Name: 제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 학습하세요 형광 칼슘 이미징과 시토 혼성화를 결합하여 Xenopus laevis 신경 전구체에서 단일세포 수준의 칼슘 활동과 유전자 발현을 상관시키는 방법을. 이 기법은 세포 자율적 관계를 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

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우리는 이러한 프로토콜의 개발에 기여에 대한 웬디 허스트와 린지 슐라이퍼에게 감사드립니다. 이 작품은 국립 보건원 (1R115NS06756-01, 1R15HD077624-01 및 1R15HD096415-01)에서 MSS에 대한 보조금에 의해 지원되었습니다.

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

칼슘 활동의 특징적인 패턴은 개발 신경계를 구성하는 세포에서 관찰되었으며, 특정 유형의 활동은 뚜렷한 신경 발달 과정과 관련이 있습니다. 그러나, 이러한 정보 조밀한 활동 패턴이 전사 반응으로 번역되는 메커니즘에 대한 추가 이해는 단세포 분해능으로 수집될 칼슘 활성 및 유전자 발현에 대한 정보를 필요로 한다. 성숙한 뉴런과 같이 더 많은 고정관념적인 칼슘 활성을 나타내는 시스템은 벌크 수준에서 합리적으로 분석될 수 있지만, 배아 신경계를 특징짓는 불규칙한 패턴은 덜 정확한 기록으로 쉽게 가려집니다.
이 프로토콜에 확립된 실험 프레임워크는 다양한 세포 유형 및 형광 리포터에 쉽게 적응할 수 있습니다. 세포 모형의 거의 모든 세포 모형 또는 조합을 포함하는 조직은 관심있는 모형 유기체로부터 해부되고 단세포 화상 진찰을 위해 도금될 수 있습니다. 세포 식별을 허용하고 세포 자율 적 과정의 효과를 분리하는 것 외에도, 1 차적인 세포 배양 접근법은 실험자가 원하는 대로 배지 성분을 정의할 수 있게 합니다. 예를 들어, 2 mMCa2+ 용액에서 뉴런 전구체의 활성을 비교한 실험은 배아 척수에서 스파이크 주파수와 신경전달물질 표현형 사이의 관계가 세포-세포 상호작용13,20의영향 없이 재봉화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 수행되었다.
이 프로토콜은 형광 마커 Fluo4-AM을 활용하여 세포내 칼슘 활성을 검출하는 반면, 사용자는 유전자 인코딩된 칼슘 지표를 포함하여 시판되는 다른 마커21을선택할 수 있다. 유사하게, 대체 마커는 관심 있는 이온의 농도에 대한 동적 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다(K+, Na+및 Zn2+를 포함),막 전위, 또는 세포 pH. 이미징 설정 및 이미지 지속 시간은 필요에 따라 수정할 수 있습니다.
우리는 특정 응용 프로그램으로 칼슘 활동 및 신경 표현형을 상관하지만,이 방법은 또한 다양한 다른 세포 특성에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 사이트 혼성화에서형광은 신경 마커 ChAT 또는 전사 인자 Engrailed를 포함하여 관심 있는 임의의 유전자에 대하여 프로브로 수행될 수 있으며, 이를 통해 mRNA 종의 맞춤형 패널의 민감한 검출을 가능하게 한다. 이러한 프로브는 이소폼에 특이적이라고 설계할 수 있으며 원하는 경우 추가적인 표적 특이성을 지원합니다. 이중 FISH는 여러 개의 서로 다른 형광단에 공액된 프로브를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 여러 유전자의 발현을 동시에 평가할 수 있도록 한다. 그러나, 이러한 유형의 실험에 필요한 추가 적인 세차는 세포 손실 또는 운동의 증가 기회와 관련 되 고 경험 및 섬세 한 성공적으로 수행 될 필요.
이 프로토콜에 대한 실험별 수정에 관계없이 주의해야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 해부는 모든 오염 조직 또는 세포 집단을 제거하기 위하여 주의해서 수행되어야 합니다; 이식이 해리될 때 공간 패터닝이 손실되기 때문에 이웃 조직의 나머지 세포는 관심 있는 세포와 산재하고 구별할 수 없게 됩니다. 세포가 도금된 후에는 세포가 빠지지 않도록 가능한 한 부드럽게 샘플을 처리해야 합니다. 가장 중요한 것은 솔루션이 제거되고 추가될 때 파이펫을 플레이트 가장자리에 배치하여 모든 솔루션 변경을 천천히 신중하게 수행해야 한다는 것입니다. 이것은 세포가 칼슘과 FISH 심상 둘 다에서 자신있게 확인될 수 있다는 것을 보장할 것입니다. 처리 중에 세포가 중단되면 두 이미지 간에 해당 셀의 일부 또는 전부를 식별하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이러한 할당에 주의를 기울이면 명확하지 않은 해당 셀만 추가 분석을 위해 사용되는 것이 좋습니다.
해결되는 생물학적 질문에 따라 다양한 분석 접근법이 적절할 수 있습니다. 타임시리즈 칼슘 활성은 다양한 방법으로 처리 및 정량화될 수 있으며, 실험자는 추세 가감소 매개변수, 분석 메트릭 및 분석 매개변수(예: 칼슘 스파이크를 정의하는 데 사용되는 기준선 임계값%)를 선택할 수 있는 유연성을 제공합니다. 칼슘 활성과 유전자 발현 수준 사이의 상관관계는 FISH 이미지로부터 추출된 절대 또는 상대형형광값으로서 유전자 발현을 분석함으로써 그려질 수 있다. 양자택일로, 칼슘 활동과 유전자 발현 사이 상관관계 (존재/부재) 양성 유전자 발현 신호에 대한 형광 임계값을 정의하고 개별 세포에 '예' 또는 '아니오' 식별자를 할당해서 그릴 수 있습니다. 전체적으로 이 실험 스키마는 세포 일치 유전자 발현 데이터와 함께 타임시리즈 데이터의 수집 및 예비 분석을 위한 매우 유연한 파이프라인을 제공합니다. 이러한 실험은 배아 제노푸스 라에비스에서억제-운명 및 흥분성 신경 지방 전구체의 특징인 칼슘 활성 패턴의 식별에 의해 예시된 바와 같이 세포 역학 및 전사 변화 사이의 복잡한 관계를 더 잘 이해하는 데 매우 중요할 것이다.

