Name: 간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 배우세요 간 종양 세포에서 NK 세포 매개 세포독성 및 이동을 측정하는 비방사성 프로토콜을. LDH 및 Calcein AM 분석법을 활용하여 NK 세포 기능을 연구하고 암 면역 치료 전략 수립에 기여합니다.

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1. NK 세포와 간 종양 세포에 대한 배양 배지의 준비
<ol><li>인간 자연 킬러 세포(예를 들어, NK92MI) 및 인간 간암 세포주(예를 들어, SK-HEP-1)를 사용한다.</li>
	<li>NK92MI 인간 NK 세포에 대한 NK 세포 배양 배지를 준비하여 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드없이 최소 필수 배지 이글 알파의 500 mL에 다음 성분을 추가하여 지시된 최종 농도에: 0.02 mM 엽산 (100 mM 엽산의 100 μL), 0.2 mM myoinososol (50 0 0 0 00 mMmyoosososososo 0.1 mM β-메르카프토에탄올(3.5 μL 의 14.3M β-메르카페탄올), 2mM L-글루타민(200 mM L-글루타민 5mL), 페니실린/보레미신 1%(페니실린/스트렙토마이신 500% 5mL), 세럼 (FBS) 및 12.5 % 말 세럼. 0.22 μm 멸균 여과 장치를 사용하여 혼합 및 필터멸하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>2 mML-글루타민을 함유하는 고당포도당 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 간 종양 세포주 SK-HEP-1에 대한 배양 배지를 준비한다.</li>
</ol>2. 반색 LDH 측정 기반 NK 세포 매개 세포 독성 분석
<ol><li>SK-HEP-1 세포를CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5%CO2에서 100 mm 세포 배양 페트리 접시에서 70-80% 동률으로 성장시다. 1x 인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 먼저 세척된 세포를 제1 세척한 후,CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5%CO2에서 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL로 인큐베이션을 생성하여 단일 세포 현탁액이 생성될 때까지. 참고: NK 세포 활성은 암세포에서 NK 세포 활성화 리간드의 발현의 변화로 인해 스트레스암세포에 의해 유도될 수 있다. 따라서 건강한 암세포를 정확한 결과를 위해 사용해야 합니다. 또한 NK 세포 수용체 및 리간드가 트립시네이팅26,27에민감할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서 트립시니화 프로토콜을 신중하게 최적화해야 하며 과도한 트립시니화를 피해야 합니다.</li>
	<li>트립시니화 후, 15 mL 멸균 원추형 원추형 원심분리관에 160 x g에서 10 mL 및 원심분리기를 3분 동안 추가합니다. 세포 펠릿을 1x PBS 의 5 mL로 세척하고 배양 배지의 5 mL에서 다시 중단하십시오.</li>
	<li>병행하여, NK92MI 세포를 15 mL 멸균 원심분리관에서 3분 동안 160 x g에서 원심분리한다. 1x PBS의 5 mL로 세포 펠릿을 세척하고 NK92MI 세포 배양 배지의 5 mL에서 재중단합니다. 참고: NK92MI 세포는 NK 세포 배양 배지에서 성장하고 2.1단계에서 기재된 바와 유사하게 수득된다.</li>
	<li>혈세포계 또는 사용 가능한 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 SK-HEP-1 및 NK92MI 세포를 계산하십시오.</li>
	<li>SK-HEP-1 세포(표적 세포)(1 x 104/100μL/well)와 NK92MI 세포(이펙터 셀)를 1:10 타겟:이펙터 및 종자 96웰 플레이트의 삼중화 우물의 비율로 추가합니다.</li>
	<li>96웰 플레이트를 37°C에서 95% 공기와 5%CO2의 대기권에서 3시간 동안 배양한다. 배양 후, 실온에서 5 분 동안 450 x g에서 원심 분리기 플레이트.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않고, 각 웰로부터 100 μL의 상판을 수집하고 새로운 96 웰 플레이트에서 우물로 옮김.</li>
	<li>LDH 기판 50 μL을 넣고 잘 섞은 다음 어두운 실내 온도에서 20 분 동안 접시를 배양하십시오.</li>
	<li>50 μL의 스톱 액(50% 디메틸포마미드 및 20% 나트륨 도데실 황산나트륨을 pH 4.7에서 첨가하여 반응을 멈춥니다). 플레이트 리더를 사용하여 490 nm 및 680 nm에서 플레이트의 흡광도를 즉시 측정합니다.</li>
	<li>490 nm에서 흡광도에서 680 nm에서 흡광도를 뺍니다. 백분율 계산(%) 아래의 수식을 사용하여 NK 세포 세포 독성. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> 여기서 LDH 실험(이펙터 + 표적 세포)은 NK92MI 세포와 SK-HEP-1 세포의 흡광도이며, LDH 이펙터 세포는 NK92MI 세포만의 흡광도이며, LDH는 SK-HEP-1 세포의 흡광도가 단독으로, LDH 최대는 SK-HEP-1 세포의 흡광도이며, LDH 최대는 SK-HEP-1 세포의 흡광도입니다. 라시스 버퍼가 있는 셀. 참고: 혈청 간섭을 줄이려면 항상 다음 컨트롤을 사용하십시오: 표적 세포 단독(SK-HEP-1), 이펙터 셀 단독(NK92MI), 완전 용해 대조군으로 용해 완충액을 가진 표적 세포, 표적 세포 배지, NK92MI 배지 및 표적 세포 배지 및 NK92MI 배지는 1:1 비율입니다.</li>
</ol>3. 칼세인 AM 염색 기반 의 현미경 방법 NK 세포 매개 세포 독성 측정
