Name: 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 배우세요 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석 방법입니다. 메틸화 특이 프로브 증폭법을 활용하여 암 관련 후성유전학적 변화를 연구하고 세포 간 소통 메커니즘을 규명합니다.

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이 작품은 헬싱키 대학 프로젝트 기금 (WBS490302, WBS73714112) 헬싱키 대학 병원 주립 대학 수준의 건강 연구를위한 자금 (Y1014SUL05, TYH2016130), 핀란드 - 노르웨이 의학 재단, 셀마및 셀마에 의해 지원되었다 마자 리사 실란더 기금 (미네르바 재단). 우리는 수정 된 MSPA 프로토콜을 제공하고 관련 기술 지원을 위해 월터 파비치에게 감사드립니다. 비디오 제작을 도와주신 티무 마살린(헬싱키 대학교)에게 감사드립니다.

이 연구는 헬싱키 와 우시마 병원 지구의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (윤리 승인 D. 217/13/03/02/2015).
1. 초원심분리에 의한 EV 고갈 FBS의 준비
<ol><li>(울트라) 원심 분리튜브에 FBS를 가지고 초원심분리기 양동이에 넣습니다. 초원심분리가 원활하고 안전하게 작동하도록 하려면 버킷의 균형을 서로 10 mg 이내로 조정하십시오.</li>
	<li>스윙 로터(SW28, k-factor 246형)에 버킷을 로드합니다. 초원심지에서 로터를 놓고 4 °C에서 19 시간 동안 100,000 x g에서 실행하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 상층 (약 9/10)의 밝은 색상의 상층을 수집하고 50 mL 튜브로 전송합니다. FBS의 EV가 포함되어 있으므로 어두운 갈색 펠릿을 방해하거나 피펫하지 마십시오.</li>
	<li>상급체를 0.22 μm 필터를 통해 새로운 50 mL 튜브에 전달합니다.</li>
	<li>EV 절연을 위해 세포를 재배할 때 필터 멸균, EV 고갈된 FBS를 세포 배양 배지에 추가합니다.</li>
</ol>2. 골육종 유래 전기 의 격리
<ol><li>플레이트 OS 세포 (HOS-143B 세포주) RPMI 와 T-175 플라스크 1640 배지, 보충 10% 정상 FBS 와 1% 항생제 (100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 연쇄상 구균). 플라스크를 인큐베이터에 37°C 및 5%CO2에놓습니다.</li>
	<li>플라스크가 70%-80% 콘플루트인 경우, 인산염 완충식염수(PBS)로 세포를 세척한 다음 10% EV 고갈된 FBS(이하 EV 고갈 된 매체)를 함유하는 매체에서 성장시킵니다. 참고: T175 플라스크에 도금된 1 x 106 HOS-143B 셀은 약 60시간 후에 70%의 동률에 도달합니다.</li>
	<li>다음 48 시간 동안, 매 24 시간 후 골육종 세포에서 컨디셔닝 된 매체를 수집하고 신선한 EV 고갈 된 매체를 추가합니다.</li>
	<li>2500 x g에서 2500 x g에서 20분 동안 4°C에서 원심분리하여 세포 및 세포 이물질을 제거하였다. 상급을 새 튜브로 옮기고 하단에 약 2 mL의 미디어를 남깁니다. 참고: 이 단계에서 EV 격리를 직접 진행하지 않으면 상급체는 -80 oC에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>초원심지 튜브에 상급물을 붓고 더 일찍 균형을 맞추십시오. 4 °C에서 2 시간 동안 100,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상한을 버리고 바닥에 약 1 mL를 남깁니다. 약 20 mL의 PBS (0.1 μm 여과)를 튜브와 피펫에 부드럽게 추가하여 EV 펠릿을 세척하고 다시 놓습니다.</li>
	<li>튜브의 균형을 맞추고 동일한 설정으로 또 다른 초원심분리를 수행합니다.</li>
	<li>상급체를 조심스럽게 제거하고 부드러운 파이펫팅으로 PBS의 200 μL에서 EV 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 전기 를 낮은 바인딩 튜브에 보관하십시오. 참고: EV는 필요할 때까지 바로 사용하거나 -80°C에 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. OS-EV의 특성화
참고: 정제된 전기자동차는 서부 블로팅(WB), 나노입자 추적 분석(NTA), 및 투과 전자 현미경(TEM)16을특징으로 할 수 있다.