자유 세포질 칼슘은 세포 증식 및 이동에서 세포 사멸 및 자가 포식1,2,3에이르기까지 다양한 생물학적 과정에 매우 중요합니다. 이 통로 내의, 칼슘은 단백질 활동 및 상호 작용을 조절하는 구조물 변경을 유도하기 위하여 칼슘 결합 도메인과 상호 작용해서 유전자 발현에 다운스트림 효력을 발휘할 수 있습니다. 예를 들어, 하류 조절 요소 길항제 변조기 (DREAM)로 알려진 신경 칼슘 센서는 칼슘에 의해 결합 될 때 전개 된 중간 형태에서 개최되어 단백질 및 DNA 표적과 상호 작용하는 것을방지합니다 4. 그러나 단순한 신호 분자로서의 역할을 넘어, 세포내 칼슘 과도의 동적 성질은 이러한 활성 패턴을 보다 복잡한 진폭 또는 주파수 기반 신호5,6을인코딩할 수 있게 한다. 활성화된 T 세포(NFAT)의 전사 인자 핵 인자의 핵 전좌는 고주파 칼슘 진동에 의해 강화되지만 저주파 진동에 의해억제된다 7. 설득력있게, 최근 연구는 NFAT가 실제로 누적 칼슘노출에반응 할 수 있음을 제안했다 8 . 칼시뉴린과Ca2+/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II(CaMKII)는 또한 특정 주파수, 지속 시간 또는 진폭9의칼슘 과도에 대한 뚜렷한 반응을 나타낸다. 규제 복잡성의 추가 수준을 추가하기 위해, 전산 모델은 많은 다운스트림 칼슘 결합 단백질이 결합 경쟁자의 존재 또는 부재에 반응하여 더 많거나 적은 주파수 의존체가 될 것을 제안한다10,11.
개발 신 경계 내에서, 칼슘 활동 행동의 두 가지 주요 클래스 정의 하 고 특정 생물 학적 과정과 관련 된. 칼슘 유입은 개별 세포 내에서 발생하는 경우 "스파이크"로 분류되며, 5초 이내에 기준선의 400%의 피크 강도에 도달하고, 이중 지수 붕괴12를나타낸다. 신호의 이 모형은 신경 전달물질 표현형명세서 13와13와 주로 연관됩니다. 대조적으로, "파도"는 세포의 세포 내 칼슘 농도가 30 초 이상 동안 기준선의 ~ 200 %로 상승한 다음 몇 분동안 12에걸쳐 부패하는 더 느리고 덜 극단적 인 칼슘 과도성으로 정의됩니다. 이러한 신호는 종종 여러 인접 세포에 걸쳐 전파되며, 그들의 존재는 신경외 세포 증식14,15와연관되어 있다. 그러나, 이 2개의 종류는 특징적인 운동 단면도에 근거를 둔 정의되었더라도, 이 패턴의 어떤 특성이 실제로 세포에 의해 검출되고 다운스트림 이펙터에 의해 번역되고 있는지 정확하게 불분명하게 남아 있습니다.
세포내 칼슘 진동과 유전자 발현 사이의 관계를 이해하면 신경계의 적절한 발달과 패터닝을 보장하는 규제 메커니즘 중 하나에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이를 위해, 배아 척수의 연구는 개발 중 칼슘 스파이크 활성이 증가하면 억제 뉴런의 상부와 연관되어 있음을 입증했으며, 반면 감소된 칼슘 스파이크 활동은 흥분성 뉴런의 상부와 연관되어13. 그러나, 이러한 인구 수준 분석은 단세포 수준에 유전자 발현과 칼슘 활동을 연관시키기 위하여 이용되지 않았습니다.
단일 셀의 수준에서 이러한 질문에 접근하는 것은 이전 작업에 비해 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공합니다. 하나, 많은 세포에서 칼슘 활성 및 유전자 발현을 개별적으로 평가하는 능력은 벌크 레벨 측정에 의해 난독화되지 않고 독특한 활성 패턴의 전체 레퍼토리를 관찰 할 수 있습니다. 추가적으로, 단세포 1 차적인 문화에서 이 관계를 공부하는 것은 칼슘 활동과 유전자 발현 사이 세포 자율적인 링크가 유지된다는 것을 의미합니다, 세포 세포 통신을 요구하는 상호 작용은 중단될 것입니다 동안. 그러므로, 이 접근은 이 세포 자율적인 기계장치를 격리에서 공부하는 것을 허용합니다. 그러나, 그것은 또한 비 세포 자율 적인 칼슘 활동의 역할을 해명 하 고 심문 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포는 신경 판 단계에서 배아로부터 해부될 수 있고, 형제 대조가 신경관 단계에 도달할 때까지 배양된 다음, 신경관 단계 배아로부터 갓 해부된 세포와 비교될 수 있다. 이것은 세포 세포 통신이 폐지된 것과 중요한 발달 기간에 걸쳐 세포 세포 통신을 유지하는 세포의 직접적인 비교를 허용합니다.
이전 실험 접근법의 한계를 해결하기 위해, 우리는 개별 신경 전구 세포에서 칼슘 활성과 유전자 발현을 모두 평가할 수 있는 프로토콜을 개발하여 후속 분화 프로그램과 특정 활성 패턴의 상관 관계를 촉진했습니다. 신경 조직은 신경 발달의 다양한 단계에서 제노푸스 laevis에서 해부되고, 단일 세포로 해리되고, 형광 칼슘 지표가있는 공초점 현미경을 통해 이미지화되었습니다. 살아있는 세포 화상 진찰에 따라, 견본은 관심있는 유전자 의 발현 또는 이소포름을 검출하기 위하여 사이투 혼성화 (FISH)에 있는 형광을 통해 고쳐지고 분석되었습니다. 중요한 것은, 개별적인 세포는 두 화상 진찰 실험을 통해 추적될 수 있습니다, 세포의 칼슘 활동 단면도 및 그것의 유전자 발현 수준이 서로 연관될 수 있다는 것을 의미합니다(그림 1). 여기에서 보고된 프로토콜은 제노푸스 laevis에있는 배아 신경 발달을 통해 칼슘 활동 패턴 그리고 유전자 발현 사이 관계를 탐구하기 위한 것입니다. 그러나, 더 넓은 실험 적인 틀 (물고기와 화상 공동 등록에 선행된 단세포 시간 과정 화상 진찰)는 거의 모든 세포 모형, 형광 리포터 및 관심있는 유전자에 수정되고 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>축산 & 세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHORULON (융모성 임소화 호르몬)</td><td>Merck Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이트 염</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 페트리 접시, 100 mm x 20 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3160102</td><td></td></tr><tr><td>코닝 팔콘 이지 그립 조직 배양 접시, 35mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>코닝 팔콘 이지 그립 조직 배양 접시, 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 표준 조직 