<ol><li>배양 SK-HEP-1 세포는 70-80% 동률을 나타낸다. 1x PBS의 5 mL로 먼저 세척세포를 세척하고 1 mL의 트립신-EDTA를 1 mL로 인큐베이션하여 단일 세포 현탁액을 생성한다.</li>
	<li>원심분리기 SK-HEP-1 세포를 1mL 멸균 원심분리기 튜브에서 160 x g에서 3분 동안 3분 동안 재중단시켰다.</li>
	<li>SK-HEP-1 세포에 1.5 μL의 칼세인 AM 용액(10mM)을 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 15 mL 멸균 원심 분리튜브에서 160 x g에서 160 x g에서 3 분 동안 SK-HEP-1 세포를 염원분리기 칼세인.</li>
	<li>1x PBS 5 mL로 세포를 두 번 세척하여 과도한 칼세인 AM 염료를 제거합니다.</li>
	<li>병행하여, 15 mL 멸균 원심분리관에서 160 x g에서 NK92MI 세포를 3분 동안 살균원심분리기 튜브에. 세포 펠릿을 1x PBS 5 mL로 한 번 세척하고 NK92MI 세포 배지의 5 mL에서 다시 중단하십시오.</li>
	<li>계산 calcein AM 표지된 SK-HEP-1 세포 및 NK92MI 세포는 혈세포계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여.</li>
	<li>NK 세포 배지에서 1 x 105 세포/mL 및 NK92MI 세포에서 배양 배지에서 SK-HEP-1 세포를 1 x 106 세포/mL에서 재중단합니다.</li>
	<li>플레이트 칼세인 AM 표지 된 SK-HEP-1 세포 (표적 세포) (1 x 104/100 μL /well) NK92MI 세포 (이펙터 셀) (1 x 105/100 μL /well) (1 x 10 5 /100 μL/well) (1:10 표적: 이펙터 비율) 96 웰 플레이트에서 잘 있는 삼중 웰당.</li>
	<li>96웰 플레이트를 37°C에서 95% 공기와 5%CO2의 대기권에서 4시간 동안 배양한다. 배양 후, 10배 배율에서 형광 현미경을 사용하여 칼세인 AM 표지 세포의 형광 이미지를 캡처합니다. 각 치료 조건에 대해 각 복제의 적어도 10개의 서로 다른 필드를 캡처합니다.</li>
	<li>NK92MI 세포의 유무에 관계없이 배양된 각 복제 및 카운트 칼세인 AM 양성 표적 세포에 대해 무작위로 10개의 이미지를 선택합니다. 아래 의 공식을 사용하여 % 세포 독성을 계산합니다. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> 참고: 컨트롤로, NK92MI 세포 없이 대상 세포를 사용 하 여 완전히 용 해 제어로 완전히 용 해 대상 세포. 완전한 용해의 경우, 세포를 0.5% 트리톤 X-100에서 1 시간 동안 배양합니다 (배양 배지의 200 μL에서 5 % 트리톤 X-100의 20 μL).</li>
</ol>4. NK 세포 이동 분석
<ol><li>NK92MI 세포와 원심분리세포를 15 mL 멸균 원심분리관에서 3분 동안 160 x g에서 성장시다.</li>
	<li>세포 펠릿을 1x PBS 5 mL로 두 번 세척하고 무혈청 NK92MI 세포 배지의 3 mL에서 세포를 다시 중단시다. 혈세포계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 NK92MI 세포를 세다.</li>
	<li>플레이트 NK92MI 세포 (2.5 x 105 세포 / 100 μL / well) 트랜스 웰 투과 챔버의 상부 구획 (6.5 mm 직경 삽입 및 5 μm 기공 크기).</li>
	<li>하단 챔버에서 NK 세포 화학력 특성(예를 들어, 컨디셔닝된 배지, 케모카인, 사이토카인)에 대해 시험되는 무혈청 배지 함유 물질의 0.6 mL를 추가한다. 참고: 컨디셔닝 배지를 준비할 때, 혈청을 첨가하지 않고 감소된 혈청 배지를 사용하여 이동 분석에서 혈청 단백질의 간섭을 제거하십시오.</li>
	<li>4 시간 동안 37 °C에서 24 개의 투과성 챔버를 배양합니다. 4시간 후, 비부착 및 이동된 NK92MI 세포를 하단 챔버로부터 수집하고 이를 형광 활성화 세포 선별(FACS) 튜브로 옮겨 추가 분석을 위해 하였다. 참고: 배양 시간은 표적 세포의 종류뿐만 아니라 표적 세포에 의해 생성된 케모카인의 양 및 역학에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 이 시간은 각 세포 유형, 케모카인 및 실험에 대해 경험적으로 결정되어야 한다.</li>
	<li>이동된 NK 세포를 포함하는 각 튜브에 50 μL의 부피로 유세포 측정을 위한 소정의 계수 비드 수를 추가합니다. 자동화된 FACS 기반 셀 카운팅이 가능한 모든 유동 세포계를 사용하여 300 μL/well 셀 현탁액의 부피를 평가합니다. 참고: 사용 전에 매번 유세포측정을 위해 계수 비드를 혼합하거나 와류혼합하여 실험적 변동성을 최소화하기 위해 일정한 수의 비드를 사용한다. 정확도를 유지하기 위해 카운트 비드와 함께 역파이펫팅을 권장합니다. FACS 분석 컨트롤로 유세포 분석에 NK 세포만 사용하고 유세포 분석에 비드를 계수합니다. 저자는 적어도 10,000 구슬 + NK 세포를 결합하는 것을 추천합니다, 잘 일한 양. 그러나, 이 숫자는 실험 조건에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 비드 + NK 세포의 결합 수는 실험의 각 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 추가적으로, 통계적으로 유의한 결과를 달성하고 다른 세포 수 사이 가변성을 설명하기 위하여 생물학 삼각수를 사용하여 실험을 능력을 발휘하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>이 수식을 사용하여 마이그레이션된 NK92MI 셀의 절대 수를 계산합니다. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> 여기서 A = 셀 수, B = 비드 수, C = 할당된 비드 카운트(유세포 분석/50 μL에 대한 계산 비드 수, 이 예49,500) 및 D = 샘플 부피(μL). 