Name: 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 학습하세요 친유성 형광 염료를 이용한 Drosophila 배아 모터 뉴런 역행 추적 기법을 통해 신경 형태 발생과 연결성을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생물학 연구에 유용한 도구입니다.

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원고에 대한 의견에 대해 가미야마 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 NS107558(M.I., K.B., D.K.)에 의해 지원되었습니다.

1. 장비 및 소모품
<ol><li>배아 를 수집하고 알을 낳기 위해 성인을 훈련하기위한 자료<ol>
<li>튜브와 캡 사이에 100μm(재료표)의기공이 있는 메쉬 필터를 설정하도록 캡에 구멍을 열어 50 mL 튜브를 절단하여 여과 장치를 준비한다. 참고: 또는, 100 μm(재료표)의기공을 가진 세포 스트레이너는 배아 수집의 여과 단계에 사용될 수 있다.</li>
		<li>나열된 지침에 따라 포도 한천 프리 믹스(재료 표)로한천 접시를 만듭니다. 간단히, 분말 혼합물 1 패킷을 실온(RT, 23°C)dH2O의 500 mL로 부드럽게 저어주고 용해된 혼합물을 전자레인지에 넣고 힘차게 끓입니다. 70-75 °C로 냉각 한 후, 페트리 접시 (60mm)에 혼합물을 부어. 한천이 고화된 후 플레이트를 4°C로 저장합니다.</li>
		<li>활성 건식 효모(재료표)와물을 페이스트 일관성에 혼합하여 효모 페이스트를 준비하고 4 °C에서 유지합니다.</li>
		<li>충분한 공기 흐름을 제공하는 계란 수집 케이지 (60mm 페트리 접시, 재료 표)를사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해부 바늘 및 염료 주입 마이크로 파이펫의 준비<ol>
<li>내경 0.6 mm와 외경 1.2 mm(재료 표)와같은 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로 파이펫 및 해부 바늘을 준비합니다. 170V 최대 출력(재료 표)에서7 %의 마이크로 파이펫 풀러로 모세관 튜브를 당겨 길이 ~ 0.4cm의 테이퍼로 날카로운 바늘을 만듭니다.</li>
		<li>염료 주입의 경우, 기기 매뉴얼에 설명된 기포 베벨링 기술로 마이크로파이펫 베벨러(재료표)로마이크로파이펫을 조정합니다.<ol>
<li>즉, 바늘 끝을 '끌기'에서 물을 방지하기 위해 젖은 제(재료의 표)로분쇄기를 담급니다. 마이크로파이펫 클램프에 바늘을 25-30°로 놓고 경외도의 3분의 2로 기울어진 표면의 중심에서 팁을 낮춥습니다. 튜빙이 있는 주사기가 바늘에 공기를 밀어 넣는 동안 바늘을 갈아서 마이크로파이펫이 유리 면도를 제거하도록 합니다.</li>
			<li>마이크로파이펫을 미세팁 영구 마커로 표시하여 비스듬히 형성되는 마이크로파이펫의 좁은 개구부를 찾기가 어렵기 때문에 경구 후 팁에서 개구부위치를 나타낸다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 배아 수집 준비
<ol><li>성인 파리 (20-40 야생 형 캔톤-S 또는 흰 파리), 수컷과 암컷이 어린 (&7 일)에서 유지되고 이상적인 계란 수집을위한 건강한 조건이 유지되도록하십시오. 참고 : 계란 누워를 자극하기 위해, 파리는 적어도 매일 한 번 효모 페이스트 줄무늬 한천 접시에 계란 수집 전에 며칠 자신의 계란 수집 케이지에서 훈련된다.</li>
</ol>3. 배아 스테이징