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Thermo scientifc Nunc 세포 배양 / 페트리 접시, 35x10mm 접시, Nunclon Delta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 표준 일회용 이송 피펫, 무눈금; 길이 : 5.875 인치; 용량: 7.7mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이</td>트 <td>밀리포어 시그마</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 B</td><td>밀리포어 시그마</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 집게, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CLS5-25D-050</td><td></td></tr><tr><td>For Calcium Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, cell permeant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &micro; m 여과 (물 중 10% 용액)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>RNA Probe Generation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td></td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td></td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td></td></tr><tr><td>rUTP</td><td>Promega</td><td>P1162</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>3359247910</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>P2083</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>LiCl 침전 용액(7.5m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>형광 현장 혼성화</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>, Millipore Sigma</td><td></td><td></td>11096176001</tr><tr><td>안티 디곡시제닌-POD, 팹 단편</td><td>Millipore Sigma</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td><td>Millipore Sigma</td><td>GEPA13105</td><td></td></tr><tr><td>Solution Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, 무수, ACROS Organixs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC349610</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's Solution (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>DTT, 분자 등급(DL-Dithiothreitol)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산, 디소듐 염 이수</td><td>화물 Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산</td><td>밀리포어 시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드(탈이온화)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤르파린 나트륨 염</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(초순수)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1109</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Millipore Sigma</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘, 순수, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘, 97% 순수, ACROS Organixs, 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC413480050</td><td></td></tr><tr><td>말레산, 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS125231000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS(Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>토룰라 효모의 리보 핵산, IX</td><td>유형 Millipore Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>Millipore Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>모델</td><td></td><td></td></tr><tr><td>선택</td><td></td><td></td> <td>해부 현미경</td> 모델</tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE200</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking Incubator</td><td>선택 모델</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>기타</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>코닝 병 정상 진공 여과기 체계, 0.22 &mu; m pore, 500mL 병 용량</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr></tbody></table>