<ol><li>EV 마커 CD63, TSG101 및 Hsp70을 사용하여 표준 프로토콜16에 따라 WB를 수행하고, EV샘플(20)의순도를 나타내는 음의 대조군으로 칼넥신을 수행한다.</li>
	<li>NTA의 경우 먼저 EV 샘플을 0.1 μm 여과된 덜베코의 PBS로 희석하여 프레임당 30~100개의 입자를 얻는 것이 좋습니다.<ol>
<li>시료의 약 500 μL을 1mL 주사기에 넣고 NTA 기기의 입구 포트에 로드합니다. 정확한 측정을 위해 프레임당 충분한 입자가 있는지 확인합니다.</li>
		<li>NTA 소프트웨어를 열고 주변 온도에서 카메라 레벨 13을 사용하여 60초 의 5개의 비디오를 녹화합니다. 분석 중에 검색 임계값 = 5 및 게인 = 10을 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞서21에설명된 대로 TEM별로 EV 샘플을 분석합니다.</li>
</ol>4. AT-MSC 문화
참고: 중간엽 줄기 세포 격리를 위한 인간 지방 조직은 지방 흡입 흡인으로 제공되었습니다 (성형 외과, 레이저 Tilkka Ltd., 핀란드). 서면 통보 된 동의는 선택 적 지방 흡입 절차를 겪고있던 lipoaspirate 기증자로부터 취해졌습니다.
<ol><li>표준 기계적 및 효소 적 절연 방법을 사용하여 지방 흡입 흡인에서 AT-MSCs를분리22. 참고: 다른 공급원(상용 세포주 포함)의 중식세포도 사용될 수 있다.</li>
	<li>DMEM/F-12 배지의 배양 세포는 10% FBS 및 1% 항생제로 보충되었습니다.</li>
</ol>5. OS-EV를 가진 양전자의 처리
<ol><li>플레이트 15,000 AT-MSCs 당 잘 24 웰 플레이트.</li>
	<li>24 시간 후, 오래된 매체를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, EV 고갈 된 매체로 변경하십시오.</li>
	<li>1일째(세포 부착 후 24시간), 3일째(1일차 후 48시간), 5일째(1일차 이후 96시간)에 OS-EV(세포당 1 x 106EV의 입자 농도)로 세포를 치료합니다.<ol>
<li>1일째에는 시간점(TP) 0 샘플, 3일째에는 TP 3 샘플, 7일째에는 TP 7 샘플(5일째 이후 48시간)에 대한 OS-EV 처리를 중단합니다. 참고: 실험 계획에 따라 다른 시간 점 일정도 따를 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절한 방법을 사용하여 자식 에서 DNA를 추출하십시오. 데이터 분석을 위해 양수 및 음수 제어 샘플을 포함합니다.</li>
</ol>6. LINE-1 메틸화 분석
<ol><li>이전에 Pavicic 등23에서수행한 것처럼 사용자 정의 된 LINE-1 프로브 프라이머를 설계하십시오. 메틸화 프로브의 경우, LINE-1의 프로모터 영역 내에서 HhaI 제한 부위를 포함하는 3개의 서열을 선택한다. 제어 프로브의 경우 나머지 LINE-1 시퀀스에서 HhaI 제한 사이트가 없는 7개의 시퀀스를 선택합니다. 참고: LINE-1 시퀀스는 GenBank 데이터베이스 24(L1.2, 액세스 없음)에서 사용할 수 있습니다. AH005269.2). 프로브 설계에 대한 MSPA 제조업체의 지침을 사용합니다25.</li>
	<li>TE 완충액에서 DNA 샘플 70 ng를 5 μL 부피로 희석한다.</li>
	<li>표 1에기재된 바와 같이 후속 열사이클링 및 PCR 단계를 수행합니다. 샘플을 98°C에서 10분 동안 가열한 다음 25°C로 식힙니다.</li>
	<li>각 샘플에 3 μL의 프로브 혼성화 믹스를 추가하고 열전자전거기를 실행하여 프로브가 DNA에 혼성화될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 각 샘플에 13 μL의 혼성화 후 믹스를 추가합니다. 10 μL을 두 번째 튜브로 옮김.</li>
	<li>두 세트의 튜브를 열전도선에 놓고 48°C에서 적어도 1분 동안 배양합니다.<ol>
<li>시료가 48°C에 있는 동안, 제1 튜브 세트(소화되지 않은 계열)에 결찰 혼합물의 10 μL을 추가하고, 결찰-소화 혼합물의 10 μL을 제2 튜브 세트(소화 계열)에 첨가한다. 다음 열자전거 프로그램을 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브를 스핀다운하고 동시에 써모사이클러를 72°C로 설정합니다.</li>