참고: 300 μL의 시료 부피(마이그레이션된 세포)가 유세포 분석에 대해 50 μL의 구슬을 계산하는 FACS 분석에 사용되는 경우, 이동세포의 절대 수 = 1,700개의 세포 /3,300개의 비드 이벤트 x 49,500 비드/300 μL = 84.975μL. 샘플이 희석되거나 구슬을 계산하는 FACS의 다른 부피가 사용되는 경우 계산을 수정해야 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서 기술된 세포 독성 및 이동 방법은 악성 종양에서 암세포 및 NK 세포 매개 면역 회피 메커니즘에 대한 NK 세포 세포 독성을 평가하고 NK 세포 활성/기능을 향상시키는 치료제를 식별하는 데 사용될 수 있다. 프로토콜은 고전 적 방사능 기반 51크롬 방출 분석에 대한 간단하고 민감하며 재현 가능하며 바람직한 대안입니다. 이 프로토콜은 해석하기 쉬운 간단한 색채, 현미경 또는 FACS 기반 판독값을 통해 대부분의 실험실에서 사용하기에 쉽게 적응할 수 있도록 특별히 설계되었으며, 연구자들이 신뢰할 수 있는 결론에 도달할 수 있도록 합니다. 모두 높은 처리량 스크리닝 기반 접근 방식에 대해 확장 가능합니다. 프로토콜은 단 하나 간 종양 세포주의 맥락에서 제출되더라도, 그밖 암 세포 모형 및/또는 그밖 비암 표적 세포에 쉽게 적응될 수 있습니다.
제시된 모든 방법은 견고하고 재현 가능한 반면, 실험간 변이는 암세포와 NK 세포의 다른 배치로 발생할 수 있습니다. 결과가 실험의 결론을 정확하게 뒷받침할 수 있도록 생물학적 삼각을 사용하여 적어도 두 번 실험을 반복하는 것이 좋습니다.
이 방법의 한계는 NK92MI 세포의 성장 속도가 느려질 수 있다는 것입니다. 따라서 50개 이상의 샘플을 대상으로 한 실험의 경우 지연을 방지하기 위해 충분한 수의 NK92MI를 미리 재배해야 합니다. 또한 프로토콜에 설명된 모든 컨트롤은 가짜 및 재현불가능한 결과를 피하기 위해 구현되어야 합니다. NK 세포독성 분석의 또 다른 한계는 NK 대 암세포 비, 배양 시간뿐만 아니라, 각 표적 세포에 대해 최적화되어야 한다는 것이다. 예를 들어, 우리는 간암 세포주뿐만 아니라 여러 배양 시간 (2, 3, 4, 5, 6 시간)에 대한 NK 세포 (1 :5, 1 :10, 1 :20, 1 : 20, 1 : 40 및 1 :80)에 대한 암 세포의 다양한 비율을 테스트했습니다. 우리의 결과에 근거하여 우리는 NK 세포에 암세포의 1:10 및 1:20 비율과 3 시간 동안 배양으로 가장 일관된 결과를 관찰했습니다.
또한, 고형 종양으로부터 유래된 암세포는 배양판의 표면에 부착되고 성장하는 반면, NK 세포는 현탁액에서 성장한다. 배양 시간이 3 h보다 길면 초저 부착 96 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 NK 세포 유도 세포 독성 실험은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 분리 된 기본 NK 세포를 사용하여 수행 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 실험에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, 이러한 실험은 NK92MI 세포와 마찬가지로 쉽게 스케일링될 수 없습니다. 둘째, PMBC로부터 분리된 NK 세포의 세포독성 활성의 배치-배치 변이는 결과의 재현성 및 해석측면에서 문제가 될 수 있다. 유사하게, 다른 인간 NK 세포주들은 문헌에 기재되어 있으며, NKL세포(29)를포함하는 이러한 유형의 실험에 사용될 수 있다; 그러나, NK-92MI 세포와는 달리, NKL 세포는 IL-2 의존적이며 시판되지 않는다.
설명된 calcein AM 실험을 고려할 때, 칼세인 AM이 세포 사멸 후 세포 사멸 체에 남아 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다30. 따라서, 칼세인 AM 염색의 정량은 NK 세포 독성의 과소 평가로 이어질 수 있으므로 신중하게 수행되어야한다.
NK 세포 매개 세포 독성과 유사하게, 사이토카인 및 기타 화학유고력에 의한 NK 세포 이동의 변조는 NK 세포 기능의 조절에 중요한 역할을 한다. 여기서 설명된 NK 세포 이동 분석법은 케모카인 또는 화학유고력과 같은 자극의 맥락에서 NK 세포 이동을 평가하는 간단한 플랫폼을 제공한다. 이 분석은 NK 세포 이동을 촉진하거나 방해할 수 있는 제제를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 NK 세포 이동의 강화제 및 억압자를 식별한다. 이 방법은 또한 유전/후생유전학 변경 (upregulation 또는 downregulation) 또는 약물 처리 때문에 발생의 결과로 NK 세포 이동 조절 능력을 공부하는 데 유용 할 수 있습니다.
NK 세포 마이그레이션을 정확하게 측정하기 위해 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 컨디셔닝 된 매체를 사용하는 모든 실험의 경우, 정확한 측정을 얻기 위해 대조군 및 처리 조건 모두에서 동등한 컨디셔닝 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 배양 시간은 정제 된 화학 물질 및 컨디셔닝 된 배지로 다양합니다. 마지막으로, 트랜스웰 이동 성 평가는 잘 확립되고 NK 세포 이동을 평가하는 훌륭한 방법으로 간주됩니다. 그러나, 계산서에서 채택된 동종 단균 배양은 종양 미세 환경을 더 정확하게 모방할 지도 모르다 조직 또는 3D 문화의 복잡한 생리학 부족합니다.
따라서, 이 문서에서 제시된 NK 세포 세포 세포 독성 분석및 NK 이동 분석실험에 몇 가지 한계가 있지만, 이러한 분석법은 광범위한 면역학적 연구에 적용가능하며 따라서 NK 세포를 평가하기 위한 중요하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 기능 및 NK 세포 변조 면역 치료제.