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

자발적인 세포내 칼슘 활성은 다양한 세포 유형에서 관찰될 수 있으며 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안된다. 특히, 배아 발생 시 칼슘 활성 패턴의 적절한 조절은 적절한 신경관 폐쇄, 시냅토제네시스 및 신경전달물질 표현형 사양을 포함한 척추동물 신경 발달의 많은 양상에 필요하다. 칼슘 활동 패턴이 주파수와 진폭 모두에서 다를 수 있다는 관측은 이러한 플럭스가 인코딩된 신호를 다운스트림 이펙터에 전달하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 강력한 메커니즘을 시사합니다. 인구 수준 접근 방식은 이러한 가능성을 더 탐구하는 데 필요한 정밀도가 부족했습니다. 더욱이, 이러한 접근법은 세포-세포 접촉이 없는 상태에서 신경 측정 상태를 분석하는 능력을 배제함으로써 세포-세포 상호작용의 역할에 대한 연구를 제한한다. 따라서, 우리는 계종 혼성화 분석실험에서 형광과 해리된 신경 이종의 시간 경과 칼슘 이미징을 결합하는 실험 워크플로우를 수립하여 칼슘 활성 패턴과 분자간의 명확한 상관관계를 허용했습니다. 단일 세포 수준에서 표현형. 우리는 성공적으로 신경 세포와 신경 전구 세포를 분화와 관련된 특정 칼슘 활동 패턴을 구별하고 특성화하기 위해이 방법을 사용할 수 있었다, 각각; 그러나, 이 문서에서 기술된 실험 프레임워크는 임의의 시계열 활성 프로필과 관심 있는 유전자 또는 유전자의 발현 사이의 상관관계를 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