	<li>각 튜브에 5 μL의 폴리머라제 믹스를 넣고 튜브를 열전자전거에 넣습니다. PCR 프로그램을 실행합니다.</li>
	<li>PCR 프로그램이 실행되는 동안 2.5 μL 크기의 표준이 포함된 1mL 포름아미드 용액을 준비합니다. 이 용액의 파이펫 10 μL은 광학 96 웰 플레이트(바코드 사용)의 각 웰에 대해.</li>
	<li>PCR 후, 소화되지 않은 샘플을 초순수에서 각각 1:100 및 1:200으로 희석합니다. 희석된 PCR 제품 2 μL을 96웰 플레이트에 추가합니다. 15-20s에 대한 200 x g의 플레이트를 원심 분리하여 기포를 제거합니다.</li>
	<li>모세관 전기 동공에 의한 시료의 단편 분석을 수행합니다. 참고 : 플레이트는 분석 될 때까지 어둠 속에서 4 °C에서 보관해야합니다.</li>
</ol>7. 조각 데이터 분석
<ol><li>모세관 전기 동공결과를 열면 전기 포로그램 분석 소프트웨어가 생성됩니다.<ol>
<li>패널 열 아래에서 샘플 중 하나에 대해 메뉴에서 MLPA를 선택합니다. 패널 헤더를 클릭하고 Ctrl+D를 눌러 모든 샘플에 MLPA를 적용합니다.</li>
		<li>같은 방법으로 모든 샘플에 대해 분석 메서드를 Microsatellite 기본값으로 설정합니다.</li>
		<li>모든 샘플을 선택하고 녹색 재생 버튼을 클릭하여 선택한 설정에 따라 샘플을 분석합니다.</li>
		<li>모든 샘플을 선택하고 그래프 버튼을 클릭하여 프로브 피크를 시각화합니다.</li>
		<li>개별 프로브 피크의 더 높은 해상도를 위해 피크 영역을 확대합니다. LINE-1 프로브 믹스의 프로브에 해당하는 10개의 피크가 모두 레이블이 지정되어 있는지 확인합니다. 추가 피크(&lt;95 bp 및 &gt;160 bp)를 폐기합니다.</li>
		<li>유전자형 탭에서 결과를 CSV(쉼표 구분값) 형식으로 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어에서 CSV 파일을 열고 데이터를 열로 정렬합니다.<ol>
<li>대략적인 크기(L1-1m에서 153bp, L1-2m에서 119bp, L1-3m에서 133bp)를 기준으로 세 개의 메틸화 부위 피크에 라벨을 붙입니다. 나머지 7개의 피크는 제어 프로브에 해당합니다. 참고: 여기서, L1-2m 프로브 피크의 값은 117 bp의 크기를 가지며, 그 영역은 대부분의 LINE-1 메틸화검소(23)에서사용되었기 때문에 사용된다.</li>
		<li>각 샘플(소화되지 않고 소화되지 않은)에 대해 7개의 제어 피크의 합계 피크 영역을 계산합니다. 각 LINE-1 프로브의 피크 면적을 이 합계로 나눕니다.</li>
		<li>각 DNA 샘플에 대해, 다음 방정식을 사용하여 소화된 샘플의 값을 소화되지 않은 샘플의 값으로 나누어 메틸화 투여량 비(DM)를얻습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60705/60705eq1.jpg"> 여기서: DM은 메틸화 투여비이고, Ax는 피크 x(예를 들어, L1-2m 피크) 하에서 영역이며, Actrl은 모든 7개의 제어 프로브의 합계 피크 영역이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 연구는 MSPA가 특정 유전 요소의 메틸화 상태를 감지하고 정량화하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. LINE-1은 여기서 초점이 되었지만, 프로브는 다양한 유전자 및 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 또한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있는 프로브 믹스 목록이 늘어나고 있습니다. MSPA는 바이설피테변환(10)을필요로 하지 않는 DNA 메틸화 분석을 위한 간단하고 견고한 기술이다. 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 전체 절차는 약 2일이 걸리지만 실제 실습 작업은 4-5시간정도소요됩니다. 여기에서 설명한 바와 같이 소량의 DNA(최저 70ng)에 적용할 수 있습니다.
