Name: 종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 종양 조직에서 면역 세포를 시각화하고 정량화하며 매핑하는 방법을. 면역 요법 반응을 예측하는 조직-면역 시그니처를 식별하여 암 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 연구 참가자에게 감사드립니다. 우리는 조직 견본 및 모든 관련임상 정보의 복구를 위한 HBP biobank의 조정자 루이스 Rousseau, 감사합니다. 우리는 우수한 기술 지원을 위해 Visiopharm에서 CRCHUM및 마이클 퍼쉬에서 분자 병리학 및 세포 이미징 핵심 시설을 인정합니다. 자금 조달: 이 연구 결과는 캐나다 간 재단, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) 에이즈 및 감염증 네트워크 (Réseau SIDA-MI) 및 C형 간염에 캐나다 네트워크 (CanHepC)에서 보조금에 의해 지원되었습니다. CanHepC는 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR) (NHC-142832)와 캐나다의 공중 보건국에서 공동 이니셔티브에 의해 투자됩니다. M.F.M.은 몬트리올 대학교, 부르스 가브리엘 마르퀴스, 그리고 FRQS로부터 펠로우십을 받았습니다. T.F.는 CIHR과 CanHepC로부터 박사 펠로우십을 받았습니다. S.T.는 몬트리올 대학교의 간및 췌장 종양학 수술에서 Roger-Des-Groseillers 의자를 보유하고 있습니다.
작성자 기여: M.F.M.은 데이터를 설계, 수행 및 분석했습니다. T.F. 디자인 된 실험. A.C-B. 기술 적인 지침을 제공합니다. G.S.는 연구 대상자의 모든 병리학 적 평가를 수행하고 모든 병리학 적 측면에 대한 입력을 제공했습니다. L.M.은 H&E 염색, 최적화 및 이미지 수집을 수행했습니다. M.N.A.는 PSR 얼룩을 수행하고 귀중한 기술적 입력을 제공했습니다. N.B.는 이미지 분석에 기여했습니다. S.T.는 HBP 바이오뱅크의 주요 조사자이며 바이오뱅크의 전반적인 운영을 감독하고 있습니다. 그는 또한 프로젝트의 모든 측면과 임상적 의미에 대한 귀중한 의견을 제공했습니다. M.F.M, T.F., 및 N.H.S.는 연구를 개념화하고 설계했습니다. N.H.S.는 작업을 감독하고 자금을 확보했습니다. M.F.M., T.F., A.C-B, N.H.S.는 원고를 썼습니다. 모든 저자는 원고를 검토하고 승인했습니다.