인체가 비자아를 식별하고 이물질을 박멸하는 능력은 병원균과 악성 종양에 대한 인간의 생존의 핵심입니다1. 인간의 면역 반응은 이 과정에서 가장 중요한 역할을 한다2,3,4. 주요 특성 및 기능에 따라, 인간의 면역 체계는 크게 두 가지 주요 기능 그룹으로 분류 될 수 있습니다: 적응 면역 체계와 타고난 면역 시스템. 적응면역계통은 전형적으로 주어진 병원체에 특이적이며 면역학적 기억을 가지며, 따라서, 동일한 병원체5,6,7,8,9에의한 미래의 재감염에 오래 지속되고 반응한다. 대조적으로, 선천적인 면역은 그것의 표적 박멸에 있는 훨씬 더 넓고 상대적으로 비특이적입니다. 따라서, 전형적으로, 선천적인 면역 반응은 면역학적방어(10)의제1 라인으로서 역할을 한다. 자연살인자(NK) 세포는 선천적인 면역계통에 속하며 총 순환 림프구11의10-15%를 나타낸다. NK 세포는 2개의 중요한 기계장치를 통해 표적 세포를 근절합니다. 먼저, 활성화 리간드를 발현하는 표적 세포에 결합하면, NK 세포는 표적 세포12,13,14,15에서공동으로 세포사멸을 유도하는 외신세포증을 통해 막 파괴 단백질 퍼포린 및 세린 프로테아제 화강암을 방출한다. 부가적으로, 파슬 및 종양 괴사 인자 관련 세포자멸 유도 리간드(TRAIL)를 발현하는 NK 세포는 사멸 수용체(Fas/CD95)를 발현하는표적 세포와 상호작용하여 카스파제 의존적 세포사멸(16)을 유도한다. 가장 중요한 것은, NK 세포는 병원균-감염 또는 악성 세포를 근절하기 위해 항원 프리젠테이션과 같은 전자극을 필요로 하지 않는다; 따라서, 그들은 일반적으로 준비 - 투 - 킬 상태17,18에있습니다 . 종양 발달과 진행을 억제하고 암세포를 근절하기 위해 NK 세포는 종양 부위로 이동하고 종양 미세 환경에서 한 번 표적 세포를 식별하고 공격해야합니다.
과거에는 NK 세포 이펙터 기능이 주로 탈과립 및 세포독성 에 의해모니터링되었고, 19,20,21. NK 세포 세포 독성은 또한 51크롬 방출 분석술22,23,24,25에의해 측정될 수 있다. 그러나, 이러한 분석법은 감마 카운터의 필요성을 포함하여 몇 가지 특정 요건을 가지고 있으며, 방사성 물질의 취급 및 폐기에 대한 교육을 필요로 하며 사용자에게 위험 수준을 제기하는 방사능 기반이다. 따라서, 몇몇 새로운 비방사선작용제 는 NK 세포 활동을 공부하기 위하여 개발되고 채택되었습니다.
여기서, 우리는 NK 세포 매개 암 세포 박멸을 측정하는 두 가지 프로토콜, 착색 젖산 탈수소 효소 (LDH) 측정 기반 NK 세포 매개 세포 독성 분석 및 칼세인 아세톡시 메틸 (AM) 염색 계 현미경 방법을 설명합니다. 이 측정법은 방사성 동위원소의 사용을 요구하지 않으며, 간단하고 민감하며, NK 세포 기능을 조절하는 요인을 재현가능하게 식별합니다. 추가적으로, NK 세포 기능은 NK 세포 이동에 있는 변경을 감시하지 않고 완전히 평가될 수 없기 때문에, 우리는 또한 NK 세포 이동을 감시하기 위하여 유세포 측정 기지를 둔 정량적인 방법을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>절대 계수 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4256</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM 염료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>엽산</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>F8758</td><td></td></tr>, <tr><td>말 혈청</td>, <td>Gibco 16050114</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>Gibco</td><td>2530081</td><td></td></tr><tr><td>LDH 세포독성 분석 키트</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr>, <tr><td>myo-이노시톨</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>I5125</td><td></td></tr>, <tr><td>NK92MI 세포</td>, <td>ATCC</td><td>CRL-2408</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>SKHEP-1 셀</td><td>ATCC</td><td>HTB-52</td><td></td></tr><tr><td>트랜스웰 투과성 챔버</td><td>Costar</td><td>3241</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 용액</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

