Name: 플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질의 RNA 표적을 식별하기 위한 Fbio CLIP-seq 방법을. 이 기법은 SDS-PAGE 없이 직접 단백질 결합 RNA를 효율적으로 검출하여 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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보조금 지원은 중국 국립 기초 연구 프로그램 (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), 중국 국립 자연 과학 재단 (31630095), 칭화 대학의 생명 과학 센터에서 입니다.

1. 셀라인 건설
<ol><li>관심 유전자를 PPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA 의 관심]-(히그로마이신 내성) 플라스미드로 복제하여 플래그-비오틴에피토프(13,21)를 탑재하여 플래그-비오틴 태그 융합 RBP(FB RBP)를 발동한다.</li>
	<li>PBase 벡터를 가진 벡터를 비라효소(22)를발현하는 세포주로 의FBRBP 발현 벡터를 코트랜스펙트한다. 참고: 본 연구에서, FBRBP 유전자는 통합BirA 발현벡터(21)를운반하는 마우스 배아 줄기세포(mESC)로 전염되었다. 대안적으로, FBRBP 발현 벡터는 pBase 및 pPiggyBac-BirA-V5를 함께 세포로 결합할 수 있다.</li>
	<li>젤라틴화된 접시에 mESC에서 세포를 성장시키고 mES 배양배지(재료표)에서37°C에서 5%CO2로 유지한다. 1주일 동안 히그로마이신 b(100 μg/mL)를 가진 감염된 세포를 선택한다.</li>
	<li>약물 선택 후, SDS 로딩버퍼(표 1)에의한 수확 세포를 수확하고, 각각 FLAG 항체 및 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 유전자의 태그 및 발현을 확인하기 위해 서양블롯(23)을 사용한다.</li>
</ol>2. 교차 연결
<ol><li>플레이트 ~3 x 106 mES 세포는 실험 1일 전에 10cm 플레이트에 있으므로 수확시 세포가 70-90%로 증가하도록 합니다(샘플당 5~1000만 세포).</li>
	<li>진공 상태에서 매체를 제거합니다. 실온(RT)에서 2분 동안 2mL의 트립신-EDTA를 2mL로 처리하고 신선한 mESC 배지의 4mL로 트립신을 담금질한다. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 세포를 회전시키고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>감기 PBS의 4mL로 세포를 중단하고 교차 연결을 위해 세포를 10cm 플레이트로 다시 플레이트로 플레이트한다. 254nm UV 광(400mJ/cm2의파라미터로 UV 크로스 링커설정)을 방사선으로 교차 연결합니다. 참고: 세포 단층의 경우, 세포는 트립신 치료 전에 플레이트에서 직접 UV 빛과 교차 연결할 수 있습니다.</li>
	<li>교차 연결된 셀을 15mL 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 회전하고 상체를 제거합니다. 참고: 교차 연결된 세포 펠릿은 사용 전까지 -80°C로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 세포 리자테 준비
<ol><li>500 μL의 세척 버퍼 A(표 1)를가진 세포를 lyse 갓 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 프로테아제 억제제 칵테일, 400 U /mL RNase 억제제. 세포를 RNase 가 없는 1.5 mL 튜브로 전송합니다. 4°C에서 부드러운 회전을 가진 로터에 30-60 분 동안 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>37°C에서 30 μL의 DNase I로 10분 동안 리세이트를 처리합니다. 0.5 M EDTA의 4 μL을 추가하여 반응을 중지합니다. 불용성 펠릿을 4°C에서 20분 동안 12,000x g로 회전시키고 상체를 새로운 프리킬드 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 참고: 즉시 사용하십시오, 얼음에 보관하십시오. 상체가 즉시 사용되지 않으면 사용 전까지 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 플래그 비즈 준비