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

조직 단면도에 있는 면역 세포의 공간 해결책을 허용하는 간단하고, 접근가능하고, 실행하기 쉬운 기술은 암과 그밖 면역학 무질서에 있는 면역 풍경을 지도로 하기 위하여 필요합니다. 여기서, 우리는,이미징분석12,,13,17,,19의다중화 능력 및 다차원 평가를 확장하기 위해 널리 이용 가능한 라벨링 및 디지털 분석 기법을 통합하는 전략을 설명한다. 서로 다른 마커에 대한 세 개의 직렬 섹션의 염색과 스트리핑 및 재생 기술을 통해 섹션을 재사용하면 H&E 및 PSR 얼룩 외에도 11개의 매개 변수를 시각화할 수 있었습니다. 이 섹션에서 6 개의 이미지는 조직 정렬 모듈을 사용하여 자동화 된 방식으로 정렬되었습니다. 정렬은 동일한 섹션에서 시작된 이미지에 대한 개별 셀 수준에서 정확했으며 인접 섹션에서 발생하는 이미지에 대해 매우 일치합니다. 가상 멀티플렉싱을 통해 한 섹션에서 시각화된 마커가 다른 연속 섹션에서 시각화된 마커와 공간적으로 어떻게 관련되는지 확인할 수 있었습니다. 일부 얼룩은 COI라고 표시되어 있지만 다른 얼룩은 TC에 레이블을 지정하여 다른 TC에서 COI를 정량화할 수 있었습니다. COI의 자동 정량화를 위한 소프트웨어 도구의 사용은 이미지 처리를 크게 단순화하고 가속화시켰습니다. 더욱이, 디지털 분석은 TME의 편견 표현의 결과로, 선택된 시야 대신 전체 조직 단면도에 적용되었습니다. 더욱이, COI의 조직 좌표가 등록되었기 때문에, 조직 히트맵을 생성할 수 있었다.
이 프로토콜에는 문제 해결이 필요할 수 있는 여러 영역이 있습니다. 첫째, 가난한 항원 검색은 mIF의 질에 영향을 미칠 수 있으므로 항원 검색 버퍼 및 지속 시간의 유형은 사용되는 특정 분석/바이오마커 조건에 맞게 최적화되어야 합니다. 둘째, 사용되는 차단 용액의 유형은 1 차 및 이차 항체의 조직 / 항원 / 종에 적응해야합니다. 우리의 손에, 조직이 차단 된 Fc 수용체로부터 오는 종으로부터 10 % 총 혈청을 첨가하여 비특이적 항체 결합을 감소시켰다. 이차 항체가 제기된 종으로부터 혈청의 10%를 첨가하면 조직 섹션에 대한 이차 항체의 직접적인 비특이적 부착을 최소화할 것이다. 셋째, 적절한 양성 및 음성 대조군을 이용한 1차 및 2차 항체의 특이성의 검증이 필수적이다. 넷째, 일부 채널에서 자가형광증가 및 1차 항체 스트리핑 시 DAPI의 확산도 일반적이다. 향상된 자기 형광을 해결하기 위하여는, 우리는 특정 신호가 배경의 적어도 5 배 의 강렬 값이 있던 1 차/이 차 항체 쌍을 이용했습니다. 마지막으로, 몇몇 높은 친화도 항체는 정규 스트리핑 절차로 용출될 수 없습니다. 이 경우, 우리는 라벨의 마지막 라운드에서 이러한 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 사용자는 관심 있는 항체에 대한 최적의 구성을 찾기 위해 상이한 염색 서열을 시도해야 할 수도 있다. 라벨링의 두 번째 또는 세 번째 라운드로 진행하기 전에 스트립의 효율을 확인해야합니다.
