하고 바쿨로 바이러스에 넣어.중요한 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 주변의 단계입니다. 적절한 컬럼을 사용하고 단백질이 낮은 소금 완충제에 있는 시간을 제한하는 것은 성공을 위해 필수적입니다. 강수량이 스노우 글로브 유형의 이벤트가 아니라는 것을 이해하면 새로운 프로토콜을 안내하는 데 도움이됩니다.이는 양이온 교환 열 부하를 여러 개의 더 작은 하중으로 나눌 필요성을 보여 줌으로써 강화됩니다. 세포를 용해하고, 용해물을 명확히 하고, IMAC에 의한 표적 단백질을 정화한 후, SDS 페이지와 쿠마시 염색을 사용하여 단백질 분획을 분석한다. 피크 분획을 풀링하고 섭씨 4도에서 버퍼 D 2리터에 대해 밤새 수영장을 투석합니다.다음 날, 투석에서 샘플을 제거하고 10 분 동안 4, 000 배 g에서 원심 분리하여 침전을 제거하십시오. 최종 투석 및 명확한 샘플은 여전히 흐릿하지만 추가 처리 없이 CEX 컬럼에 적용할 수 있습니다. 버퍼 G의 세 컬럼 부피로 세척하여 20 밀리리터 양이온 교환 열을 준비한 다음, 3개의 열 부피의 완충F.Next로, 20밀리리터의 최종 염화나트륨 농도를 100 밀리미터의 최종 염화나트륨 농도로 희석하고 샘플을 교환 열에 적용한다.소량의 시료를 한 번에 희석하는 것이 중요하며 희석 후 즉시 컬럼에 도포하여 단백질의 강수량을 제한하는 것이 중요합니다. 이전 희석이 부하 끝에 가까워지면 새로 희석된 샘플로 컬럼을 계속 로드합니다. 그런 다음 일반적으로 세 개의 열 볼륨이 필요한 버퍼 F로 컬럼을 기준용량(280)으로 세척합니다.버퍼 F에서 65%의 완충제 G까지 400 밀리리터 그라데이션으로 컬럼에서 단백질을 엘테하여 6밀리리터 분획으로 용액을 수집합니다. 그라데이션이 완료되면, 65%버퍼 G.의 추가 1.5 컬럼 볼륨에 대한 열을 계속 세척하여 SDS 페이지와 쿠마시 블루 얼룩 분석과 크로마토그램의 UV 추적 검사를 기반으로 양극분획을 선택합니다. 그런 다음 단백질을 풀과 원고 방향에 따라 His6 TEV 프로테아프로 소화합니다.소화 및 투석 후, 단백질을 분당 3밀리리터로 버퍼 A로 평가한 20 밀리리터 IMAC 컬럼에 적재합니다. 이 크로마토그래피 동안 7밀리리터 분획을 수집하고 총 3개의 열 버퍼 A로 또는 기준선 흡수도에 도달할 때까지 컬럼을 세척합니다. 완충 C의 5개의 컬럼 부피 그라데이션을 0%에서 10%로 조정하고 7밀리리터 분획을 수집합니다.그런 다음 SDS 페이지를 통해 양수 분수를 식별합니다. SDS 페이지로 분석할 때, 명확한 용액에는 융합 단백질 His6-MBP-tev-KRAS4b에 해당하는 약 65킬로달톤으로 이동하는 어두운 밴드가 포함되어야 합니다. 공동 표현된 FNTAb는 48킬로달톤으로 이동합니다.정제 내의 CEX 단계는 프로테오시스의 범위를 감소시키고 완전히 가공된 단백질을 풍부하게 하기 때문에 중요하지만 프로토콜의 가장 복잡한 부분입니다. 이 단계의 일반적인 결과는 KRAS4b-FMe를 가진 눈에 띄는 피크 3이 있지만 용출 프로파일은 가변적일 수 있습니다. ESIMS를 이용한 온전한 질량 분석은 단백질의 정확한 분자 질량을 확인하고 이에 의해 파네실화 또는 카박스티메틸화의 상대적 비율을 확인한다.일반적인 최종 제비는 일부 검출 가능한 KRAS4b-FARN을 포함 하는 동안, 이 비율은 미만 15%이 분석에서 피크 높이 측면에서. 네이티브 질량 분석은 GDP에 바인딩 된 KRAS4b의 질량을 결정하는 데 사용되었다. 샘플 용매는 아세테이트 암모늄으로 교환되어 원어민 복합체가 그대로 유지될 수 있도록 부드러운 이온화를 보장하였다.KRAS4b-FMe및 리포솜의 상호 작용은 KRAS4b-FMe가 멤브레인에 결합하기 위해 필요한 파네실화 및 카박스티메틸화를 검증하기 위해 표면 플라스몬 공명으로 측정되었다. 예상대로, KRAS4b-FMe는 리포솜에 묶여 있었고, 처리되지 않은 KRAS4b는 그렇지 않았다. 단백질이 낮은 소금에 노출되는 시간을 최소화하는 것은 수율에 영향을 미치는 프로토콜의 가장 중요한 단일 측면입니다.단백질은 완충E의 희석 에 이어이 낮은 염 농도에서 간단히 단백질은 LIPosomes 또는 나노 디스크와 같은 막 모방을 사용하여 KRAS가 상호 작용하는 지질을 조사하는 다양한 생물 물리 학적 실험에 사용될 수 있습니다. 이러한 데이터를 사용하여 KRAS가 세포의 혈장 막과 상호 작용하는 방법을 추정하기 시작할 수 있습니다. 정제 된 KRAS-FMe를 사용하여, 우리의 동료는이 단백질의 farnesylated 및 메틸화 된 형태에 특정 된 chaperone와 복합체에서 KRAS의 엑스레이 결정 구조를 해결할 수 있었다.

fully-processed-recombinant-kras4b-isolating-characterizing

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜

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학습하세요 KRAS4b 단백질 고수율 정제 및 특성화 방법을 통해 암 연구에 활용 가능한 생물물리학 실험을 수행하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 막 환경에서의 단백질 상호작용 연구에 필수적입니다.

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