<ol><li>샘플당 40 μL의 슬러리 플래그 비드를 신선한 1.5mL 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 4°C에서 2분 동안 3,000xg씩 회전합니다. </li>
	<li>한 번 4.2 단계를 반복합니다. 4°C에서 2분 동안 3,000 x g로 구슬을 회전시합니다. 좁은 끝 파이펫 팁으로 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 구슬을 제거하지 마십시오.</li>
</ol>5. 면역 침전
<ol><li>셀 용양을 3.2 단계에서 미리 평형된 플래그 비즈로 옮기습니다. 롤러 셰이커의 모든 샘플을 4°C에서 부드럽게 회전시합니다. 2-4 h 또는 하룻밤 동안 lysate와 플래그 구슬을 배양.</li>
	<li>3,000 x g에서 2 분 동안 구슬을 원심 분리하고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>4°C에서 회전기에서 5분 동안 배양하여 0.5mL의 미리 냉각된 세척 버퍼 A로 구슬을 씻고, 구슬을 3,000 x g로 2분 동안 스핀다운하고 상복부을 제거합니다. 세척을 1x반복합니다.</li>
	<li>전냉장 세척 버퍼B(표 1)의0.5mL로 5.3 단계에서 설명된 대로 세척 2x를 반복한다.</li>
</ol>6. 3x 플래그 펩타이드를 장착한 용출
<ol><li>3x 플래그 용출 용액을 3x 플래그 용출 용액을 5mL의 워시 버퍼 A로 1 mg의 3x 플래그 펩타이드를 용해하여 최종 농도200 ng/mL로 준비합니다.</li>
	<li>2 분 동안 3,000 x g로 5.4 단계에서 플래그 구슬을 회전합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다. 좁은 끝 파이펫 팁을 사용하여 대부분의 상체가 제거되었는지 확인합니다.</li>
	<li>각 샘플에 3x FLAG 용출 용액의 200 μL을 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 부드러운 회전으로 샘플을 배양합니다. 3,000 x g에서2 분 동안 플래그 구슬을 아래로 회전합니다. 수퍼네티를 신선한 튜브로 옮기.</li>
	<li>6.2 및 6.3 단계에 설명된 대로 용출 2x를 반복하고 용출을 함께 풀을 놓습니다. 플래그 IP의 효율성을 확인하기 위해 서양 블롯 분석 또는 실버 염색용 용액의 5%를 저장합니다.</li>
</ol>7. 스트렙타비딘 비즈 준비
<ol><li>각 샘플에 대해 스트렙타비딘 비드 슬러리의 50 μL을 준비합니다. 30s용 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 파이펫 팁으로 상퍼를 제거합니다.</li>
	<li>0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 30초간 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집합니다.</li>
	<li>세척을 1x반복합니다. 세척 후 상체를 제거합니다.</li>
</ol>8. 비오틴 친화성 정화
<ol><li>풀이 된 용용액을 6.4 단계에서 스트렙타비딘 구슬로 7.3 단계에서 옮기고 샘플을 4°C에서 1-3h 또는 하룻밤 동안 부드럽게 회전시로 옮기다.</li>
	<li>30s용 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 500 μL의 워시 버퍼 C(표 1)로구슬 2x를 5 분 동안 RT에서 부드러운 회전으로 씻으시다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 5 분 동안 RT에서 회전하여 워시 버퍼 D(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 세척합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL(표 1)로구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.</li>
</ol>9. 부분 RNA 소화
<ol><li>MNase 반응 버퍼(표 1)와MNase의 10-5배 희석을 합니다. 각 샘플에 100 μL의 MNase 솔루션을 추가합니다. 10분 동안 1,200rpm(5s run, 30s stop)으로 설정된 열 믹서로 37°C에서 구슬을 소용돌이시키고, 30초 동안 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상복부을 제거한다. 참고: MNase의 농도는 다른 RNA 결합 단백질에 최적화되어야 합니다. 30-50 nt 단편으로 RNA를 소화할 수 있는 MNase 농도(최종 라이브러리의 삽입 크기에 의해 결정)가 최적입니다.</li>