이 전략의 주요 한계 그리고 도전은 관심의 마커를 위한 1 차및 이차 형광 항체의 적당한 조합을 찾아내는 것입니다. 동시에 사용될 수 있는 다른 종 또는 다른 등방형으로 올려진 1 차적인 항체를 찾아내는 것은 상업적으로 유효한 무슨에 의해 제한됩니다. 대부분의 전체 슬라이드 스캐너에는 최대 5개의 채널을 이미징할 수 있는 램프와 필터가 장착되어 있으며, 올바른 종과 우측 형광단의 이차 항체가 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 우리는 직렬 염색 및 순차적 라벨링을 사용하여 이러한 한계를 부분적으로 극복했습니다. 몇몇 항체 조합은 관심있는 마커를 위한 최적 조합에 도착하기 위하여 시험될 필요가 있을 수 있습니다. 또 다른 제한은 DAPI 염색의 품질입니다, 스트리핑 및 reprobing항상 핵 세분화를 수행 할 수 없습니다 때문에.
조직 정렬 모듈은 최소한의 교육과 사용자의 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 이 소프트웨어는 이론적으로 이미지의 무제한 정렬을 할 수 있습니다. 그러나 정확한 정렬은 더 조직학적으로 일치하는 더 가까운 단면이 더 정확하게 정렬되는 섹션의 관련성에 따라 달라집니다. 우리는 APP를 생성하기 위해 VIS의 작성모듈을 사용했습니다. APP를 만들 때 이미지 분석에 대한 기본 지식이 필요하지만 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 때도 마찬가지입니다. 다른 이미지 분석 소프트웨어와 비교하여 VIS의 독특한 장점은 서로 다른 방법(예: IF, 히스토화학, IHC)을 사용하여 제조된 섹션의 이미지 자동 정렬을 포함합니다. 이를 통해 가상 멀티플렉싱을 사용하여 여러 관심 마커에 대한 동지역화 연구가 가능합니다. 또한 APP의 유연하고 사용자 친화적인 디자인은 사용자별 사용자 지정을 가능하게 합니다. 자동화된 정량화 및 매핑, 전체 조직 섹션 처리 가능성, 시간 절약 및 육안 검사에 의한 수동 계산에 비해 바이어스 감소.
이 전략은 암과 자기 면역의 맥락에서 조직 면역학을 위한 아주 유용한 연구 공구입니다 그러나 임상 사용을 위해 유효하지 않은 남아 있습니다. 추가적인 표준화 및 검증을 통해, 향후 여러 응용 분야에 사용될 수 있다(예를 들어, 암에서면역경관을 매핑하여 면역치료제에 대한 반응을 예측하고 모니터링하기 위해). 또한 병리학적 평가와 예후 바이오마커를 결합하기 위해 상이한 염증성 조건(예를 들어, 염증성 장 질환)에 적응될 수 있다.
이 프로토콜의 주요 중요한 단계는 라벨링의 효율성/특이성 및 의도된 용도 또는 바이오마커를 위해 설계된 APP의 견고성입니다. 따라서 특히 새 APP를 설계할 때 육안으로 정기적인 검증이 필수적입니다. 같은 섹션에 스트립 및 reprobing 또는 얼룩의 다른 유형의 여러 라운드의 효율적인 사용은 중요 한 구성 요소 이며 조직 또는 섹션 특정 될 수 있습니다. 대규모 배치 분석을 진행하기 전에 이러한 프로세스의 효율성을 확인하는 것이 중요합니다.
요약하면, 우리는 귀중한 임상 조직 샘플에서 얻을 수있는 정량적 및 공간 적 정보를 극대화하는 전략을 제공합니다. 이 방법론을 구현하는 데 필요한 리소스, 장비 및 지식은 널리 액세스할 수 있습니다. 우리는 TME에 있는 면역 세포 인구를 확인, 정량화 및 매핑하는 것을 겨냥한 계획 적인 계획 보기를 위한 유용한 가이드로 이 방법론을 제안합니다.