칼슘 이미징을 위해 제조된 해리세포의 성공적인 예는 도 2A에서볼 수 있다. 셀은 조밀하게 도금되어 각 이미지에서 최대 양의 정보를 수집할 수 있지만 개별 셀을 자신있게 구별할 수 없을 정도로 조밀하게 도금되지는 않습니다. 형광은 2 시간 화상 진찰 기간 동안 각 정의된 세포에 대해 검출됩니다. 실험에 기록된 모든 셀에 대한 추적을 포함하는 복합 플롯의 시각화는 대량 또는 모집단 측정이 스파이크 동작의 미묘한 패턴을 모호하게 할 수 있는 정도를보여줍니다(그림 2B). 개별 세포의 기록된 프로파일이 분리될 때, 신경 전구 세포의 불규칙한 스파이크 활성 특성의 예는 명확하게 규명될 수 있다. 성숙한 뉴런과는 달리, 배아 뉴런 세포는 불규칙하고, 매우 가변적이며 복잡한 칼슘 활성의 특성을나타낸다(그림 2B). 이러한 복잡성을 정량화하기 위해, 스파이크를 정의하기 위한 다양한 파라미터를 포함하는 다양한 데이터 분석 방법의 적용이17,18로적용되었다(도2C).
안티센스 mRNA 프로브의 성공적인 설계 및 합성을 포함하는 현장에서의 성공적인 형광은, 비결합 센스 RNA 대조군으로 배양된 배경 대조군과 실험판을 비교하여 평가될 수있다(도 3A,B). 양성 프로브 제어는 또한 검출 가능한 수준에서 표적 mRNA를 발현하는 것으로 알려진 세포 유형을 처리함으로써 수행될 수 있다.
칼슘과 FISH 화상 진찰을 통해 동일 세포의 확인은 세포가 프로브 혼성화 및 가공 도중 대략 동일한 위치를 유지하도록 요구합니다. 플레이트를 거칠게 다루거나 너무 강력하게 수행되는 경우, 플레이트 표면에서 세포가 빠지거나 용액이 플레이트의 다른 위치에 버려지거나 증착될 때 손실될 수 있으므로 이미지 간에 일치하는 것이 불가능합니다(그림4A). 이러한 중단이 시야의 일부 셀에만 영향을 주는 경우 이미지 내의 일부 셀을 감지하고 할당할 수있습니다(그림 4B). 그러나 FISH가 신중하게 수행되고 이미지 간에 손실되거나 재배치되는 실험에서 최대 데이터 양이 얻습니다(그림4C).
일단 관심 있는 발달 단계에서 적당한 수의 세포의 칼슘 활성 및 유전자 발현을 모두 설명하기 위해 데이터가 수집되면, 추가 분석은 이들 두 가지 특징들 사이의 상관관계를 평가하기 위해 수행될 수있다(도 1). 스파이크 카운트/주파수, 평균 전력, 허스트 지수 추정 및 마르코비안 엔트로피 측정17,18을포함한 칼슘 활성 패턴을 정량화하기 위해 다수의 메트릭이 적용되었다. 유전자 발현은 절대 형광 수준에 의해 정량적으로 정의되거나 해결되는 실험 적 질문에 따라 이진(예/아니오) 척도로 채점될 수 있다.
신경 전구 마커 유전자의 발현과 칼슘 활동을 콜라화하는 실험결과 칼슘 활성과 신경 전달 물질 표현형의 특정 패턴 사이의 수많은 연관성이 밝혀졌습니다. 신경판 단계(Stage 14)에서, 억제 뉴런 마커 gad1.1을 발현하는 GABAergic 세포는 gad1.1 발현이 부족한 세포보다 더 규칙적이고 더 높은 진폭인 칼슘 활성을 나타낸다(도5A). 더욱이, 이들 gad1.1-발현세포는 높은 수준의 높은 진폭 스파이크와 연관되는 반면, 저진폭 스파이크는 흥분성 뉴런 마커 slc17a7을발현하는 글루타마테르지성 세포에서 더 빈번하다.
<img alt="신경 조직 분석; 단계: 해부, 세포 도금, Ca²⁺ 이미징, FISH, 이미지 오버레이; 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 실험 워크플로우의 회로도입니다. 배율 막대 = 100 μm. 패널 3-5의 이미지는 Paudel 외(2019)17에서찍은 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="형광 현미경, 스펙트럼 분석 및 신호 정량화; 단백질 발현 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 칼슘 이미징 및 예제 활동 프로필. (A)Fluo4-AM에 의해 보고된 세포내 칼슘 활성. 