	<li>얼음 차가운 PNK +EGTA 버퍼(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 빠르게 씻으십시오. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 각 세척 단계 사이의 상체를 제거합니다.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 부드러운 회전으로 500 μL의 워시 버퍼 C로 구슬 2x를 씻으실 수 있습니다. 그런 다음 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다.</li>
</ol>10. RNA의 탈포시화
<ol><li>10x CIP버퍼(재료표),CIP 효소 3μL, 물 69μL의 8μL과 종아리 내장 인산염(CIP) 반응 혼합을 만드십시오. 총 부피는 반응당 80 μL입니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 구슬에 CIP 반응 믹스를 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s run, 30 s stop)에서 설정된 열 믹서가있는 37 °C에서 구슬을 소용돌이.</li>
	<li>얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.</li>
</ol>11. 3' 링커 합리화
<ol><li>20 μM 3' 링커 4μL, 10x T4 RNA 리구슬 완충제 4μL, 50% PEG8000의 4μL, T4 RNA 리개세 2(잘린) 2μL, 26 μL의 3'링커 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드로 10.3 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 3' 링커 계향 믹스의 40 μL을 비드에 추가합니다. 16°C에서 구슬을 1,200rpm(5s 런, 30s 스톱)에서 3시간 또는 1박동안 설정하여 구슬을 소용돌이시다.</li>
	<li>얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.</li>
</ol>12. PNK 치료
<ol><li>10x PNK 버퍼 4μL, T4 PNK 효소 2μL, 10mM ATP 1μL, 33μL의 물과 함께 PNK 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 비드에 PNK 믹스 40 μL을 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 스톱)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 부드럽게 구슬을 소용돌이.</li>
	<li>얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 세척합니다.</li>
	<li>얼음-차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 씻으시면 됩니다. 면역 침전의 효율을 확인하기 위해 서양 또는 은 염색 분석을 위한 구슬의 5%를 저장합니다.</li>
</ol>13. RNA 격리
<ol><li>자기 스탠드로 12.4 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 단백질제 K 소화버퍼(표 1)의200 μL을 추가합니다. 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 정지)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 30 분 동안 구슬을 소용돌이. 구슬을 자기적으로 분리하고 실험을 위해 상체를 복용합니다.</li>
	<li>RNA 격리 시약(재료표)의400μL을 13.1단계에서 상퍼에 넣고, 철저히 섞고, 얼음 위에서 5분 동안 배양한다. 80 μL의 클로로폼을 넣고 철저히 섞은 다음 얼음에 5분 동안 배양합니다. 10 분 4 °C에 대한 12,000 x g로 아래로 회전합니다. 참고: 이 단계는 화학 적 후드에서 수행해야합니다.</li>
	<li>상체(~500 μL)를 복용하고 이소프로판올 믹스(1:1), 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 부피(pH = 5.5), 글리코겐 1μL을 추가합니다. 2 시간 동안 -20 °C에서 동결하십시오. 4°C의 원심분리기와 12,000 x g의 20분.</li>
	<li>얼음 차가운 70 % 에탄올로 펠릿 2x를 씻으십시오. 펠릿을 4°C에서 5분 동안 12,000 x g로 회전시합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 건조. RNA가 없는 H2O의 5μL로 RNA를 용해하십시오.</li>