자연 살인자 (NK) 세포는 선천적인 면역 계통의 세포 독성 림프구 집단의 하위 집합이며 병원체감염, 악성 및 스트레스 세포를 제거하여 첫 번째 방어선으로 참여합니다. 암세포를 근절하는 NK 세포의 능력은 암과의 싸움에서 중요한 도구입니다. 몇몇 새로운 면역 기지를 둔 치료는 NK 세포 활동을 강화하거나 NK 세포 매개 박멸에 암세포의 감도를 증가에 의지하는 암 처리를 위한 조사되고 있습니다. 그러나, 이러한 치료 접근법을 효과적으로 개발하기 위해서는, NK 세포 매개 세포 독성 및 이동을 모니터링하기 위한 비용 효율적인 시험관내 세포학적 측정법도 필요하다. 여기에서, 우리는 암세포 (또는 그밖 표적 세포)에 NK 세포 세포 독성의 효력을 믿을 수 있고 재현가능하게 감시할 수 있는 2개의 시험관 내 프로토콜을 제출합니다. 이러한 프로토콜은 비방사능 기반이며 설정이 간편하며 처리량이 높은 스크리닝을 위해 확장할 수 있습니다. 또한 NK 세포 이동을 정량적으로 모니터링하는 유세포분석 기반 프로토콜을 제시하며, 이는 높은 처리량 스크리닝을 위해 확장할 수도 있습니다. 집합적으로, 이 3개의 프로토콜은 역기능 표적 세포를 근절하는 세포의 기능에 필요한 NK 세포 활동의 중요한 양상을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.