각 2시간 이미지는 901프레임으로 구성되며, 하나의 대표 프레임이 여기에 표시됩니다. (B)이미지된 시야 내의 모든 셀에서 시간에 따라 형광 강도의 복합 플롯. 흔적은 표시염료(Fluo4) 초과 근무의 광표백을 명확하게 나타냅니다. 왼쪽 상단에 있는 래스터 플롯은 Eilers와 Boelen19가개발한 디트렌드 알고리즘을 적용한 후 칼슘 활성의 대표적인 흔적을 보여 주며, 여기서 여기에 표시된 세포는 다양한 스파이킹 행동 패턴을 나타낸다. (C)상이한 임계값(기준선의 150% 및 200%를 적용하여 기준선이 디트렌드 형광 강도의 평균인 경우) 스파이크(녹색 및 파란색 화살표)를 정의합니다. 배율 막대 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="세포 흡수를 비교하는 형광 현미경 이미지; 패널 A 낮음, 패널 B 높음 적색 형광." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 물고기 이미징. (a)물고기는 음성 대조군으로서 비결합 센스 RNA 프로브로 수행하였다. 어떤 세포가 형광으로 나타나지 않도록 화상 진찰 조정이 조정되었습니다. 일부 시야에는 (A)의 오른쪽 상단 및 하단 모서리에서 볼 수 있는 것과 같은 일부 형광을 가진 비세포 파편이 포함될 수 있습니다. 이러한 백그라운드 설정을 위해 무시할 수 있습니다. (B)동일한 이미징 설정을 사용하여 실험판(antisense RNA 프로브)을 이미지화한다. 이러한 조건하에서 형광은 배경 위의 유전자 발현에 해당한다. 배율 막대 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="프로세스 A, B, C에서 클러스터링 분석을 보여주는 셀 다이어그램; 빨간색과 녹색 원이 겹칩니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 이미지 오버레이 및 공동 등록. 칼슘 활성(채워진 녹색 원으로 표시된 세포) 및 FISH(그늘진 적색 원으로 표시되는 세포)에 대해 이미지된 샘플의 개략적 표현. (A)샘플 처리 및 처리 중에 크게 이동한 셀은 두 이미지에서 안정적으로 식별할 수 없습니다. (B)세포 중단은 시야의 일부 셀에만 영향을 줄 수 있습니다. 일부 셀은 두 이미지에서 명확하게 식별할 수 있지만 다른 셀은 자신있게 일치시킬 수 없습니다. (C)샘플을 신중하게 처리하는 경우 대부분의 셀은 방해받지 않고 유지되며 두 이미지 모두에서 식별할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="마르코프 엔트로피 및 스파이크 주파수 비교; 상자 그림은 GABA, 글루타메이트 간의 데이터 변동성을 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 도 5: 이 방법의 적용예로서, 신경판 단계 제노푸스 라비스에서 칼슘 활성과 유전자 발현(GABA 및 glut for genes gad1.1 및 slc17a7)의 연관성을 보여주는 박스플롯. 14단계에서, gad1.1-postive 세포(GABA)는(A)마르코비안 엔트로피18 및(B)스파이크 카운트에 의해 정의된 바와 같이 더 높은 진폭 및 더 많은 규칙적인 칼슘 활성을 나타내며, 임계값을 사용하여 125%, 150%, 200%, 200% 및 300%의 평균 의 디트트렌드 형광 강도(baseline)s17lc s17lc보다. 별은 본페로니 보정 된 두 샘플 콜모고로프 - 스미르 노프 테스트 (p &amp; 0.05) 및 효과 크기에 대한 코헨의 d 통계 (n = 5 배양 및 &gt;100 셀; * 0.2 ≤ | d | &amp; 0.5)에 따라 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 이 그림은 Paudel 등에서 얻은 데이터 세트에서 다시 그려지고17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