</ol>14. 5' RNA 링커 합리화
<ol><li>10x T4 RNA 리구효소 버퍼 1μL, BSA의 0.5 μL(1 μg/μL), 10mM ATP1 μL, RNase 억제제 1μL, T4 RNA 리게아제 0.5 μL의 RNA 결찰 혼합물을 만듭니다. 총 부피는 반응당 4μL입니다.</li>
	<li>5' 20 μM RNA 링커의 1μL을 1단계13.4에서 RNA에 추가하고, RNA를 70°C에서 2분 동안 가열하여 건조시키고, 얼음에 즉시 냉각한다.</li>
	<li>단계 14.2에서 RNA 결찰 믹스를 RNA에 추가합니다. 하룻밤 동안 16 °C에서 배양하십시오.</li>
</ol>15. 역전사
<ol><li>섹션 13에 설명된 대로 RNA를 정화하고 RNase 가 없는 물의 11.5 μL로 RNA를 용해한다.</li>
	<li>10 μM 역전사 프라이머의 1μL을 정제된 RNA에 넣고 70°C에서 2분 동안 가열하고 얼음에 즉시 식힙니다.</li>
	<li>역전사 혼합을 5배 역전사 버퍼 4개, μL 10mDNTP 1μL, 0.1M DTT 1μL, RNase 억제제 1μL, 역전사 0.5μL(재료표)로역전전사 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 7.5 μL입니다.</li>
	<li>RNA에 역전사 믹스의 7.5 μL을 추가하고, 50°C에서 30분 동안 배양하고, 10분 동안 70°C에서 인큐베이션에 의한 반응을 중지한다. 4 °C에서 둡니다.</li>
</ol>16. PCR 증폭
<ol><li>PCR 증폭 믹스는 2x PCR 마스터 믹스(재료표), 10μM 전방 프라이머 1(표 2), 0.6 μL 10μM 역프라이머1(표 2),H2O의8.8 μL에서 15μL(재료표), 5μL의 cDNA를 15.4, 0.6 μL로 만듭니다. 총 부피는 30 μL입니다.</li>
	<li>다음 설정으로 cDNA를 증폭: 98°C 30, 98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s(15-20 사이클에 대한 2-4반복 단계), 72°C 2분, 4°C에서 유지. PCR 제품을 2-3% 아가로즈 젤로 실행합니다. ~100-150 bp의 DNA를 잘라내고, 젤 추출키트(재료 표)로 DNA를추출하고, 20 μL의 물로 DNA를 엘루트합니다.</li>
	<li>정제된 PCR 제품의 3μL을 복용하고, 앞으로 프라이머2(표 2)및 역프라이머 2(인덱스 프라이머)로 증폭; 표 2) 인덱스 시퀀스를 도입하기 위해 5주기에 대해 16.2 단계에 설명된 바와 같이. 16.2 단계에서 설명된 대로 PCR 제품을 정화합니다.</li>
	<li>처리량이 높은 시퀀싱 플랫폼으로 라이브러리를 시퀀싱합니다.</li>
</ol>17. 생물정보학 분석
<ol><li>이전에 설명된8과같이 상용 프로그램을 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

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여기서는 플래그-비오틴 이중 태깅 시스템을 활용하여 단백질-RNA 복합체의 탠덤 정제를 수행하기 위해 FbioCLIP-seq라는 수정된 CLIP-seq 방법을 소개합니다. FLAG-biotin 이중 태깅 시스템은 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용13,21을식별하는 데 강력한 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 단백질과 상호 작용하는 RNA를 식별하는 이 시스템의 높은 특이성과 편리성을 보여줍니다. 탠덤 정화및 엄격한 세척 조건을 통해, 우리는 더 많은 단백질-RNA 상호 작용이 보존되고 동일한 복합체에서 RBP에 의해 매개되는 오염된 RNA 신호를 피하기 위하여 도전적인 SDS-PAGE 및 막 전달 단계를 건너뛰었습니다. 게다가, 이 단계의 우회는 방사선 표지ATP를 가진 RNA의 표시를 방지합니다. 이렇게 하면 절차가 훨씬 쉬워집니다. 우리의 출판을 준비하는 동안 uvCLAP라는 유사한 방법도<...

RNA 및 RNA 결합 단백질(RBP)은 접합, 번역, 리보솜 생물발생, 후생유전학 적 조절 및 세포 운명 전이1,2,3,4,5,6을포함한 다양한 세포공정을제어한다. 이러한 프로세스의 섬세한 메커니즘은 RNA 및 RBP의 고유한 공간 및 측두화 배열에 따라 달라집니다. 따라서, 분자 수준에서 RNA 조절을 이해하는 중요한 단계는 RBP의 결합 부위에 대한 위치 정보를 공개하는 것이다.