암 발달은 악성 세포와 TME 사이 상호 상호 작용을 관련시키는 다단계 프로세스의 결과입니다. 종양 세포 이외에, TME는 비악성 세포, 기질 세포, 면역 세포 집단 및 세포외 매트릭스(ECM)1로구성된다. 종양 조직의 상이한 세포 및 구조적 구성 요소의 공간 조직및 암과 인접한 비암 세포 사이의 동적 교환은 궁극적으로 종양 진행및 치료에 대한 반응을 조절하여2,,3,,4. 암에서 면역 반응이55,6으로 조절되는 것으로 나타났습니다. 신생물 병변 및 인접한 조직에 침투하는 상이한 면역 세포 집단은 상이한 기능과 관련된 독특한 공간 분포 패턴 및 다양한 활성화 및 분화 상태를 나타낸다(예를 들어, 프로-대 항종양). 이 다른 면역 인구 및 그들의 매개변수는 종양및 기질 구획을 가진 초과 근무를 coevolve.
단 세포 multiomics 프로파일링을 허용하는 기술의 출현은 기하급수적으로 발암과 종양 진행을 통제하는 수많은 세포 및 분자 네트워크의 우리의 이해를 증가시켰습니다. 그러나, 대부분의 단일 세포 기반 고처리량 분석 도구는 조직 파괴 및 단일 세포 분리를 필요로 하며, 그 결과 세포 및 세포 상호 작용의 공간 조직에 대한 정보의손실7. TME에 있는 특정 면역 세포의 위치 그리고 배열은 진단과 예후 가치를 가지고 있기 때문에, 공간 해결책을 허용하는 기술은 단 세포 기지를 둔 면역 프로파일링 기술의 필수적인 보충입니다.
전통적으로, 면역성 화학 (IHC) 및 다중 면역 형광 (mIF)와 같은 화상 진찰 기술은 동시에 구상될 수 있는 몇몇 바이오마커로 제한되었습니다. 이 제한은 종양 침투 면역 세포의 spatiotemporal 역학의 연구 연구를 방해했습니다, 이는 전형적으로 몇몇 자형표 마커에 의해 정의됩니다. 최근 이미징 및 분석 도구의 발전으로 멀티플렉싱의 가능성이 확대되었습니다. 히스토 세포 분석 및 이미징 질량 세포측정과 같은 새로운 항체 기반 라벨링 기술은 각각8,,9,12 및 32 바이오마커를 공간적으로 분리하는 데 사용되어 왔다. 질량 분광법 화상 진찰은, 표지를 요구하지 않는 기술, 단일 조직 단면도10,,11에서동시에 수천개의 바이오마커를 심상할 가능성이 있습니다. 이 기술은 이미 암에 있는 조직 면역 경관을 해부하기위한 큰 잠재력을 보여주었지만, 그들은 매우 정교하고 비싼 장비 및 소프트웨어를 사용하고 연구원의 대다수에 쉽게 접근할 수 없습니다.
대안적으로, 전통적인 IHC 및 mIF의 다중화 능력은 직렬 이미징, 순차적 라벨링 라운드 및 스펙트럼 이미징7,,12,,13,,14,,15,,16의사용을 통해 확장되었다. 이러한 기술은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 가상 다중 매개 변수 슬라이드로 통합 할 수있는 동일한 또는 직렬 조직 섹션에서 여러 이미지를 생성합니다. 그 결과, 동시에 시각화및 분석할 수 있는 마커의 수가 증가한다.
여기서, 시판시적 시약, 저렴한 현미경 장비 및 사용자 친화적인 소프트웨어를 이용한 조직 멀티플렉스 분석의 합리적 설계를 위한 전략을제안한다(그림 1). 이 방법론은 직렬 이미징, 순차적 멀티플렉스 라벨링, 전체 조직 이미징 및 조직 정렬을 통합하여 조직 섹션에서 면역 세포의 자동 정량화 및 매핑에 사용할 수 있는 가상 다중 매개 변수 슬라이드를 생성합니다. 이 전략을 사용하여 11개의 바이오마커와 자주 사용되는 조직학적 얼룩 2개(헤마톡실린및 에오신(H&E) 및 피크로시리우스 레드(PSR)로 구성된 가상 슬라이드를 만들었습니다. 다중 면역 세포 집단은 조직 히트맵을 사용하여 해결된 다른 조직 구획 및 그들의 공간 분포에서 확인되고, 위치되고, 정량화되었습니다. 이 전략은 제한된 임상 표본에서 얻을 수 있는 정보를 최대화하고 전체 조직, 코어 바늘 생검 및 조직 마이크로어레이를 포함한 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 보관 조직 샘플에 적용할 수 있습니다. 우리는 TME에 있는 면역 세포 인구의 식별, 정량화 및 지도에 대한 사용자 정의 적인 조사법을 디자인하기 위한 유용한 가이드로 이 방법론을 제안합니다.