NK 세포 세포 독성 분석 및 NK 세포 이동 분석기는 모델 시스템으로서 SK-HEP-1 간 종양 세포주를 사용하여 수행되었다. LDH 분석법을 사용하여 NK 세포 세포 독성을 측정하기 위해, SK-HEP-1 세포는 비특이적(NS) shRNA 또는 shRNA 표적화 활성화 전사 인자4(ATF4)를발현하여 3시간 동안 96웰 플레이트에서 NK92MI 세포를 배양하였다(도1A). ATF4는 이전에 활성화된 리간드ULBP1(28)을상승시킴으로써 NK 세포 세포 독성을 조절하는 것으로 나타났다. NK 세포 매개 표적 세포 살멸과 관련된 LDH 활성은 프로토콜 1에 기재된 공식을 사용하여 유색및 세포독성을 측정하였다. ATF4 녹다운은 NS shRNA를 발현하는 NK 세포에 비해 NK 세포 매개 세포 독성을 현저히 감소시켰습니다(도1B-D). 우리는 또한 칼세인 AM 염색계 분석기를 사용하여 NK 세포 세포 독성을 측정했습니다. 이를 위해, NS shRNA 또는 ATF4-표적화shRNA를 발현하는 SK-HEP-1 세포는 도 2A에도시된 바와 같이 96웰 플레이트에서 NK92MI 세포로 배양하고 칼세인 AM으로 배양하였다. 배양 후, CALCEIN AM 양성 세포의 이미지는 FITC/GFP 필터를 사용하여 형광 현미경검사법에 의해 포착되었습니다. NK 세포에 의해 살해된 세포는 더 이상 칼세인 AM 염료를 유지하지 않기 때문에 이 접근법에 의해 검출되지 않는다. 도 2B,C에도시된 바와 같이, NK92MI 세포없이 성장한 SK-HEP-1 세포에 비해 NK92MI 세포와 공동 배양한 후 칼세인 AM 양성 SK-HEP-1 세포의 수가 감소한다. 그러나, 예상대로, SHRNA를 통한 ATF4 녹다운은 SK-HEP-1 세포의 NK 세포 매개 살해를 감소시켰으며, 더 많은 수의 칼세인 AM 양성 세포에 의해 관찰되었다(도2B,C). 따라서, LDH 기반 및 칼세인 AM 모두 일관된 결과를 보였고 ATF4 녹다운이 NK 매개 암 세포 세포 독성을 감소시킨다는 것을 확인했습니다. 이러한 이 방법 중 하나는 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기에 충분합니다; 그러나 두 메서드를 모두 사용 하 여 결과에 대한 엄격성과 신뢰도를 높이는 것이 좋습니다.
우리는 또한 24 웰 NK 세포 이동 분석의 결과를 제시한다. NK92MI 세포를 상부 챔버에서 무혈청 NK92MI 배지에 재혼하고, 케모카인, CC 모티프, 리간드2(CCL2)를 하부 투과챔버에 첨가하였다. NK 세포 이동은 섹션 3에 기재된 바와 같이 분석되었다(도3A). 이동된 NK92MI 세포의 수는 유세포 분석에 대한 계수 비드를 첨가하여 정량화하고 FACS 분석에 이어. 도 3B-C에도시된 바와 같이, 대조군 배지에 비해 CCL2 함유 배지로 이동한 NK92MI 세포의 수가 유의하게 증가하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> 도 1: 착색 LDH 활성 기반 NK 세포 매개 세포 독성 분석. (A)착색 LDH 활성 기반 NK 세포 세포 독성 분석의 주요 단계를 묘사하는 개략적. (B, C) ATF4 발현은 SK-HEP-1 세포에서 비특이적(NS) shRNA 또는 shRNA를 발현하여 ATF4를 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. (B)상대 ATF4 mRNA 수준은 NS shRNA 또는 ATF4 shRNA를 발현하는 SK-HEP-1 세포에서 ACTINB 수준으로 정규화 한 후 도시된다. (C)ATF4 및 액틴B 단백질 수준은 NS shRNA 또는 ATF4 shRNA를 발현하는 SK-HEP-1 세포에서. (D)NK 세포 매개 세포 독성은 LDH 방법에 의해 NS shRNA 또는 ATF4 shRNA를 발현하는 SK-HEP-1 세포에서 분석되었다. 퍼센트 (%) NK 세포 매개 세포 독성이 도시된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됩니다. ns, 중요하지 않음; ** p < 0.01, ***p & 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> 도 2: 칼세인 AM 염색계 현미경으로 NK 세포 매개 세포 독성을 측정하는 방법. (A)NK 세포 매개 세포 독성을 측정하기 위한 칼세인 AM 염색계 현미경 방법의 주요 단계를 묘사한 도식. (B)NK 세포 매개 세포 독성은 칼세인 AM 방법을 사용하여 NS shRNA 또는 ATF4 shRNA를 발현하는 SK-HEP-1 세포에서 분석하였다. 대표 이미지가 표시됩니다. 배율 막대 = 200 μm. (C)패널 B. **p&lt; 0.01에 제시된 실험에 대한 칼세인 AM 양성 세포의 백분율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> 도 3: FACS 기반 정량적 NK 세포 이동 분석. (A)FACS 기반 NK 세포 이동 분석의 주요 단계를 나타내포하는 도식. (B, C) NK 세포 이동 분석은 24웰 플레이트의 하단 챔버에 CCL2의 50 ng를 첨가한 후 수행되었다. (B)대표적인 NK 세포 이동 도트 도트 플롯을 제어 또는 CCL2 처리 배양 배지로 나타내고 있다. (c)NK 세포 이동 데이터(평균 ±SEM)는 패널 B. ***p&0.001에 도시된 실험에 대해 제시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