메틸화 분석 프로토콜의 가장 중요한 부분은 본 연구에서 LINE-1 프로브-믹스와 같은 맞춤형 프로브 믹스의 제조이다. 그들의 상이한 길이 때문에, LINE-1 프로브 올리고뉴클레오티드는 4-40 nM의 범위에서 합성되었고, 그래서 용해 단계 및 ...

DNA 메틸화는 인간 세포에서 발생하는 주요 후생유전학적 변형이다. DNA 메틸화는 CpG 디뉴클레오티드에서 시토신 잔기에 메틸 기의 연계를 지칭한다. 이러한 디뉴클레오티드는 일반적으로 유전자1의5' 영역에서 클러스터 (CpG 제도)에서 발견된다. 정상 세포에서는, 이 디뉴클레오티드의 대부분은 DNA 전사를 허용하는 미수정 상태에서 존재합니다. 덧붙여, 많은 암은 과민성 CpG 섬 및 전사체침묵과연관됩니다 2, 특히 종양 억제유전자에서, 이는 차례로암3의각종 특징에 기여합니다.
다른 한편으로는, 긴 산재핵 원소-1 (LINE-1s 또는 L1s)는 일반적으로 CpG 제도에서 메틸화의 상부를 가지고 반복적이고, 전염가능한 DNA 원소이다. LINE-1의 메틸화는 전좌를 방지하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 여러 유형의 암에서 LINE-1은 저혈압이 되어 활성화 및 후속 역류 매개 염색체 불안정성을초래합니다 4. LINE-1은 인간 게놈5의거의 17%를 차지하며, 그 메틸화 상태는 글로벌 게놈 메틸화 수준6의지표로서 작용할 수 있다. 글로벌 LINE-1 하부메틸화는 종양 표현형7에대한 세포의 전이보다 선행하는 것으로 간주된다; 그러므로, 그것은 초기 암 개시를 위한 잠재적인 마커로 약속을 보유합니다.
현재, 열화상 분석, 메틸화 특이적 PCR, 마이크로어레이 및 크로마틴면역침전1을포함하는 메틸화 분석을 위한 몇 가지 방법이 있다. 차세대 염기서열 분석의 사용은 또한 DNA 메틸화의 검출에 게놈 전체 접근을 통합하는 가능하게 했습니다. 이러한 방법의 대부분은 비설피테 처리 된 DNA에 의존, 있는 미수정 시토신우라실로 변환되고 메틸화 된 시토신은 변경되지 않은 상태로 유지됩니다. 그러나, 비설피티 처리 된 DNA로 작업하는 것은 우라실로 의 미수정 시토신의 불완전한 변환, 서열의 편향 된 증폭 및 시퀀싱 오류8과같은 몇 가지 함정을 가지고 있다.
메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)에서, 2개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브는 메틸화에 민감한 제한 효소 HhaI 9에대한 제한 부위(GCGC)를 함유하는 DNA 서열을 표적으로 한다. 프로브가 DNA에 혼성화된 후, 각 샘플은 2세트로 나뉩니다. 첫 번째 세트의 프로브는 결찰을 거치고, 두 번째 세트의 프로브는 결찰을 거쳐, 하아I-매개 소화는 미수정 CGCG 부위에서 수행된다. 샘플의 두 세트는 PCR에 의해 증폭되고, 제품은 모세관 전기 동공에 의해 분리됩니다. 미수정 사이트의 프로브는 HhaI에 의해 소화되며 PCR 중에 증폭되지 않아 피크 신호가 생성되지 않습니다. 대조적으로, 메틸화된 부위의 프로브는 소화로부터 보호되고, 따라서 PCR 동안 증폭되어, 이어서 피크신호(10)를생성한다.
MSPA는 대체 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 먼저, 낮은 양의 DNA(50-100 ng)를 필요로 하며 포르말린 고정 파라핀 임베디드샘플(10)으로부터DNA의분석에 적합하다. 그것은 bisulfite 처리된 DNA를 요구하지 않습니다; 사실, 이런 식으로 수정되는 DNA에는 적합하지 않습니다. 많은 견본이 동시에 분석될 수 있고, MSPA 프로브는 다중 유전자 또는 순서를 동시에 표적으로 하도록 디자인될 수 있습니다. 부가적으로, 프로브는 HhaI 제한 부위가 CpG 제도10의전형적인 서열에 대응하기 때문에 메틸화된 DNA에 대해 특이적이고 민감하다.