<ol><li>파리가 RT에서 하룻밤 동안 알을 낳을 수 있도록 (또는 적어도 15 시간) 15 시간 AEL에서 배아를 수집, 즉, 단계 1618,aCC 및 RP3 운동 뉴런의 dendritogenesis를 볼 수 있습니다. 아침에, 계란과 접시를 수집합니다. 참고 : 15 시간 AEL의 배아는 뚜렷한 4 챔버 창자18을갖습니다. 화상 진찰을 위해 다른 단계는 그들의 특정 형태학 기준 및 노화 조건을 따릅니다.</li>
	<li>배아를 수집하기 위해 접시에 놓인 계란을 50 % 표백제5 분 동안 dechorionate.</li>
	<li>chorions가 삭제되면, 배아를 격리하기 위하여 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 판의 내용을 부어. 물 짜기 병을 사용하여 접시에 남아있는 표백제를 희석하고 혼합물을 필터에 디캔팅하여 가능한 한 많은 배아를 수집합니다.</li>
	<li>배아를 필터3-4x로 더 많은 물로 씻거나 표백제 냄새가 사라질 때까지 씻으소서. 장치에서 필터를 제거하고 배아를 물로 다른 깨끗한 접시에 씻으소서. 배아가 있는 새 접시에서 물을 데미트합니다.</li>
	<li>사각형을 형성, 중앙에 비닐 테이프의 두 층으로 덮여 유리 슬라이드를 준비합니다. 면도날을 사용하여 테이프에서 직사각형 풀을 잘라냅니다. 풀의 위쪽 끝쪽으로 양면 테이프의 얇은 스트립을 배치하면 그림 1과같이 배아가 배치됩니다.</li>
	<li>미세 한 집게를 사용하여 15 시간 AEL에서 5-10 배아를 개별적으로 선택하고 등쪽쪽이 위를 향하도록 양면 테이프에 놓습니다. 탈수로부터 배아를 보호하기 위해 해부 풀에 곤충 링거의 식염수19를 추가합니다(그림1).</li>
</ol>4. 해부 및 염색
<ol><li>해부 현미경(재료의 표)에서유리 바늘을 사용하여, 그것의 뒤쪽끝에서 그것의 전방 끝에 그것의 표면에 있는 단 하나 태아의 중간선을 통해 잘라냅니다. 그런 다음 배아를 테이프에서 비텔린 막에서 유리로 드래그합니다(그림 1에있는 상자). 배아의 내부 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드의 표면에 부착합니다(그림 1, 인세트).</li>
	<li>~300 μm의 팁 개구부와 튜브 연결 바늘을 사용하여 (해부 바늘의 얇은 끝을 파괴하여 제조), 흡인 또는 불어 공기를 분리하고 등쪽 세로 기관 줄기뿐만 아니라 나머지 용기를 제거합니다.</li>
	<li>인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 RT에서 5 분 동안 배아를 고정하십시오.</li>
	<li>1 μL의 항고추냉이 과산화항체로 배아를 염색하여 시안 3염료(anti-HRP Cy3)(재료표)로공액을 1시간 동안 PBS의 200 μL에 결합하였다. 참고 : 안티 HRP의 염료는 주입을위한 선택의 친유성 염료에 따라 변경할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 주입 마이크로 파이펫의 충전
<ol><li>사용 전에 에탄올: 식물성 기름을 1:10 혼합하여 친유성 염료(DiO 또는 DiD, 재료 표5 mg/mL)를 60°C로 가열합니다.</li>
	<li>주입 마이크로 파이펫오일 용해 염료 슬라이드를 준비합니다. 마이크로파이펫을 모세관 홀더에 넣습니다(그림2, #1). 마이크로 조작기(재료표)를사용하여 미세 파이펫을 염료 슬라이드 위에 조정합니다. 그런 다음, 마이크로파이펫을 염료 위에 놓도록 스테이지를 조정한다(도2,#2).</li>
	<li>마이크로파이펫을 채우려면 마이크로인젝터(재료표)를사용하십시오(그림2,#3). 200-500 hPa(hectopascal) 사이Pi(주입 압력)를 설정하여 마이크로파이펫에서 염료를 수집하고, Ti(주사 시간)를 0.1-0.5 s와 Pc(보상 압력)에서 5분 동안 0hPa로 설정하였다(도2,#4).</li>