<table><tbody><tr><td>항원 회수 용액: 구연산나트륨 완충액(10mM 구연산나트륨, 0.05% v/v 트윈 20, pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr>차단 용액: PBS <tr><td></td><td></td><td></td> 소 혈청 알부민(BSA)의 1% BSA, 10% 여과된 인간 혈청, 10% 여과된 당나귀 혈청, 0.1% Tween 20 및 0.3% 트리톤Multicell 800-095-EG <td></td></tr><tr><td></td> Coplin jars(EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)신규 공급 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545E 22*50</td><td></td></tr><tr><td>다이렉트 레드 80</td><td>시그마 알드리치</td><td>365548</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>전기압력밥솥</td><td>Salton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td>주의, 눈 자극</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td>주의, 흡입, 섭취 및 피부 흡수에 의해 유해</td></tr>한 <tr><td>FFPE 절편 (4&mu; m)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 글리신 0,1 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 염색 용액, Gil 1. 제형, 레귤러 스트렝스</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3535-32</td><td></td></tr><tr><td>홀더 (EasyDip 염색 항아리 홀더)</td><td>Newcomersupply</td><td>5300RK</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum</td><td>Gemini</td><td>22210</td><td></td></tr><tr><td>습도 챔버</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z670138-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Media</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>피크르산 1.3 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6744</td><td>주의, 피부 및 눈 자극</td></tr><tr><td>Picro-Sirius Red/Fast Green 솔루션: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>primary antibody anti-&alpha;SMA</td><td>Mouse IgG2a 1A4</td><td>Sigma A2547</td><td>희석 1/100</td></tr><tr><td>일차 항체 항-CD34</td><td>마우스 IgG1 HPCA1/763</td><td>Novus Biologicals NBP2-44568</td><td>희석 1/250</td></tr><tr><td>일차 항체 항-사이토케라틴 8/18</td><td>토끼 EP17/EP30</td><td>애질런트 IR09461-2</td><td>즉시 사용 가능</td></tr><tr><td>1차 항체 항-CD68</td><td>마우스 KP1</td><td>Abcam ab955</td><td>희석 1/200</td></tr><tr><td>일차 항체 항-데스민</td><td>토끼 다클론</td><td>Invitrogen PA5-16705</td><td>희석 1/200</td></tr><tr><td>1차 항체 Anti-CD4</td><td>마우스 N1UG0</td><td>Affymetrix 14-2444</td><td>희석 1/250</td></tr><tr><td>1차 항체 Anti-FoxP3</td><td>Rabbit 1054C</td><td>R & D MAB8214</td><td>희석 1/100</td></tr><tr><td>1차 항체 안티 MPO</td><td>염소 다클론</td><td>R & D Systems AF3667</td><td>희석 1/250</td></tr><tr><td>1차 항체 Anti-CD3</td><td>Rabbit SP7</td><td>Abcam ab16669</td><td>희석 1/200</td></tr><tr><td>1차 항체 Anti-CD8</td><td>Mouse C8/144B</td><td>Invitrogen 14-0085-80</td><td>희석 1/200</td></tr><tr><td>2차 항체 Donkey anti-mouse A488</td><td>Polyclonal</td><td>Invitrogen A-21202</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td><td>Polyclonal</td><td>Invitrogen A-21206</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 당나귀 항염소 A568</td><td>Polyclonal</td><td>Invitrogen A-11057</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 당나귀 항토끼 A647</td><td>Polyclonal</td><td>Invitrogen A-31573</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 쥐 항마우스 IgG1 A647</td><td>RMG1-1</td><td>Biolegend 406618</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 염소 안티 마우스 IgG2a CF568</td><td>폴리클론</td><td>시그마 알드리치</td><td>SAB4600315 희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 당나귀 안티 마우스 DyLight 755</td><td>폴리클론</td><td>인비트로겐 SA5-10171</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>2차 항체 당나귀 안티 토끼 DyLight 755</td><td>폴리클론</td><td>인비트로겐 SA5-10043</td><td>희석 1/500</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioShop</td><td>SDS001,500</td><td>주의, 구강 피부 및 눈 독성</td></tr><tr><td>Shandon 다중 프로그램 로봇 슬라이드 염색기</td><td>LabX</td><td>11384903</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Xylene 대체물,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CA89413-336</td><td>주의, 가연성, 피부 및 눈 자극, 흡입 시 유해</td></tr><tr><td>함 흔들기 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td>구연산나트륨이<td>함유된 SlowFade Gold 퇴색 방지 시약</td></tr><tr><td> 이수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>1545801</td><td>주의, 눈 자극</td></tr><tr><td>스트리핑 버퍼: 20ml 10% w/v SDS와 12.5ml 0.5M Tris-HCl(pH 6.8) 및 67.5ml 초순수를 혼합합니다. 흄 후드 아래에 800uL의 2-메르캅토 에탄올(114,4mM 최종 농도)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BioShop</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VIS 소프트웨어</td><td>Visiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전체 슬라이드 스캐너 Olympus BX61VS</td><td>Olympus</td><td></td><td>현미경: 올림푸스 슬라이드 스캐너 BX61VS, 5슬라이드 스캐너, 전동 스테이지, 자동 초점. 카메라: 광원: Xcite-120. 필터: BrightLine&reg; Sedat 필터 세트 (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736-4L</td><td>주의, 가연성, 피부 및 눈 자극성, 흡입 시 유해</td></tr>함 <tr><td>크실렌 : 에탄올 용액(1:1 v/v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>주의, 섭취, 흡입에 의해 유해하며 sking absortion에 치명적입니다. 눈 자극. 흄 후드 사용</td></tr></tbody></table>