본 연구는 지방 조직 유래 중간 엽 줄기 세포에서 LINE-1 메틸화에 골육종 (OS)에서 파생 된 세포 외 소포 (EV)의 효과를 조사했다 (AT-MSCs; 그림 1). EV는 대부분의 세포 모형에 의해 분비되는 나노 규모, 막 결합한 소포입니다. 그(것)들은 부모 세포11,12에게서단백질, 지질, mRNA, microRNA 및 추가 분자를 전송합니다. 전기자동차는 세포간 통신을 중재하고 여러 병리생리학적 조건에서 중요한 역할을 한다13,14. 최근 연구에 따르면 암 유래 전기자동차가 활성 LINE-1을 수용자세포(15)로옮길 수 있는 것으로 나타났다. HOS-143B 세포주에서 EV가 다른 유전적 효과16이외에, MSCs에서 LINE-1의 메틸화 상태를 변경할 수 있다는 것이 일찍 보고되었다.
EV 격리를 위한 세포를 성장시킬 때, 성장 배지에 EV 고갈된 태아 소 혈청[FBS]을 사용하는 것이 중요하다, FBS 유래 전기 자동차는 다른 소스로부터 전기자동차를 방해하고 결과를 방해할 수 있기 때문에17,18. 초원심분리는 FBS에서 전기자동차를 고갈시키는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그것은 초여과 및 상용 EV 고갈 FBS19와같은 대안에 비해 상대적으로 간단하고 비용 효율적인 절차이다. 여기서, 프로토콜은 또한 초원심분리에 의해 EV 고갈된 FBS를 준비하는 방법을 보여줍니다.
이 문서에서는 OS 세포주에서 EV를 격리하는 것부터 OS-EV 처리 된 MSCs에서 LINE-1의 메틸화 분석에 이르기까지 전술 한 기술에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 1).

<table><tbody>NTA 24웰 플레이트<tr><td>용</td> <td>1mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3524</td><td>MSC 세포 배양</td></tr><tr><td>3730xl DNA 분석기</td><td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td><td>3730XL</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima LE-80K 초원심분리기</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BlueStar Prestained Protein Marker</td><td>Nippon Genetics</td><td>MWP03</td><td>WB: protein marker</td></tr><tr><td>Calnexin (clone C5C9)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>WB, dilution 1:800</td></tr><tr><td>CD63 (clone H5C6)</td><td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>WB, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>5703000010</td><td>컨디셔닝 배지 및 세포용</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810000010</td><td>96웰 플레이트</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(폴리알로머, 14x95 mm)</td><td>Beckman</td><td>331374</td><td>초원심분리</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX 배지</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>AT-MSC 배양용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ 크기 표준</td><td>적용 Biosystems, Life Technologies</td><td>4322682</td><td>모세관 전기영동</td></tr><tr><td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA2-10RXN</td><td>for MSPA negative control</td></tr><tr><td>Hi-Di formamide</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4311320</td><td>모세관 전기영동</td></tr><tr><td>HOS-143B 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hsp70 (클론 5G10)</td><td>BD Biosciences</td><td>554243</td><td>WB, 희석 1:1000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 안티 마우스</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>WB: 2차</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 안티 토끼</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>WB: 표</td></tr><tr>1의 보조<td>LINE-1 프로브 믹스 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>염기서열</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트(바코드</td><td>포함) Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4306737</td><td>또한 밀봉 필름이 필요합니다</td></tr>. <tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td>단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>MiniProtean TGX 10% gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1034</td><td>WB: gel electrophoresis</td></tr><tr><td>NanoSight LM14C</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>for NTA</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane 0.2 &micro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td>WB: 단백질 전달</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue XS</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740901.50</td><td>DNA 추출용</td></tr><tr><td>Odyssey 차단 버퍼</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td>WB: 차단, 항체</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>DE17-602E</td><td>항생제 배양 배지</td></tr><tr><td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td>Evs REVERT</td></tr><tr><td>Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td><td>Li-Cor</td><td>926-11015</td><td>WB: 총 단백질 염색</td></tr><tr><td>RKO 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2577</td><td>MSPA 양성 대조군</td></tr><tr><td>RPMI 배지 1640 + GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>HOS-143B 세포 배양용</td></tr><tr><td>SALSA MLPA HhaI 효소</td><td>MRC-Holland</td><td>SMR50</td><td></td></tr><tr><td>SALSA MLPA 시약 키트</td><td>MRC-Holland</td><td>EK1-FAM</td><td></td></tr><tr><td>SALSA MLPA P300 프로브 믹스</td><td>MRC-Holland</td><td>P300-100R</td><td></td></tr><tr><td>스윙 로터 SW-28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342207</td><td>초원심분리</td></tr><tr><td>주사기 필터, 0.22 &마이크로; m</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-030</td><td>멸균 여과 FBS</td></tr><tr><td>Tecnai 12</td><td>FEI Company</td><td></td><td>Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA) 장착; TEM</td></tr><tr><td>TBS, 1X 정제</td><td>Medicago</td><td>09-7500-100</td><td>WB: 버퍼</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>WB:</td></tr><tr><td>전사 열 순환기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>세포</tr> TSG101 (클론 4A10)<tr><td>의 트립신화를 위한</td>TCA0096<td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td></tr> (<tr><td>클론 4A10)</td><td>Sigma</td><td>SAB2702167</td><td>WB, 희석 1:500</td></tr></tbody></table>

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 line-1 메틸화 분석

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

메틸화 특이적 프로브 증폭(MSPA)은 DNA 샘플의 메틸화 수준에서 상대적 차이를 감지하는 데 사용할 수 있는 간단하고 강력한 기술입니다. 그것은 수완이 많고, 소량의 DNA를 필요로하며, 실습 작업의 약 4-5 시간을 취합니다. 제시된 기술에서, DNA 견본은 대조물로 메틸화되거나 참조 사이트에 DNA를 표적으로 하는 탐사기로 그 때 첫째로 변성됩니다. 혼성화된 DNA는 병렬 반응으로 분리되고, 하나는 결찰만 을 겪고 다른 하나는 메틸화되지 않은 GCGC 서열에서 HhaI 매개 소화에 이어 결찰을 겪습니다. 결과 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭되고 모세관 전기 동아에 의해 분리됩니다. 메틸화 GCGC 사이트는 HhaI에 의해 소화되지 않고 피크 신호를 생성하지만, 메틸화되지 않은 GCGC 사이트는 소화되고 피크 신호가 생성되지 않습니다. 각 샘플의 소화 및 소화되지 않은 버전의 제어 정규화 피크를 비교하면 DNA 샘플의 메틸화 투여 비율이 제공됩니다. 여기서, MSPA는 중간엽 줄기 세포에서 긴 산재핵 원소-1(LINE-1)의 메틸화 상태에 대한 골육종 유래 세포간 소포(EV)의 효과를 검출하는데 사용된다. LINE-1s는 전형적으로 암에 있는 hypomethylation를 겪는 반복적인 DNA 원소이고, 이 수용량에서, biomarker로 봉사할 수 있습니다. 초원심분리는 또한 생물학적 유체로부터 세포외 소포를 분리하는 비용 효율적인 방법으로 사용됩니다(즉, EV고갈린 태아 소 혈청 [FBS]을 준비하고 골육종 컨디셔닝 매체[차동 원심분리])에서 EV를 분리하는 경우). 메틸화 분석을 위해 맞춤형 LINE-1 프로브는 LINE-1 프로모터 서열과 7개의 제어 부위에서 3개의 메틸화 부위를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 LINE-1 메틸화 분석을 위한 MSPA의 사용을 보여주고 초원심분리에 의한 EV 고갈 된 FBS의 제조를 설명합니다.

본 연구의 주요 목표는 MSC에 대한 OS-EV의 후생유전학적 효과를 평가하는 것이었다. 일반적인 EV 마커 CD63, Hsp70 및 TSG101의 표현은 OS-EV의 존재를 확인하였다. (그림2A). 칼넥신 신호의 부재는 OS-EV 분리물의 순도를 나타냈다. 순도의 추가 표시는 TEM으로 관찰되었고, 다양한 크기의 온전한 소포가 존재하였다(도2B). 평균 OS-EV 입자 농도는 7.63x10 11/mL(도2C)이었다. 전기자동차의 크기 분포는 50-500 nm에 속했으며, 입자의 약 80%가 50-200nm범위(그림2D)내에 속합니다.