	<li>염료가 수집되면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 단계에 놓습니다. 다음으로, Pc를 20-60 hPa 범위로 늘린 후 시료로 마이크로파이펫을 낮추어 모세관 작용에 의한 PBS의 오염을 방지합니다.</li>
</ol>6. 뉴런에 염료 주입
<ol><li>10x 대물렌즈(물자 표)로현미경을 사용하여 중앙에 배아를 찾아 배아와 미세피펫을 정렬합니다. 참고: 염료 방울의 크기는 Pi 또는 마이크로파이펫 팁의 개구부를 변경하여 조정할 수 있습니다. 물방울은 10-20 μm이어야하며, 이는 대략 1 근육의 폭입니다.</li>
	<li>대물 렌즈를 수중 침지 40x렌즈(재료 표)로변경하고 렌즈를 PBS에 담그어 배아를 확인합니다.<ol>
<li>형광 현미경 검사법을 사용하여 항 HRP Cy3로 표시된 신경 형태를 확인하고 주사 부위를 결정합니다.</li>
		<li>주사 중에 밝은 시야 현미경을 사용하여 염료 방울을 확인하십시오. 배아가 초점이 되면, 관심 있는 축의 끝(예를 들어, aCC, RP3)과 부드럽게 접촉하도록 마이크로파이펫의 위치를 변경한다.</li>
		<li>ACC 또는 RP3의 신경 근육 접합부에서 오른쪽 복부(A2−A6) 헤미세그먼트에 염료를 떨어뜨리고, 반대로 HRP Cy3로 표시된 뉴런을 사용하여 DiD 또는 DiO를 사용한다. 핸드 컨트롤(마우스; 도 2,5) 염료를 방출하고 마이크로조작기로 염료를 떨어뜨린 후 마이크로파이펫을 제거하고 다음 주사 부위로 이동한다. 참고 : 틈부 접합을 통해 이웃 세포로 퍼지는 다른 염료 (예 : 루시퍼 옐로우, 칼세인)와 는 달리, 친유성 염료는 세포막과 연관되고 이웃으로 전달되지 않습니다. 그러나 염료 방울의 크기가 비교적 크기 때문에 이 기술은 또한 파트너 근육의 라벨링을 초래합니다(그림3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 전에 염료 를 떨어 뜨린 후 1 시간 동안 RT에서 샘플을 배양하십시오. 참고: 프로토콜을 장착하기 전에 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플을 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다. 친유성 염료는 또한 세포내 직접 결합(DC) 증폭기가 쉽게 이용 가능한 경우이온토포레시스(20)를사용하여 전달될 수 있다.</li>
</ol>7. 공초점 현미경으로 화상 진찰
<ol><li>집게의 도움으로 유리 슬라이드에서 양면 테이프와 비닐 테이프를 제거합니다.</li>
	<li>4개의 모서리에 소량의 진공그리스(재료 표)로커버 슬립(22 x 22mm2 No.1 커버 글래스)을 준비하고 기포를 피하면서 시료에 조심스럽게 놓습니다. 작업 와이퍼를 사용하여 과도한 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>커버 슬립을 아래로 밀어 대물 렌즈와 샘플 사이의 작업 거리를 조정합니다. 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 완전히 밀봉합니다.</li>
	<li>공초점 현미경을 사용하여 10x 및 100x 배율로 이미지화.</li>
	<li>현미경(재료 표)에서원시 이미지를 처리하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다. 참고: 최상의 이미지를 위해 장착한 후 10분 이내에 관찰이 시작되어야 합니다. 그렇지 않으면 RT에서 염료는 주사 부위에 인접한 부위로 확산되어 이미징을 위한 원치 않는 배경을 만듭니다. 염료의 확산을 늦추기 위해, 샘플은 2 시간 동안 4 °C에서 저장될 수 있다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

