Detection of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells(간 종양 세포의 맥락에서 자연 살해 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정)

오늘은 NK 세포 기능을 연구하는 방법을 보여주는 두 가지 프로토콜을 시연하려고 합니다. NK 세포 기능에는 두 가지 주요 측면이 있는데, 그것은 종양 세포를 박멸할 수 있다는 것과 종양 마이크로 환경으로 이동할 수 있다는 것입니다. 이 두 가지 프로토콜은 종양 세포를 박멸하는 NK 세포의 능력을 입증할 것이며, 또한 종양 마이크로 환경으로 이동할 수 있습니다.

따라서 오늘 우리가 시연할 두 가지 프로토콜은 간단하고, 무선 활동을 사용할 필요가 없으며, 분자 생물학 및 세포 배양 작업을 수행할 수 있는 능력이 있는 대부분의 실험실에서 확립할 수 있습니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Suresh Bugide와 Suresh Chava가 오늘 이 두 가지 프로토콜을 시연할 예정입니다. 2개는 LDH를 사용하여 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하고, 먼저 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 100mm 세포 배양 페트리 접시에서 인간 간암 세포주를 70-80% 포화도로 성장시킵니다.

실험 당일, 세포가 플레이트 바닥에서 분리될 때까지 1ml의 0.25% 트립신 EDTA로 세포를 처리하기 전에 5ml의 PBS로 배양액을 세척합니다. 단일 세포 현탁액이 얻어지면 세포에 10ml의 세포 배양 배지를 추가하고 원심분리를 위해 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 펠릿을 5ml의 PBS로 세척한 후 신선한 배양 배지 농도의 10배에서 5번째 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 96 well plate에 치료 조건당 3 배로 타겟 human livercancer cell 100 μl를 seed하고, 각 타겟 cell well에 100 microlit의 배지 중 5번째 human NK cell에 10 x 10을 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 3시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 각 웰에서 100마이크로리터의 상등액을 새로운 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.

50마이크로리터의 LDH 기질을 각 웰에 넣고 철저한 혼합을 통해 플레이트를 빛으로부터 보호된 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 50 마이크로 리터의 정지 용액으로 반응을 정지시키고 즉시 490 및 680 나노 미터에서 플레이트 리더에서 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 공식을 사용하여 NK 세포 독성 퍼센트를 계산합니다.

인간 간암 세포주세포를 70-80% 농도로 성장시킨 후 칼세인 AM을 사용하여 NK 세포 매개 세포독성을 평가하기 위해 시연된 바와 같이 세포를 3ml의 무혈청 DMEM에 다시 현탁시키고 실온에서 30분 동안 1.5마이크로리터의 10밀리몰 칼세인 AM 용액으로 세포를 라벨링합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 세척당 5ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 배양 배지 농도 밀리리터당 5번째 세포의 1배에서 10배로 세포를 다시 현탁시키고 처리 조건당 3배로 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 추가합니다.

다음으로, 100 μl의 배양 배지에 10 내지 5 번째 인간 NK 세포를 1 회 동안 타겟 세포의 각 웰에 넣고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 4 시간 동안 놓습니다. 배양 종료 후, 10배 배율로 형광 현미경에서 각 처리 조건의 각 복제에 대해 calcein AM 양성 세포의 최소 10개의 서로 다른 이미지 필드를 캡처합니다. 그런 다음 공식을 사용하여 세포 독성 백분율을 계산합니다.

화학주성 자극에 대한 반응으로 NK 세포의 이동을 측정하기 위해 70-80%의 confluent 배양액에서 인간 NK 세포를 채취하여 무혈청 NK 세포 배양 배지 농도의 10-6번째 세포의 2.5배로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 웰당 관심 NK 세포 화학유인물질을 함유한 600마이크로리터의 무혈청 배지를 추가하고 5마이크로미터 공극이 있는 6.5mm 직경의 배양 삽입물 1개를 각 배지 웰에 놓습니다. 그런 다음 100마이크로리터의 NK 세포를 각 삽입체의 상단 격실에 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 4시간 동안 넣습니다.

배양이 끝나면 각 웰의 바닥에서 비부착성 이동 세포의 전체 부피를 개별 5ml FACS 튜브로 옮기고 각 튜브에 미리 결정된 수의 유세포 분석 계수 비드 50마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기를 사용하여 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 각 세포 샘플을 평가하고 공식을 사용하여 마이그레이션된 NK 세포의 절대 수를 계산합니다. ATF4 knockdown은 비특이적 short hairpin RNA를 발현하는 NK 세포에 비해 NK 세포 매개 세포 독성을 크게 감소시킵니다.

칼세인 AM으로 염색한 후, NK 세포 없이 배양한 인간 간암 세포에 비해 인간 NK 세포와 공동 배양 후 생존 가능한 인간 간암 세포의 수가 감소합니다. 예상대로, 짧은 헤어핀 RNA를 통한 ATF4 녹다운은 이러한 배양물에서 더 많은 수의 칼세인 AM 양성 세포에 의해 입증된 바와 같이 인간 간암 세포의 NK 세포 매개 사멸을 감소시킵니다. 또한, 케모카인이 없는 대조 배지에 노출된 NK 세포에 비해 케모카인 함유 배지에 대한 반응으로 상당히 높은 양의 NK 세포 이동이 관찰됩니다.

NK 세포 독성 평가를 위해서는 각 암 세포주에 대한 노력과 목표 비율 및 배양 시간을 표준화하는 것이 중요합니다. 표준물질이 확인되고 검증되면 in vitro 평가는 종양 세포 박멸에 대한 역할을 추가로 평가하기 위해 in vivo 마우스 실험으로 보완됩니다.