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여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA 메틸화는 가장 연구된 후성 유전학 적 서명 중 하나입니다. 많은 암은 비정상적인 유전자 발현 및 기타 유전체 이상과 관련된 DNA 메틸화 수준의 변화를 특징으로합니다. 긴 산재 된 핵 원소는 일반적으로 메틸화의 높은 수준을 가지고 반복형 전이 게놈 서열이다.그러나, 그(것)들은 수시로 그들의 활성화 귀착되고 염색체 불안정으로 이끌어 내는 암에 있는 과질하게 됩니다. 이 연구에서는, 우리는 암 EV가 MECs에 있는 LINE-1 메틸화에 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위하여 골육종 유래 외세포 소포를 가진 중간엽 줄기 세포를 처리했습니다. 포유류 세포 배양 배지의 일체성분인 태아소 혈청에는 많은 수의 소 유래 전기자동차가 포함되어 있다.이러한 Evs는 관심있는 세포에서 Evs의 분석을 방해할 것이므로 EV 격리를위한 세포가 증가할 때 EV 고갈 된 FBS를 사용하는 것이 중요합니다. 초원심분리기 튜브에 FBS를 가져 와서 초원심 분리기 양동이에 넣습니다. 버킷을 스윙 로터에 로드하기 전에 버킷을 10 밀리그램 이내로 조정합니다.초원심분리기에 로터를 놓고 섭씨 4도에서 19시간 동안 100G, 000G로 실행합니다. 실행 후, 조심스럽게 상체의 밝은 색깔의 상층층을 수집하고 50 밀리리터 튜브로 전송합니다. FBS의 전기가 포함되어 있으므로 어두운 갈색 펠릿을 방해하거나 파이프하지 마십시오.0.22 미크론 필터를 통해 새로운 50 밀리리터 튜브에 상수체를 전달합니다. 이 필터 멸균, EV 고갈된 FBS는 이제 EV 절연을 위한 세포를 성장시킬 때 세포 배양 매체에 추가할 수 있습니다. EV 고갈된 매체에서 자란 골육종 세포로부터 조건된 미디어를 수집합니다.세포와 세포 이물질을 제거하려면 조건부 미디어를 섭씨 4도에서 20분 동안 2500G로 원심분리합니다. 상체를 초원심분리기로 옮기고 이전과 같이 균형을 잡을 수 있습니다. 100, 000 G에서 4도에서 2시간 동안 튜브를 원심분리합니다.상체를 조심스럽게 폐기하여 바닥에 약 1 밀리리터를 남깁니다. EV 펠릿을 세척하고 다시 중단하기 위해 튜브와 파이프에 약 20 밀리리터의 PBS를 넣고 부드럽게 파이프를 넣습니다. 튜브의 균형을 맞추고 동일한 설정으로 또 다른 초원심 분리를 수행합니다.상체를 조심스럽게 제거하고 부드러운 파이펫팅으로 PBS의 200 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단합니다. 바인딩이 낮은 튜브에 전기 를 저장합니다. 정제 된 전기는 서양 블로팅, 나노 입자 추적 분석 및 전송 전자 현미경 검사를 특징으로합니다.플레이트 15, 000 MSC 는 24 웰 플레이트에서 잘 합니다. 24시간 후, 오래된 미디어를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, EV 고갈된 매체로 변경한다. 예약된 시간 지점에서 OS-EV로 셀을 처리합니다.EV 치료를 중지한 후 적절한 방법을 사용하여 세포로부터 DNA를 추출한다. 메틸화 분석을 위해, 우리는 사용자 정의 만든 메틸화 별 프로브 증폭 방법을 사용했다. 이전에 와 같이 Pavicic 및 다른 사용자가 사용자 정의 된 LINE-1 프로브를 설계합니다.메틸화 프로브의 경우 프로모터 영역 내에서 HhaI 제한 부위를 포함하는 세 가지 서열을 선택합니다. 제어 프로브의 경우 LINE-1 시퀀스의 나머지 부분에서 HhaI 제한 사이트가 부족한 7개의 시퀀스를 선택합니다. TE 버퍼에서 DNA 샘플 70나노그램을 5마이크로리터로 희석시킵니다.샘플을 섭씨 98도에서 10분간 가열한 다음 섭씨 25도로 식힙니다. 각 샘플에 프로브 혼성화 믹스의 3개의 마이크로리터를 추가하고 열순환기를 실행하여 프로브가 DNA에 혼성화될 수 있도록 합니다. 실온에서 각 샘플에 30 마이크로리터의 혼성화 후 믹스를 추가합니다.10 마이크로리터를 두 번째 튜브로 옮기. 두 튜브 세트를 온도 순환기에 놓고 적어도 1 분 동안 섭씨 48도에 인큐베이션하십시오. 