신경 형태학을 공부하기위한 염료 라벨링의 사용은 유전 세포 라벨링 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 라벨링 기술은 운동 뉴런의 형태에 라벨링 및 이미징에 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 염료 라벨링 과정은 2 시간 미만이 걸리고 뉴런 돌기의 윤곽을 정의 할 수 있기 때문에 매우 빠릅니다. 대안으로, aCC에서 효모 GAL4 전사 인자를 발현하는 GAL4 라인을 선택하고, 상류 활성화 서열(UAS)에 의해 조절되는 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터와 교차하여 aCC 모터 뉴런을 가시화할 수있다(21). GFP 라벨링 기술은 유전적 십자가를 필요로 하므로 며칠이 더 걸립니다.
염료 라벨링의 또 다른 장점은 매우 높은 밀도로 플라즈마 멤브레인의 라벨링을 허용하는 것입니다. 친유성 염료의 충분한 밀도는 우리가 표지된 구조물의 세부사항을 해결하는 것을 허용하는 막의 모든 부분에 존재할 수 있습니다. 대조적으로, GFP 분자의 밀도...

Drosophila의 배아 운동 뉴런 시스템은 중추 신경계 (CNS)1,2,3의발달의 기초가되는 메커니즘을 분석하는 강력한 실험 모델을 제공합니다. 모터 뉴런 시스템은 생화학적, 유전적, 이미징 및 전기 생리학적 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 유전 적 조작 및 기능 분석은 단일 운동 뉴런2,4,5,6의수준에서 수행 될 수있다.
신경계의 초기 발달 도중, neuroblasts는 분할하고 glia와 신경의 다수를 생성합니다. 신경아세포의 배분과 유전자 발현 프로필 사이의 시공간적 관계는 이전에 상세히 조사되어왔다 7,8,9. 운동 뉴런 시스템의 경우, 배아 신경근육 접합부(NMJ)의 형성은 aCC(전방 코너 셀), RP2(원시 새우 2), 및 RP5 운동 뉴런2,10을사용하여 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, RP5 운동 뉴런이 초기 시냅스 접합을 형성할 때, 시냅스 전 및 시냅스 후 필로포디아는11,12,13을혼합한다. 이러한 직접적인 세포 통신은 NMJ 형성을 시작하는 데 필수적이다. 우리가 말초 신경 지점에 관하여 알고 있는 것과는 반대로, 어떻게 모터 수상돌이 CNS 내의 시냅스 연결을 개시하는지의 우리의 지식은 아직도 원시적입니다.
이 보고에서는, 우리는 친유성 염료의 micropipette 중재한 납품을 통해 태아에 있는 모터 신경의 역행 표지를 허용하는 기술을 제시합니다. 이 기술은 우리가 계란 누워 후 15 시간 (AEL)14에서헤미 세그먼트에 30 신체 벽 근육의 각각을 내음 38 모터 뉴런을 추적 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 철저하게 수많은 기능 의 이득 / 기능 상실 - 기능 의 상실 을 조사했다15,16,17. 우리는 최근에 모터 모수석 연결의 개시를 구동하는 분자 메커니즘을 해명하고 Dscam1-Dock-Pak 상호 작용이 aCC 모터뉴런(17)에서모수석 의 자성장 부위를 정의한다는 것을 입증했다. 일반적으로, 이 기술은 야생 형 또는 돌연변이 균주에 있는 어떤 배아 운동 뉴런든지의 표현형 분석에 적응할 수 있습니다, Drosophila 신경계의 기능적인 디자인에 새로운 통찰력을 제공하는 우리의 기능을 강화하.

<table><tbody><tr><td>10x 대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>40x 침수 렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>모세관 튜빙</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>잠자리 회전 디스크 컨포칼 유닛</td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>코닝</td><td></td><td>22x22 mm 스퀘어 #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DiI ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>니콘</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>스카치</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>다우 코닝 고진공 그리스</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>난자 채취 케이지</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>단종</td><td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 베벨러</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly 포도 한천 분말 프리믹스 패킷</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>나일론 그물 필터</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 16 % 용액, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>모든 EM 등급</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>시그마 알드리치에서 판매, 박스형 10x 용액</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>습윤제</td></tr><tr><td>직립 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>N / A</td><td>Eclipse Ci LED 광원</td></tr><tr><td>비닐 전기 테이프</td><td>스카치</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR 셀 스트레이너</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>효모</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>활성 건조 효모(RED STAR)</td></tr></tbody></table>

친유성 형광 염료를 사용하여 drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

우리는 Drosophila에있는 모터 신경의 역행 표지를 위한 기술을 기술합니다. 우리는 오일 용해 된 친유성 염료를 사용하고 마이크로 인젝터에 의해 배아 필렛 제제에 작은 물방울을 전달합니다. 그 막이 물방울에 의해 접촉되는 각 모터 신경은 그 때 급속하게 표지될 수 있습니다. 개별 운동 뉴런은 지속적으로 라벨을 부착하여 미세한 구조적 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 친유성 염료가 다양한 색상으로 제공된다는 점을 감안할 때, 이 기술은 또한 인접한 뉴런을 여러 가지 색으로 표시할 수 있는 수단을 제공한다. 이 추적 기술은 따라서 Drosophila의모터 뉴런 시스템에서 신경 형태 형성 및 시냅스 연결을 연구하는 데 유용합니다.

aCC 및 RP3 운동 뉴런의 대표적인 이미지는 15시간 AEL에서 운동 뉴런의 다색 라벨링을 입증하기 위해 도 3C에 도시되어 있다. 그들의 수지상 형태는 배아 사이에 크게 불변성입니다. 항-HRP 항체로 수득된 염색 패턴은 회색으로 나타내었다. DiO 또는 DiD의 작은 물방울은 각각 근육 1 또는 6/7의 NMJ에 증착되었다. 도 4는 관심 표현형을 정량적으로 측정하는 능력을 보여 준다. 우리는 돌연변이 (예를 들어, dscam1-/-)와 비교하여 야생 유형에서 덴드 라이트 팁의 총 수를 계산했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60716/60716fig1a.jpg">...