암세포에 의한 자연살해(NK) 세포 매개 박멸의 회피는 암 개시 및 진행에 중요하다. 여기에서, 우리는 간 종양 세포를 향해 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위하여 2개의 비 방사능 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다. 또한 NK 세포 마이그레이션을 분석하기 위해 세 번째 프로토콜이 제시됩니다.

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

우리는 NK 세포 기능을 공부하는 방법을 보여주는 오늘 두 개의 프로토콜을 시연 할 것입니다. NK 세포 기능의 두 가지 주요 측면은 종양 세포를 근절 할 수 있으며 종양 마이크로 환경으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 이 두 프로토콜 우리는 종양 세포를 근절하기 위하여 NK 세포 기능을 보여주고 또한 종양 마이크로 환경으로 이동할 수 있습니다.따라서 오늘 우리가 보여줄 두 프로토콜은 간단하며, 무선 활동의 사용을 요구하지 않으며 분자 생물학 및 세포 배양 작업을 수행 할 수있는 능력을 가지고있는 대부분의 실험실에서 설립 될 수 있습니다. Suresh Bugide와 Suresh Chava, 내 실험실에서 두 박사 후 동료, 오늘이 두 프로토콜을 시연 할 것 이다. 2명은 LDH를 이용한 NK 세포 중재 세포 독성을 평가하고, 먼저 인간 간암 세포라인을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 100mm 세포 배양페트리 접시에서 70-80%로 성장한다.실험 당일, 세포가 플레이트 바닥에서 분리될 때까지 0.25%의 트립신 EDTA의 1밀리리터로 세포를 치료하기 전에 PBS의 5밀리리터로 배양을 세척한다. 단일 세포 현탁액이 수득되면 세포 배양 배지의 10 밀리리터를 세포에 추가하고 원심분리를 위한 15 밀리리터 원모형 튜브로 세포를 이송한다. 신선한 배양 배지 농도의 밀리리터 당 5 세포에 1회 10에 세포를 다시 중단하기 전에 PBS의 5 밀리리터로 세포 펠릿을 세척한다.다음으로, 표적인간 간암세포의 100마이크로리터를 96웰 플레이트에서 치료조건당 삼중항에 잘 첨가하고, 각 표적세포에 100마이크로리터를 통해 5번째 인간 NK 세포에 1회 10배를 첨가한다. 그런 다음 3 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿과 새로운 96 웰 플레이트의 개별 우물로 각 우물에서 100 마이크로 리터를 전송.LDH 기판 50마이크로리터를 철저하게 혼합하여 각 웰에 추가하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 50마이크로리터의 스톱 용액으로 반응을 체포하고 490 나노미터 및 680 나노미터의 플레이트 판독기의 흡광도를 즉시 측정합니다. 그런 다음 수식을 사용하여 NK 세포 세포 독성%를 계산합니다.NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위해 인간 간암 세포 세포 세포를 70-80%로 성장한 후 혈청이 없는 DMEM의 3밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 실내 온도에서 30분 동안 10밀리알라 칼세인 AM 용액의 1.5 마이크로리터로 세포를 라벨로 표시하였다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 세척 당 PBS의 다섯 밀리리터와 함께 세포를 두 번 세척. 배양 배지 농도의 밀리리터 당 5세포에 10번으로 세포를 다시 중단하고 치료 조건당 96개의 웰 플레이트에 각각 100마이크로리터의 세포를 첨가한다.다음으로, 10~5차 인간 NK 세포에서 100마이크로리터의 배양 배지를 각각 표적 세포에 배치하고 4시간 동안 세포 배양 배양에 플레이트를 배치한다. 인큐베이션이 끝난 후, 형광 현미경의 각 복제에 대해 칼세인 AM 양성 세포의 이미지의 적어도 10개의 다른 필드를 10배 배율로 캡처한다. 그런 다음 수식을 사용하여 백분율 세포 독성을 계산합니다.화학적 자극에 대응하여 NK 세포 이동을 측정하기 위해 인간 NK 세포를 70-80%의 수렴 배양으로부터 수집하고 혈청이 없는 NK 세포 배양 배지 농도의 밀리리터당 6세포당 2.5배 10배에서 세포를 재중단한다. 다음으로, NK 세포 화학요법을 함유한 혈청 없는 배지 600마이크로리터를 첨가하고 직경 5마이크로미터기와 함께 직경 배양 인서트를 1개에 넣고 각 배지의 각 웰에 배치한다. 그런 다음 각 삽입물의 상부 구획에 100 마이크로리터를 추가하고 4시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.인큐베이션의 끝에서 비 부착 이동 세포의 전체 부피를 각각의 바닥에서 개별 5 밀리리터 FACS 튜브로 전송하고 각 튜브에 구슬을 계산하는 소정의 수의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 유량 세포계를 사용하여 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 각 세포 샘플을 평가하고 수식을 사용하여 마이그레이션된 NK 셀의 절대 수를 계산합니다. ATF4 녹다운은 비특이적 짧은 머리핀 RNA를 발현하는 NK 세포에 비해 NK 세포 매개 세포 독성을 현저히 감소시킨다.칼세인 AM으로 염색한 후 NK 세포 없이 배양된 인간 간암세포에 비해 인간 NK 세포와 공동 배양후 생존 가능한 인간 간암세포의 수가 감소한다. 예상대로, 짧은 헤어핀 RNA를 통한 ATF4 녹다운은 이러한 배양에서 칼신 AM 양성 세포의 큰 수에 의해 입증된 바와 같이 인간 간 암세포의 NK 세포 중재 살인을 감소시킨다. 또한, 화학세포 없이 제어배지에 노출된 NK 세포에 비해 화학세포 함유 배지에 대한 반응으로 상당히 높은 양의 NK 세포 이주가 관찰된다.NK 세포 세포 독성 평가에 대 한 우리의 노력 및 대상 비율 및 각 암 세포 줄에 대 한 잠복 시간을 표준화 하는 것이 중요 하다. 시험관 내 평가에서 표준이 확인되고 검증되면 종양 세포 박멸에서의 역할을 더 평가하기 위해 생체 내 마우스 실험으로 보충됩니다.