샘플은 섭씨 48도에 있지만 첫 번째 튜브 세트에 10 마이크로리터의 결찰 믹스와 두 번째 튜브 세트에 결찰 소화 믹스 10 마이크로리터를 추가합니다.다음 열실균 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 튜브를 회전시키고 동시에 온도 순환기를 섭씨 72도로 설정합니다. 각 튜브에 폴리머라제 믹스 5마이크로리터를 추가하고 튜브를 열순환기에 넣습니다.PCR 프로그램을 실행합니다. PCR 프로그램이 실행되는 동안 크기 표준의 2.5 마이크로리터를 포함하는 1 밀리리터 포머미드의 솔루션을 준비합니다. 광학 96 웰 플레이트의 각 행에 이 솔루션의 파이프 10 마이크로리터.PCR 후, 소화되지 않은 시료와 소화된 샘플을 각각 1~100~200개로 희석하여 초순수수에 희석시켰다. 희석 PCR 제품의 마이크로리터 2개를 96웰 플레이트에 추가합니다. 기포를 제거하기 위해 15~20초 동안 플레이트를 200G에서 원심분리합니다.모세관 전기 포근에 의해 샘플의 단편 분석을 수행합니다. 모세관 전기포레시스를 열어 전자페로그램 분석 소프트웨어가 생성됩니다. 샘플을 선택하고 메뉴에서 패널을 MLPA로 설정합니다.패널을 클릭하고 제어 D를 눌러 모든 샘플에 이 설정을 적용합니다. 비슷한 방식으로 분석 방법을 모든 샘플에 대해 마이크로위성 기본값으로 설정합니다. 모든 샘플을 선택하고 그린 플레이 버튼을 클릭하여 분석을 실행한 다음 모든 샘플을 선택하고 그래프 버튼을 클릭하여 프로브 피크를 시각화합니다.피크 영역을 확대하여 개별 피크의 더 높은 해상도를 확인합니다. LINE-1 프로브 믹스의 프로브에 해당하는 10개의 피크가 모두 레이블이 지정되어 있는지 확인합니다. 유전자형 탭에서 결과를 CSV 형식으로 내보냅니다.데이터 분석 소프트웨어에서 CSV 파일을 열고 데이터를 열로 정렬합니다. 크기에 따라 세 개의 메틸화 사이트 피크에 레이블을 지정합니다. 나머지 7개의 피크는 제어 프로브에 해당합니다.여기서 우리는 대략 117베이스 쌍의 크기가 있는 LINE-1 2M 프로브 봉우리를 사용하고 있습니다. 각 샘플에 대해 7개의 컨트롤 피크의 합계 피크 영역을 계산합니다. 각 LINE-1 프로브의 피크 영역을 이 합계로 나눕니다.각 샘플에 대해, 소화되지 않은 샘플의 값을 메타투여량 비율을 얻기 위해 소화된 시료의 값을 나눕니다. 서양 블로팅 분석은 TSG101, HSP70 및 CD63에 대해 관찰된 신호와 함께 OS-EV의 존재를 확인했습니다. 칼넥신 신호의 부재는 EV 샘플이 순수했음을 나타냈다.순도의 추가 표시는 OS-EV 샘플에 존재하는 다양한 크기의 온전한 소포와 함께 TEM으로 관찰되었다. OS-EV 입자 농도 및 크기 분포는 NTA에 의해 측정되었다. 전기자동차의 80%는 50~200나노미터의 크기 범위에 있었다.여기서 우리는 EV 치료의 다른 시점에서 MSC로부터 LINE-1의 메틸화 투여 비율을 볼 수 있습니다. 회색 선은 시간 점 0에서 기준메틸화 수준을 나타냅니다. 시점에서 3, EV의 투여 후 평균 메틸화 투여 비율이 감소하여 고메틸화를 나타낸다.이 과다 메세팅 효과는 7시에 덜 두드러집니다. 여기에서 우리는 메틸화 분석을 위한 간단하고, 매우 민감하고, 견고한 기술을 보여주었습니다. 그것은 관련된 bisulfite 변환없이 DNA의 낮은 양을 필요로 하고 또한 파라핀 임베디드 견본에서 분리된 DNA에 적합합니다.실험 및 분석 부품의 전체 방법은 약 2 일이 걸립니다. 게놈에서 LINE-1의 높은 복사 수로 인해 LINE-1의 기준형 메틸화는 정상 샘플에서 높습니다. 따라서, 이 방법으로 관찰된 바와 같이, 샘플의 메틸화 수준의 차이는 미묘할 수 있다.

line-1-methylation-analysis-mesenchymal-stem-cells-treated-with

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

배우세요 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석 방법입니다. 메틸화 특이 프로브 증폭법을 활용하여 암 관련 후성유전학적 변화를 연구하고 세포 간 소통 메커니즘을 규명합니다.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

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