이 프로토콜은 칼슘 활동 패턴을 단일 세포 수준에서 유전자 발현과 상호 연관시키는 데 사용할 수 있으며, 연구자들은 이 두 가지 특징 사이의 관계에 대한 새로운 질문을 조사할 수 있습니다. 전형적으로 전체 조직을 연구하는 이전 접근법과는 달리, 우리의 기술은 칼슘 활동과 유전자 발현 사이의 세포 자율 적 관계를 평가할 수 있게 하는 단일 세포 수준으로 확대됩니다. UV를 통해 35mm 플라스틱 페트리 접시 2개와 35mm 세포 배양 접시 1개를 약 30분간 살균합니다.라미나르 플로우 후드에서 작업하면 50밀리리터 플라스틱 원뿔관 2개, UV 멸균 페트리 접시 1개, UV 멸균 세포 배양 접시 에 2밀리미터 칼슘 용액 10밀리리터를 추가합니다. 다른 UV 멸균 페트리 접시에 칼슘과 마그네슘 프리 솔루션 2밀리리터를 넣고 100mm 플라스틱 페트리 접시 2개와 젠타미신으로 보충된 35mm 플라스틱 페트리 접시 1개를 채웁니다. 그런 다음 60mm 플라스틱 페트리 접시를 70%에탄올로 채웁니다.해부 직전에 0.01 그램의 콜라주 누우스 B를 칼슘 용액 의 한 튜브에 철저히 섞습니다. 새로운 60mm 플라스틱 페트리 접시에 용액을 추가하고 해부 현미경을 사용하여 원하는 발달 단계의 배아를 식별합니다. 멸균 이송 파이펫을 사용하여 MMR 플러스 젠타미신을 함유한 100mm 플레이트로 적어도 6개의 적절한 배아를 이동시보도록 한다.그런 다음 홀딩 플레이트에서 1개의 배아를 MMR 플러스 젠타미신의 두 번째 100밀리미터 플레이트로 옮기고 현미경 아래에 이 해부 판을 놓습니다. 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 배아를 안정화시키고, 배아를 둘러싼 진동막을 미세 한 번의 집게로 조심스럽게 벗겨냅니다. 모든 멤브레인이 제거되면 미세 한 집게를 사용하여 전방 후방 축을 따라 배아를 꼬집어 등쪽 및 복부 영역을 분리하십시오.새로운 멸균 이송 파이펫을 사용하여 도살 부분을 콜라주용 60mm 플레이트로 1~2분 간 이송한 후 시편을 해부 판으로 조심스럽게 옮기한다. 해부를 완료하려면, 조심스럽게 자궁 내분비의 추정 신경 조직에서 잔류 내분및 중피 오염의 모든 제거하고 부드럽게 칼슘 용액의 35 밀리미터 플레이트에 해출을 전송. 3개의 더 많은 이출이 수집된 경우 P1000 마이크로파이프를 사용하여 4개의 각질을 모두 35mm 의 칼슘 플레이트로 옮기고 마그네슘 이질이 없는 용액을 사용하여 이출물과 공기 물 인터페이스 사이의 접촉을 피하십시오.그런 다음 접시의 모든 각종이 접시의 중앙에 클러스터되도록 부드럽게 접시를 소용돌이시키고 조직이 소동 할 수 있도록 실온에서 1 시간 동안 표본을 배양합니다. 이 잠복기 도중, gentamicin를 가진 MMR의 두 번째 접시에 마지막 2개의 태아를 전송하고, 이 견본이 방해받지 않고 발전할 수 있도록 접시를 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 접착제를 사용하여 35mm 세포 배양 접시의 바닥에 마이크로 지배 커버 슬립을 부착하고 P100 마이크로 피펫을 사용하여 해리 된 각질을 수집합니다.피펫을 세포 배양 접시의 표면에 가까운 얕은 각도로 잡고, 안쪽을 향한 그리드의 구석에 파이펫 팁을 배치하고 그리드 영역을 가로 질러 셀 서스펜션을 단단히 추방한다. 이상적으로, 세포는 단단하고 조밀한 클러스터에 정착할 것입니다. 셀이 실온에서 1시간 동안 접시에 부착되도록 합니다.세포가 정착하는 동안, 결정하고 형제 대조군 배아의 발달 단계를 기록. 인큐베이션이 끝나면 샘플 접시를 빛으로 보호된 위치로 이동하고 접시 가장자리에서 100 마이크로리터의 용액을 흡인합니다. 이 솔루션을 새로 준비한 플루오-4 AM 플루론 F127 산 용액7과 위아래 파이펫팅과 혼합한 후 전체 볼륨을 샘플 접시에 되돌려 보도록 합니다.알루미늄 호일로 접시를 섞고 덮기 위해 부드럽게 소용돌이합니다. 실온에서 1시간 후, 생맥주 의 1밀리리터를 신선한 2밀리리터의 칼슘 용액3밀리리터로 교체하십시오. 그런 다음 3밀리리터의 상복부를 신선한 칼슘 용액 3밀리리터로 2회 더 교체하십시오.칼슘 활동 이미징의 경우, 샘플 플레이트를 주변 광 노출로부터 보호하는 반전된 공초점 현미경의 단계에 놓고 마커를 사용하여 플레이트의 앞점을 표시하여 후속 이미징 세션에서 동일한 시야를 찾을 수 있도록 합니다. 현미경의 밑에 견본을 찾아내고 세포가 응집되거나 개별적으로 구별하기 어려운 이렇게 조밀하지 않은 적당한 시야를 선택하기 위하여 10 및 20 시간 목표를 사용합니다. 