교차 연결 및 면역 강수량(CLIP-seq)이라고 하는 전략은UV교차 연결과 단백질-RNA 상호 작용을 포착하고 관심 있는 단백질7의 면역 침전을 통해 개발되었다. 방법론의 주요 특징은 RNA 결합 단백질과 UV 조사8에의해 직접 결합된 RNA 분자(~1Å 내)사이의 공유 교차 링크유도이다. RBP 발자국은 일반적으로 30-60 nt의 해상도를 갖는 CLIP 태그 클러스터링 및 피크 호출에 의해 결정될 수 있습니다. 대안적으로, CLIP의 역전사 단계는 단일 뉴클레오티드 해상도에서 RNA에 단백질 결합 부위를 식별할 수 있는 교차 연결 부위에 대한 인델(삽입 또는 삭제) 또는 대체로 이어질 수 있다. Novoalign 및 CIMS와 같은 파이프라인은 CLIP-seq8의고처리량 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 개발되었습니다. 몇몇 수정된 CLIP-seq 방법은 또한 개별-뉴클레오티드 분해능 교차 연결 및 면역 침전(iCLIP), 향상된 CLIP(eCLIP), irCLIP 및 광액활성 리보뉴클레오시드-향상된 상호 연결 및 면역침전(PAR-CLIP)9,10,11,12를포함하는 제안되었다.
RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 CLIP 메서드에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 지루한 변성 젤 전기포고및 멤브레인 전달 절차는 정보의 손실로 이어질 수 있으며, 제한된 서열 복잡성을 야기할 수 있다. 둘째, 단백질 특이적 항체 기반 CLIP 방법은 단일 표적 단백질 대신 단백질 복합체를 당기고, 이는 코퓨화된 RBP로부터 거짓 양성 단백질-RNA 상호작용으로 이어질 수 있다. 셋째, 항체 기반 전략은 고품질 항체없이 RBP의 연구에 적합하지 않은 이러한 방법의 적용을 가능하게 하는 고품질 항체의 다량이 필요하다. 넷째, 기존의 CLIP 방법은 단백질 바운드 RNA에 라벨을 붙이기 위해 무선 라벨ATP가 필요합니다.
생물학적 단백질에 대한 연쇄상 구도가 높기 때문에 특정 단백질이나 단백질 복합체를 정화하는 매우 강력한 접근법이 됩니다. 포유류 세포에서 자궁극피발성 세균비라 비오틴 리구아제에 의해 인공 펩티드 서열을 운반하는 단백질의 효율적인 생체자극화는 생체내13에서비오틴 정화를 수행하는 효율적인 전략이다. 플래그-비오틴 태그 탠덤정화(도 1)를이용하여 페토클립-세크(FLAG-Bio틴 매개 Cross-linking 및 Immunop회수 후 고처리량 시퀀싱)라는 수정된 CLIP-seq 방법을 개발하였다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RBP가 제거됩니다(그림2). 엄격한 세척 조건은 또한 SDS 페이지 와 멤브레인 전송을 우회 할 수 있습니다, 이는 노동 집약적이고 기술적으로 도전이다. 그리고 eCLIP 및 irCLIP과 유사, Fbio클립 - 세크 방법은 동위원소가 없습니다. 젤 실행 및 이송 단계를 건너뛰면 정보의 손실을 방지하고, 정통 단백질-RNA 상호 작용을 그대로 유지하며, 라이브러리 복잡성이 증가합니다. 또한, 태그 시스템의 높은 효율은 고품질 항체가 없는 RBP에 적합합니다.