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

종양 미세 환경 (TME)의 면역 풍경은 암 진행 및 치료에 대한 반응의 결정 인자입니다. 구체적으로, TME에 있는 면역 세포의 조밀도 그리고 위치는 중요한 진단 및 예후 값을 갖는다. TME의 다중 성 프로파일링은 종양 개시 및 진행을 조절하는 수많은 세포 및 분자 네트워크에 대한 우리의 이해를 기하 급수적으로 증가시켰습니다. 그러나, 이들 기술은 세포 또는 세포-세포 상호작용의 공간 조직에 대한 정보를 제공하지 않는다. 단일 세포 기반 의 높은 처리량 기술을 보완하기 위해 조직 섹션에서 면역 세포의 공간 적 분해를 허용하는 저렴하고 접근 가능하며 실행하기 쉬운 멀티플렉싱 기술이 필요합니다. 여기서는 직렬 이미징, 순차적 라벨링 및 이미지 정렬을 통합하여 전체 조직 섹션의 가상 다중 매개 변수 슬라이드를 생성하는 전략을 설명합니다. 가상 슬라이드는 관심 있는 셀 집단을 식별, 정량화 및 매핑할 수 있는 사용자 정의 프로토콜을 사용하여 자동화된 방식으로 분석됩니다. 이미지 분석은, 이 경우 분석 모듈 조직정렬, 저자 및 HISTOmap을 사용하여 수행된다. 우리는 우리가 1개의 임상 견본에 이 전략을 성공적으로 적용한 예를 제시하고, 한정된 조직 견본에서 장악될 수 있는 정보를 최대화하고 전체 조직 단면도에 있는 TME의 편견없는 보기를 제공하.