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

이 프로토콜에 설명 된 추적 기술은 우리가 신경 형태 발생을 연구하고 Drosophila의 운동 신경 시스템에서 연결을 스냅하는 데 도움이됩니다. 지포성 염료는 매우 높은 밀도로 세포막의 모든 부분에 빠르게 확산 될 수 있습니다. 이것이 우리의 프로토콜이 라벨이 붙은 뉴런의 구조를 찾기 위해 효율적으로 해결하는 이유입니다.축 사 단자가 주입 마이크로 파이프로 접근 할 수있는 경우,이 기술은 파리의 애벌레와 성인 단계 또는 다른 유기체에 어떤 뉴런에 적용 될 수있다. 시편의 정밀한 조작을 해부하거나 사용하는 경험이 없다면 어려울 수 있습니다. 태아의 해부학을 이해, 해부 또는 주사를 수행하는 도구의 적절한 분배에 대한 지침에 도움이 될 것입니다.시작하려면 모든 배아 수집 재료를 준비하고 배치하십시오. 50 밀리리터 튜브를 절단하고 캡에 구멍을 열어 절단하여 여과 장치를 준비합니다. 그런 다음 튜브와 캡 사이에 100 마이크로미터 모공을 가진 메쉬 필터를 설정합니다.1.2 밀리미터의 내지름으로 동일한 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로 피펫 및 해부 바늘을 준비합니다. 마이크로피펫으로 튜빙을 당기고, 풀러는 170볼트 최대 출력에서 7%로 당겨 길이가 약 0.4cm의 테이퍼로 날카로운 바늘을 만듭니다. 염료 주입 마이크로피펫을 준비하려면, 습윤제로 분쇄기를 담그고 25~30도의 마이크로피펫 클램프에 바늘을 놓습니다.그런 다음 반경의 3분의 2에 팁을 베벨링 표면의 중심에서 내립니다. 튜브가 있는 주사기가 공기를 밀어 넣는 동안 바늘을 갈아 넣습니다. 마이크로피펫을 미세 팁 영구 마커로 표시하여 각도로 형성되는 좁은 개구부를 찾는 것이 어려울 수 있기 때문에 베벨링 후 팁에서 개구부 위치를 나타내도록 한다.파리가 실온에서 하룻밤 사이에 알을 낳고 아침에 계란으로 파이프를 수집할 수 있도록 하십시오. 배아를 수집하려면 접시에 있는 계란을 50%의 표백제로 5분간 탈염시합니다. 염화물이 지워지면 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 플레이트의 내용을 부어 배아를 분리합니다.접시에 남아있는 표백제를 희석하고 필터에 혼합물을 해독하여 가능한 한 많은 배아를 수집하기 위해 물 짜기 병을 사용합니다. 표백제 냄새가 사라질 때까지 배아를 물로 3~4회 씻으시다. 장치에서 필터를 제거하고 물로 다른 깨끗한 접시에 씻어.그런 다음 배아가 있는 새로운 판에서 물을 데수수유한다. 미세 한 집게를 사용 하 여 5 ~ 10 알 누워 후 15 시간에 배아를 선택 하 고 등쪽 측면을 향하고 있는 양면 테이프에 배치. 해부 풀에 곤충 링거 식염수식을 추가하여 배아를 탈수로부터 보호합니다.해부 현미경의 밑에 유리 바늘을 사용하여 테이프에서 유리로 중간 막에서 배아를 끌어내어 배아의 내부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 뒤쪽에서 전방 끝까지 표면의 단일 배아의 중간 선을 잘라냅니다. 중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드 표면에 부착합니다.튜브 연결 바늘에 약 300 마이크로미터의 팁 개구부를 사용하여 공기를 흡인하거나 날려 도르경계 기관 트렁크와 남은 내장을 제거하십시오. 4%의 PFA와 PBS를 사용하여 궤도 셰이커의 실온에서 5분 동안 배아를 수정합니다. 그런 다음 PBS로 세 번 씻으시기 만합니다.항 고추냉이 과산화제 항체의 마이크로리터 1개와 함께 배아를 염색하고 Cyanine3 염료와 200 마이크로리터의 PBS를 궤도 셰이커에서 1시간 동안 접촉시. 그리고 PBS에서 세동을 반복합니다. 사출 마이크로 피펫을 채우기 위해 모세관 홀더에 넣습니다.그런 다음 염료 슬라이드를 스테이지에 배치하고 미세 조작기를 사용하여 슬라이드 위에 배치합니다. 그런 다음 스테이지를 조정하여 마이크로 피펫을 염료에 놓습니다. 주입 압력을 200~500헤코칼로 설정하여 마이크로피펫에서 염료를 수집하고, 주입 시간은 0.1초에서 0.5초 사이이며 보상 압력을 5분 동안 0으로 설정한다.염료를 채취하면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 단계에 배치하십시오. 그런 다음 보상 압력을 30~ 60개의 혈소판 범위로 증가시키고 마이크로피펫을 시료로 낮춥춥시다. 10배의 객관적인 렌즈를 사용하여 배아를 찾고 마이크로 파이프를 배아와 정렬합니다.