여기서 우리는 포유류 세포에 대한 FbioCLIP-seq 프로토콜에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 간략하게, 세포는 세포 용해 및 FLAG 면역 침전물 (FLAG-IP)에 선행된 254 nm UV에 의해 교차 연결됩니다. 다음으로, 단백질-RNA 복합체는 비오틴 친화성 포획에 의해 더욱 정제되고 RNA는 MNase와의 부분 소화에 의해 단편화된다. 이어서, 단백질 바운드 RNA는 3'링커로 탈포및 결찰된다. RNA가 PNK로 인포화되고 단백질제 K 소화에 의해 용출된 후에 5' RNA 링클러가 첨가됩니다. 역전사 후, 단백질 바운드 RNA 신호는 PCR에 의해 증폭되고 아가로즈 겔 정화에 의해 정제된다. 두 개의 RBP는 FbioCLIP-seq 결과를 예시하기 위해 선택되었습니다. LIN28은 마이크로RNA 성숙, 단백질 번역 및 세포 재프로그래밍15,16,17에관여하는 잘 특징적인 RNA 결합 단백질이다. WDR43은 리보솜 생체 발생, 진핵 전사 및 배아 줄기 세포 편성대조군(14,18)을조정하기 위해 생각되는 WD40 도메인 함유 단백질이다. 클립-세크와 LIN28에 대한 이전에 보고된 결과와 일치하여, FbioCLIP-seq는 마이크로RNA 미르-let7g 및 mRNAs16, 19 (그림 3)에서"GGAG"모티브에 LIN28의 결합 부위를 공개합니다. WDR43 FbioCLIP-seq는 또한 WDR43의 결합 선호도를 5' 외부 전사 스페이서(5'-ETS)로 확인하였다(도4). 이러한 결과는 FbioCLIP-seq 메서드의 신뢰성을 검증합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purification Beads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin beads</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG 펩타이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 (염화칼슘2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0290S</td><td>CIP 버퍼는 동일한 패키지에 있습니다.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>겔 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td></td><td>Ambion AM9510</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>시그마-알드리치</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>포르테이나제 K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 하이파이 2X 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>리버스 트랜크립타제( SupperScriptIII)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNA 분리 시약 (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr>, <tr><td>나트륨 deoxycholate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td>, <td>NEB</td><td>M0201S</td><td>, PNK 버퍼는 동일한 패키지에 있습니다.</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가,</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0021</td>, <td>T4 RNA 리가제 완충액 및 BSA는 동일한 패키지에 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제2, 절단된</td><td>NEB</td><td>M0242S</td><td>T4 RNA 리가제 완충액 및 50% PEG는 동일한 패키지에 있습니다.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urea Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mESC 배양 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM(80%)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS(15%)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1%)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>정제 재조합 단백질; 10,000배 희석</td></tr><tr><td>NEAA (1%)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오시드 믹스 (1%)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (1%)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 겔 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-rna 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA 및 RNA 결합 단백질 (RBP)은 다중 생물학적 과정을 제어합니다. RNA 및 RBP의 공간 적 및 시간적 배열은 이러한 프로세스의 섬세한 조절에 기초합니다. CLIP-seq(교차 연결 및 면역 침전)라는 전략은 면역 강수량 다음으로 UV 교차 연결과 내인성 단백질-RNA 상호 작용을 포착하기 위해 개발되었습니다. RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법의 광범위한 사용에도 불구하고, CLIP 방법은 고품질 항체의 가용성, 코퓨화된 RBP의 잠재적 오염 물질, 동위원소 조작 요구 사항 및 지루한 실험 절차 중 정보의 잠재적 손실에 의해 제한됩니다. 여기서 우리는 플래그 비오틴 태그 탠덤 정화를 사용하여 FbioCLIP-seq라는 수정 된 CLIP-seq 방법을 설명합니다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RNA 결합 단백질이 제거됩니다. 따라서 이러한 공동화된 RBP에 의해 간접적으로 상호 작용하는 RNA도 감소된다. 우리의 FbioCLIP-seq 방법은 동위원소 가없고 단백질 특정 항체가 없는 방식으로 SDS-PAGE 및 멤브레인 이송 절차 없이 직접 단백질 바운드 RNA를 효율적으로 검출할 수 있습니다.