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

종양 마이크로 환경에서 면역 세포의 공간 조직은 임상 적 가치를 갖는다. 이 전략은 종양 조직 내의 면역 세포를 시각화, 정량화 및 매핑하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 면역 요법은 암 치료에 혁명을 일으켰습니다.그러나 모든 환자가 잘 반응하는 것은 아닙니다. 이 전략은 좋은 항종양 반응을 예측할 수 있는 조직 면역 서명을 정의하는 역할을 할 수 있다. 실험을 수행하기 전에, 대조군 조직에 대한 항체 조합 및 스트리핑 기술을 테스트하고 APP가 관심있는 마커의 검출에 정확하다는 것을 확인합니다.이미지 분석 방법에 대한 서면 설명은 정교한 기술 언어를 사용하므로 텍스트를 비디오와 결합하면 방법론을 더 잘 이해하고 복제할 수 있습니다. 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 종양 조직 섹션의 항원 회수를 위해, 항원 회수 용액의 코플린 항아리에 담그고 수돗물을 포함하는 전기 압력 밥솥에 항아리를 놓습니다. 수위는 물이 항원 검색 용액과 혼합되지 않도록 항아리 높이의 절반을 초과해서는 안됩니다.뚜껑과 밥솥의 압력 밸브를 닫고 슬라이드를 고압으로 10분 동안 처리합니다. 치료가 끝나면 밥솥의 플러그를 뽑고 압력을 해제하고 뚜껑을 엽니다. 슬라이드가 30 분 동안 밥솥에서 냉각 된 후, 새로운 코플린 항아리에서 세척 당 신선한 PBS에서 샘플을 2 시간 동안 세척한 다음 소수성 펜을 사용하여 각 조직 섹션 주위에 장벽을 그립니다.다음으로, PBS에서 0.1-어금니 글리신에 0.1-대구글리신을 실온에서 15분간 담그고 PBS에서 슬라이드를 두 번 헹구십시오. 두 번째 세척 후 슬라이드를 습도 챔버로 옮기고 차단 용액으로 각 조직 섹션을 덮습니다. 실온에서 30 분 후, 세척 당 신선한 PBS-Tween에서 5 분 동안 섹션을 두 번 헹구고 블록 용액에 희석 된 주요 항체를 빛으로부터 보호합니다.인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS-Tween에서 슬라이드를 세척당 5분 동안 세 번 헹구고 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체로 섹션을 레이블을 지정합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS-Tween에서 슬라이드를 세 번 헹구고 세척당 5분 동안 헹구십시오. 이중 증류수에 하나의 헹구기를 따라가세요.각 슬라이드에서 여분의 물을 제거하고 DAPI와 커버 슬라이드로 보충 장착 매체와 조직을 장착합니다. 초과 장착 매체를 압착한 후, 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 모든 채널에 대한 이미지를 수집하기 전에, 빛으로부터 보호, 실온에서 20 분 동안 건조 하게. 스캔 한 후 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지를 열고 Tissuealign 탭을 클릭합니다.슬라이드 트레이에 정렬할 이미지를 가져오려면 데이터베이스에서 정렬할 첫 번째 이미지를 선택합니다. 모든 이미지가 로드된 경우 워크플로 단계의 다음 단계를 클릭하여 이미지를 연결하고 모든 이미지를 첫 번째 이미지에 정렬하도록 드래그앤드롭합니다. 모든 이미지가 적절히 연결되면 연결된 이미지에서 동종 조직 특징을 나타내는 이미지 당 최소 3개의 핀을 사용합니다.핀을 사용하여 첫 번째 이미지를 추적하여 결과 정렬의 품질을 확인합니다. 만족스러운 정렬을 얻은 경우 다음을 클릭하여 이미지 레이어를 보고 데이터베이스에 합성 이미지를 저장합니다. 사용자 정의 프로토콜 APP 1을 사용하여 조직 검출을 수행하려면 이미지 분석 탭을 열고 이미지 분석 모듈에서 합성 이미지를 엽니다.열린 APP 아이콘을 클릭하고 적절한 APP를 선택합니다. APP가 작동하는지 확인하려면 선택한 조직 위치로 이동하여 미리 보기를 클릭합니다. 결과가 만족스럽다면 선택한 APP를 사용하여 이미지를 처리하려면 클릭합니다.처리 하는 동안 APP는 픽셀이 관심의 영역으로 조직 관련 픽셀의 모든 변환을 허용 하기 위해 조직과 관련 된 여부를 결정 합니다. 그런 다음 새로 생성된 관심 영역을 정렬된 이미지로 이전할 수 있습니다. 분석이 끝나면 파일과 저장을 클릭하여 새로 만든 관심 영역을 사용하여 수정된 이미지를 저장합니다.조직을 스트로마와 빈약한 종으로 세분화하려면 이미지 분석 탭을 열고 데이터베이스에서 관심 있는 파일을 선택합니다. 오픈 APP 2, APP 2는 조직 세분화를 위해 PSR 염색 된 이미지를 사용합니다. 선택한 시야에서 이미지를 처리하여 APP 2를 미리 봅니다.결과가 만족스럽지 않으면 Run을 클릭하여 전체 이미지에서 APP 2를 처리합니다. 