식별 가능한 숫자가 필요에 따라 프레임에 있을 때까지 그리드 지배 커버슬립이 보이게 되도록 현미경 포커스를 조정합니다.그리드 지배 커버슬립을 중심으로 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 얻고 셀을 중심으로 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 얻을 수 있습니다. 격자 표지 슬립과 시야의 명확한 이미지가 없으면 나중에 생성할 물고기 이미지의 셀을 공동 등록할 수 없습니다. 그런 다음 488 나노미터 레이저로 샘플을 조명합니다.2시간 이미지의 경우 이미징 구성을 수정하여 이미지를 획득하기 위해 구성을 실행하기 전에 8초 간격으로 3.93초의 스캔 시간으로 901 프레임을 기록합니다. 이미징이 완료되면, 현미경 단계에서 플레이트를 제거하고 배양 의 시작 부분에 형제 대조배아의 발달 단계를 기록하는 데 주의를 기울여 실온에서 2 시간 동안 1X MEMFA의 1 밀리리터로 배양 서퍼를 대체하십시오. 실험에 기록된 모든 셀에 대한 흔적을 포함하는 복합 플롯의 시각화는 벌크 또는 인구 측정이 스파이크 동작의 더 미묘한 패턴을 모호하게 할 수 있는 정도를 보여줍니다.개별 세포의 기록된 프로파일이 격리될 때, 신경 전구 세포의 불규칙한 스파이크 활성 특성의 예는 명확하게 확인할 수 있다. 이러한 복잡성을 정량화하기 위해 스파이크를 정의하기 위해 다양한 매개 변수를 포함하여 다양한 데이터 분석 방법을 적용할 수 있습니다. 플레이트가 대략적으로 처리되거나 시투 혼성화에서 형광 중에 너무 강력하게 수행되는 경우, 세포는 플레이트 표면에서 빠져나져 세포가 이미지 전반에 걸쳐 일치하는 것이 불가능할 수 있습니다.이 중단이 시야의 일부 셀에만 영향을 미치는 경우 이미지 내의 일부 셀을 감지하고 할당할 수 있습니다. 그러나, 혼성화가 신중하게 수행되고 이미지 간에 셀이 손실되거나 재배치되는 실험에서 최대 양의 데이터가 얻어지나된다. 신경 전구 마커 유전자의 발현과 칼슘 활성을 콜라주하는 실험의 결과는 칼슘 활동의 특정 패턴과 신경 전달기 표현형 사이의 수많은 연관성을 드러낼 수 있습니다.이 데이터를 통해 연구자들은 간단한 스파이크 계수로 제한되는 대신 이러한 동적 칼슘 패턴과 유전자 발현과의 관계에 대한 보다 복잡한 특징을 조사할 수 있습니다.

fluorescent-calcium-imaging-subsequent-situ-hybridization-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

출처: Bancroft, E. A., et al. 1차 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적 Ca2+ 플럭스와 그 하류 효과를 정량화합니다. J. Vis. Exp. (2020){{TAG_ 46}}이 비디오는 마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 지표(calcium indicator)를 발현하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 컨포칼 현미경으로 뉴런을 이미지화하여 자발적 및 신경전달물질에 의한 칼슘 활동 중 형광 강도의 변화를 추적합니다.

마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

여기에서는 Xenopus laevis  의 후각구에서 온도 반응을 측정하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.후각 수용체 뉴런과 승모세포는 다르게 염색된 후 칼슘 변화가 기록되며, 이는 코에서 유도된 온도 강하에 대한 전구의 일부 신경망의 민감도를 반영합니다.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

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생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

학습하세요 형광 칼슘 이미징과 시토 혼성화를 결합하여 Xenopus laevis 신경 전구체에서 단일세포 수준의 칼슘 활동과 유전자 발현을 상관시키는 방법을. 이 기법은 세포 자율적 관계를 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

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