목표 렌즈를 물에 침지 40회 렌즈로 변경합니다. 그리고 렌즈를 PBS에 담급합니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 항 HRP Cy3로 표시된 신경 형태여부를 확인하고 주사 부위를 결정합니다.배아가 초점을 맞출 때 마이크로피펫의 위치를 변경하여 축축의 끝과 부드럽게 접촉합니다. 그런 다음 주사 중에 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 염료 액적을 확인하십시오. DiD 또는 DiO와 함께 aCC 또는 RP3의 신경 근육 접합부에서 오른쪽 복부 중간 세그먼트에 염료를 떨어 뜨립니다.손 컨트롤을 사용하여 염료를 방출하고 마이크로 피펫을 제거합니다. 그런 다음 다음 주입 사이트로 이동합니다. 이미징 전에 궤도 셰이커의 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.미세 한 집게를 사용 하 여 유리 슬라이드에서 테이프를 제거 합니다. 시료를 장착하려면 4개의 모서리에 소량의 진공 그리스로 커버 슬립을 준비합니다. 조심스럽게 시료에 배치하여 기포를 피하십시오.커버 슬립을 아래로 밀어 샘플에서 공간을 조정하여 객관적인 렌즈와 슬라이드 사이의 작업 거리를 허용합니다. 작업 와이프로 초과 PBS를 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 완전히 밀봉합니다.이미지J 소프트웨어로 공초점 현미경으로 10 배율 및 100 배율로 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜은 ACC 모터 뉴런 내분 근육 1과 RP3 운동 뉴런 내분 근육 6 및 7 라벨을 역그레이드하는 데 사용되었다. ACC 및 RP3 모터 뉴런의 수지상 분기는 광범위한 중복을 보여줍니다.두 뉴런은 양극성이며, 수선제의 두 가지 다른 인구를 확립합니다. 이 방법의 정량적 기능을 보여주기 위해 총 원더라이트 팁 수는 야생 유형 및 Dscam1 돌연변이체로 계산되었습니다. aCC의 입체 말단은 야생 타입에 대해 나타내지만 Dscam1 돌연변이에 대해 몇 개의 입각 형원가 관찰되었습니다.이 절차를 시도할 때, 염료 물방울의 크기가 약 10 내지 20 마이크로미터인 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 양면 테이프의 크기를 테스트한 다음 사출 부위에 적용합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 플라즈마 멤브레인의 슈퍼 해상도 이미지를 얻기 위해 DiD 프로브의 사진 전환 가능한 특성을 활용할 수 있습니다.이렇게 하면 신경 근육 접합부에서 시냅스 멤브레인의 매우 구조적 특성을 연구할 수 있습니다. 우리는 클릭을했다. 돌연변이 균주에서 aCC 원점의 표면 분석을 수행하고, Dscam1-Dock-Pak 주사가 aCC에서 원원지 아웃스승 부위를 정의한다는 것을 발견했습니다.

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

이 프로토콜은의 라이브 절개를...

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

출처: Guan, W., et. al. 시각화 Drosophila  다리 운동 뉴런은 성인 표피를 통해 축삭을 형성합니다. J. Vis. Exp. (2018년) 이 비디오는 다음의 이미징을 보여줍니다.Drosophila 다리. 레이저와 두 개의 검출기가 GFP와 큐티클 자가형광을 포착합니다. 이미지는 채널을 분할하고, 자가형광을 빼고, 착색된 복합 이미지로 병합하여 다리 세그먼트 내의 축삭을 시각화하여 처리됩니다.

Imaging of fluorescently-labeled motor neurons in an adult drosophila leg(성인 초파리 다리에서 형광 표지된 운동 뉴런의 이미징)

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

학습하세요 친유성 형광 염료를 이용한 Drosophila 배아 모터 뉴런 역행 추적 기법을 통해 신경 형태 발생과 연결성을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생물학 연구에 유용한 도구입니다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

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