measurement-natural-killer-cell-mediated-cytotoxicity-migration

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Detection of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells(간 종양 세포의 맥락에서 자연 살해 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정)

이 비디오는 자연 살해 세포 또는 NK 세포를 포함한 림프구를 선택적 증식을 위해 인간의 간 조직에서 분리하는 방법을 보여줍니다. 효소 및 기계적 분해 후 밀도 구배 분리는 NK 세포를 포함한 림프구 분리를 촉진합니다. 수집된 림프구는 NK 세포의 선택적 증식에 추가로 사용될 수 있습니다.

선택적 확장을 위한 간 조직에서의 자연 살해 세포 분리

이 비디오는 Calcein AM 염색을 사용하여 암세포에 대한 자연 살해 세포의 세포 독성을 측정하는 분석을 보여줍니다. 자연살해세포(natural killer cell)와의 배양 후 형광암세포의 수가 감소한 것은 암세포에 대한 자연살해세포 매개 세포독성을 나타냅니다.

암세포에 대한 자연살해세포매개 세포독성을 평가하기 위한 Calcein Acetoxymethyl 염색

이 비디오는 화학유인물질에 대한 반응으로 다공성 멤브레인 삽입 시스템을 통한 자연살해(NK) 세포 이동을 연구하는 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 유세포 분석을 사용하여 NK 세포 이동에 대한 정량 분석이 가능합니다.

화학요법 자극에 대한 반응으로 자연살해세포(Natural Killer Cell Migration in Response to Chemotactic Stimuli) 측정

이 비디오는 표적 암세포에 대한 자연살해(NK) 세포의 세포독성을 결정하기 위해 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 분석은 형성된 붉은 색 생성물의 흡광도를 측정하여 암세포에서 세포질 젖산 탈수소효소의 방출을 정량화합니다.

암세포에 대한 자연살해세포독성 평가를 위한 체외 분석

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB) 내피 모델을 통한 림프구 이식에 대한 실험적 조사를 보여줍니다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 단층을 in vitro에서 생성하고, 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단층에 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하여 림프구 형질전환이 가능하도록 하고, 이동된 세포는 유세포 분석을 사용하여 정량화합니다.

미세혈관 내피 세포 단층을 통한 림프구 전이 연구

세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

Marginating-hepatic leukocytes는 다른 백혈구 집단에 비해 독특한 특성과 뚜렷한 면역 기능을 나타냅니다. 여기에서 우리는 쥐 또는 생쥐의 간을 강제 관류하여 이 특정 간 세포 집단을 선택적으로 수확하는 방법을 설명합니다. 변두리-간 백혈구는 간 관련 질환 및 전이에 대한 감수성을 결정하는 데 중요한 것으로 보입니다.

Marginating-간 백혈구의 선택적 수확

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

본 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 분리된 1 차적인 인간 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡을 측정하는 방법을 기술합니다, 휴식 또는 IL15 유도된 활성화에 따라. 설명된 프로토콜은 다른 사이토카인 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 1차 인간 NK 세포로 쉽게 확장될 수 있었다.

인간 자연 킬러 세포 대사의 분석

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 간 종양 세포에서 NK 세포 매개 세포독성 및 이동을 측정하는 비방사성 프로토콜을. LDH 및 Calcein AM 분석법을 활용하여 NK 세포 기능을 연구하고 암 면역 치료 전략 수립에 기여합니다.

간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

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