조직의 관심 영역은 스트로마와 당장 및 각 영역으로 세분화됩니다. 새로 생성된 스트로마 및 parenchyma에 대한 관심 영역은 정렬된 이미지로 전송한 다음 수정된 이미지를 설명한 대로 내보내고 저장할 수 있습니다.관심 있는 셀 인구를 식별하고 정량화하려면 분할된 관심 이미지를 이미지 분석 모듈로 가져옵니다. 색상을 조정한 후 APP 3을 엽니다. APP 3은 관심있는 세포 인구를 감지하고 parenchyma 및 스트로마 내에서 정량화합니다.결과가 만족스럽으면 전체 이미지에서 APP 3을 실행합니다. 관심있는 모든 개별 세포는 표시될 것입니다, 그들의 조직 좌표 저장, 그리고 결정된 기질 및 당면 한 지구에 관심있는 세포의 밀도. 그런 다음 수정된 이미지를 설명대로 저장할 수 있습니다.관심 있는 표시 된 개체의 조직 열 매핑을 수행 하려면, APP 선택 창에서 적절 한 사용자 정의 프로토콜을 열고 실행을 클릭 하 여 응용 프로그램을 프롬프트 에 이방 레이블 개체의 좌표를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 빨간색으로 강조 표시된 핫스팟 영역은 관심 있는 세포 집단의 밀도가 가장 높은 반면 진한 파란색 영역은 가장 낮습니다. 특정 세포 집단의 열 맵은 이들 세포가 종양 미세 환경 내에서 조직되는 방법에 대한 추가 정보를 제공하기 위해 정렬된 이미지에 중첩될 수 있다.그런 다음 조직의 히트 맵을 내보내고 저장합니다. 라벨링의 특이성, 설계된 APP의 정확도, 동일한 섹션의 다른 얼룩의 제거 및 재강탈 효율을 확인하는 것이 중요합니다. 연쇄 이미징, 순차적 라벨링 및 조직 정렬을 통합함으로써 더 많은 마커를 동시에 시각화할 수 있으며 제한된 임상 표본에서 더 많은 정보를 추출할 수 있습니다.절제된 종양 조직 섹션의 H&E 염색은 조직 건축, 세포 형태 및 악성 종양 등급 및 전반적인 면역 침투의 모형과 같은 임상적으로 관련한 매개변수의 평가를 허용합니다. CD34 염색은 내피 세포의 검출을 허용합니다. 사이토케라틴 8/18 염색은 상피 세포의 존재를 드러내고, 항 알파 부드러운 근육 액틴 염색은 섬유겐성, 활성화된, 간 질산 세포의 식별을 가능하게 합니다.CD68 및 Desmin에 대한 항체로 재포킹하면 각각 대식세포와 근섬유 세포의 검출이 가능합니다. 종양 면역 침투를 더 잘 특성화하기 위해 T 세포 마커 및 myeloperoxidase에 대한 염색을 수행 할 수 있습니다. 피크로 시리우스 레드 스테인링은 피브릴라 콜라겐을 시각화하고 스트로마와 파렌키마 세분화를 용이하게하기 위해 수행 될 수 있습니다.스테인드 섹션 내의 조직 관련 픽셀은 관심의 특정 영역 내에서 다른 구획의 분할을 허용하도록 식별 될 수있다. 관심있는 세포 인구는 각 지역 내에서 식별 될 수있다, 주어진 세포 인구에 대한 고밀도의 영역이 핫 스팟으로 표시되는 조직지도의 생성을 허용하고 상대적으로 낮은 밀도를 가진 지역은 차가운 반점으로 나타납니다. 조직 샘플에서 면역 세포를 식별, 정량화 및 매핑하기 위한 이 방법론은 특정 연구 질문 및 관심 마커에 맞게 조정되고 검증될 수 있습니다.이 전략은 높은 처리량 분석을 위해 조직 마이크로 어레이에 적용될 수 있습니다. 또한 시투 단백질 및 유전자 발현에서 동시에 검사하기 위해 시투 혼성화와 결합될 수 있다. 우리는 환자에서 섬유질 간 조직에 있는 조직에 있는 IL-17A 생성 세포를 확인하고 지도하기 위하여 이 전략을 이용했습니다.프로토콜에 명시된 바와 같이, 몇몇 시약은 화학적으로 유해하며 관련 절차는 적절한 개인 보호 장비 및 예방 조치를 사용하여 화학 후드에서 수행되어야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 ApcMin/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

고형 종양 조직의 정량적 면역 프로파일을 결정하고 면역 종양학 바이오마커 발견을 위한 임상 코호트를 활용하는 RNA 기반 접근법의 사용은 분자 및 정보학 프로토콜을 통해 설명된다.

고형 종양의 예측 면역 모델링

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

암 면역 요법 시대에, 종양 미세 환경 역학을 밝히는 것에 대한 관심이 눈에 띄게 증가했습니다. 이 프로토콜은 염색 및 이미징 단계와 관련하여 질량 분광법 이미징 기술을 자세히 설명하므로 고도로 다중화 된 공간 분석이 가능합니다.

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

배우세요 종양 조직에서 면역 세포를 시각화하고 정량화하며 매핑하는 방법을. 면역 요법 반응을 예측하는 조직-면역 시그니처를 식별하여 암 연구에 활용할 수 있습니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

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