FbioCLIP-seq 절차의 회로도 표현은 그림 1에표시됩니다. 플래그 매개 또는 스트렙타비딘 매개 1단계 친화성 정화와 비교하여, FLAG-biotin 탠덤 정제는 거의 모든 코퓨화된 단백질을 제거하여 간접 단백질-RNA 상호작용의 오염을 피하였다(도2). LIN28 및 WDR43의 FbioCLIP-seq의 대표적인 결과는 그림 3과 그림 4에묘사되어 있습니다. 우리는 MESC와 LIN28 또는 WDR43 Fbio클립 - 세크를 수행했다. 그림 3A는 사전 렛-7g에서 LIN28 및 WDR43 FbioCLIP-seq의 트랙 뷰를 나타낸다. 보고된 GGAG 모티프는 7g 전과 ...

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

단지 결합 단백질만이 여러 생물학적 과정을 제어합니다. 이 FLAG-Biotin CLIP-seq 방법은, 따라서 전 세계적으로 포유류 세포에 있는 RNA와 RBP의 특수하고 측두측 배열을 프로파일로. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 멤브레인 전달 절차 없이 직접 단백질 바인딩 된 RNA를 효율적으로 감지 할 수 있습니다.전통적인 CLIP-seq에 비해 동위원소무료이며 단백질 특정 항체가 필요하지 않습니다. 10센티미터 판에 약 3백만 개의 마우스 배아 줄기 세포를 도금하고 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 진공으로 매체를 제거하고 실온에서 2 분 동안 0.25 %의 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 세포를 치료하십시오.신선한 MESC 배지의 4 밀리리터로 트립신을 담금질하고 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 3 분 동안 300 회 G로 분리하고 상체를 제거합니다. 차가운 PBS의 4 밀리리터에서 세포를 중단하고 교차 연결을 위해 10센티미터 플레이트로 다시 전송합니다.254 나노미터 UV 빛으로 세포를 방사한 다음 교차 연결된 세포를 15 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이 세포를 섭씨 4도에서 3분 동안 300회 G로 회전한 다음, 원고 방향에 따라 준비된 버퍼 A의 500 마이크로리터로 셀을 분해합니다. 세포를 RNA가 없는 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30~60분 동안 부드러운 회전으로 배양합니다.10분 동안 37°C에서 DNAse 1의 30 마이크로리터로 lysate를 처리합니다. 이어서, 0.5 어금니 EDTA의 4개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중지한다. 불용성 펠릿을 섭씨 12, 000회 G에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 스핀다운하고, 상체를 1.5밀리리터 튜브로 옮기십시오.셀 리사테를 미리 평형된 FLAG 구슬로 옮기고 샘플을 섭씨 4도에서 배양하고 2~4시간 동안 회전합니다. 인큐베이션 후, 구슬을 3000회 G에서 2분간 원심분리하고 상퍼를 제거합니다. 500 마이크로리터의 버퍼 A를 샘플에 추가하고 섭씨 4도에서 5분간 배양한 다음 구슬을 회전시키고 상체를 제거합니다.버퍼 A로 세척을 반복하고, 3개의 X FLAG-peptide로 미리 차가운 버퍼 B.To 두 개의 세척을 하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 용출 용액을 준비하고 FLAG-구슬을 회전시한다. 좁은 끝 파이펫 끝으로 상체를 제거하고 각 샘플에 3개의 X FLAG 용출 용액의 200 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 부드럽게 회전합니다.그런 다음 3000 회 G.에서 2 분 동안 구슬을 스핀 다운하여 초탄을 신선한 튜브로 옮기고 용출을 두 번 반복합니다. 플래그 면역 침전의 효율을 확인하기 위해 서양 얼룩 분석 또는 은 염색용 용용액의 5%를 저장합니다. 뽑아낸 용액을 준비한 스트렙타비딘 구슬로 옮기고 샘플을 섭씨 4도에서 1~3시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 회전시합니다.그런 다음 자기 스탠드에서 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 완충 C 500 마이크로리터로 구슬을 세척당 5분간 부드럽게 회전하여 두 번 씻습니다. 다음으로, 완충 D의 500 마이크로리터로 두 번 구슬을 세척하고, 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 마이크로리터로 두 번 세척하여 자기 스탠드에 구슬을 수집하고 세척 사이에 상체를 제거합니다.부분 RNA 소화를 수행하려면 각 샘플 및 소용돌이에 100 마이크로리터를 추가하여 10분 동안 열 믹서를 사용하여 섭씨 37도로 설정합니다. 30초 동안 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 PNK-EDTA 버퍼, 버퍼 C 및 PNK 버퍼로 세척합니다.마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 그런 다음, CIP 반응 믹스를 추가하고 10 분 동안 열 믹서와 섭씨 37도에서 구슬을 소용돌이. 얼음 차가운 PNK EDTA 버퍼 500 마이크로리터로 구슬을 두 번 빠르게 씻은 다음 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 마이크로리터가 있는 두 개의 세척을 합니다.세차 후, 3개의 프라임 링커 계합 믹스의 40마이크로리터를 구슬에 넣고, 3시간 또는 1박 동안 열 믹서로 섭씨 16도에서 소용돌이를 피하십시오. 이 실험에서 링크러를 아군에 효율적으로 연결하는 것이 중요합니다. 반응 튜브를 가끔 확인하여 이러한 튜브가 결찰 중에 침전되지 않도록 하십시오.인큐베이션 후 PNK EDTA 및 PNK 버퍼로 세차스를 반복하고, 구슬에 혼합된 PNK 의 마이크로리터 40을 추가하고, 10분 동안 열 믹서로 섭씨 37도에서 소용돌이를 피한다. PNK EDTA 및 PNK 버퍼로 구슬을 세척한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 RNA 격리를 진행합니다. 플래그 매개 또는 스트렙타비딘이 1단계 친화성 정화를 중재한 것과 비교하여, FLAG-Biotin 탠덤 정제는 간접 단백질 RNA 상호 작용의 오염을 피하면서 거의 모든 핵심 정제 단백질을 제거하였다.LIN28 및 WDR43, Fbio CLIP-seq는 마우스 배아 줄기 세포를 사용하여 수행되었다. LIN28과 WDR43에 대해 총 약 770만 개와 220만 개의 고유 판독이 검색되었습니다. 트랙 뷰의 비교는 RN45 프리 rRNA 궤적에서 다른 바인딩 패턴을 보여줍니다.LIN28, Fbio CLIP-seq 또는 식별에 의해 사전 let7g RNA의 GGA G 모티프에 교차 연결된 사이트. 더욱이, 결합 부위에서 농축된 RNA 모티브, 및 다양한 유형의 돌연변이에 있는 돌연변이 뉴클레오티드의 백분율이 결정되었다. LIN28이 유전자 뉴클레오티드에 결합하는 것을 선호한다는 것을 보여주는.음, 오후 10:00에, 이 프로토콜은, 단백질 전용 복합체가 성공적으로 정제되었는지 확인하기 위하여 면역 강수량의 효율성을 확인하는 것이 중요합니다.

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

RNA의 성적표는 횡단 행동 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 다수에 의해 중재됩니다 광범위한 posttranscriptional 규정이 적용됩니다. 여기 우리는 정확하고 transcriptome 전체 규모 RBPs의 RNA 결합 사이트를 식별할 수있는 generalizable 방법을 제시.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질의 RNA 표적을 식별하기 위한 Fbio CLIP-seq 방법을. 이 기법은 SDS-PAGE 없이 직접 단백질 결합 RNA를 효율적으로 검출하여 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

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