형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

형광 항생제의 제조는 분광광질및 현미경 검사법과 같은 편리한 분석 기술을 통해 박테리아 내의 이러한 치료 시약의 국소화의 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 항생제 국소화를 결정할 수 있는 용이성입니다. 이 지역화는 efflux를 포함한 여러 현상과 관련이 있습니다.

클릭 A 반응 절차를 수행하려면, 둥근 바닥 플라스크에 관심의 아지드 항생제를 배치하고 플라스크에 아지드의 밀리몰 당 25 밀리리터와 25 밀리리터의 물을 추가합니다. 준비된 불소 알키네를 용액에 넣고 반응을 섭씨 50도로 가열합니다. 다음으로, 구리 황산염의 0.6 등가물과 플라스크에 아스코르브 산 2.4 등가물을 추가한다.

LCMS의 분석이 반응 완료를 나타내기 전까지는 1시간 동안 또는 반응을 저어줍니다. 그런 다음 항생제 비계에 적합한 반응을 냉각하고 정화합니다. 여기서, 치프로플록사신, 라인졸리드 및 트리메토림에 기초한 아지드 중간체를 통해 해당 항생제로부터 합성된 구조의 예와 함께 형광 항생제의 제조를 위한 주요 클릭 화학 반응이 나타난다.

이러한 액체 크로마토그래피 질량 분광법은 ciprofloxacin 아지드 및 NBD 알키인 클릭 반응에서 추적, 아지드는 3.2 분에 출례하고 제품은 3.8 분에 용출되었다. 클릭 반응의 진행은 아지드 피크의 실종에 선행될 수 있다. 이러한 스펙트럼에서, 정화의 영향은 잘못된 피크가 사라짐으로 시각화 될 수있다.

합성 된 항생제의 항균 활성을 평가하기 위해, LB 천 판에 항생제 비계에 적합한 세균균의 줄무늬 글리세롤 주식과 37 섭씨에서 하룻밤 문화를 성장. 다음 날 아침, 각 접시에서 하나의 식민지를 선택하고 37섭씨에서 문화당 CAMHB의 5 밀리리터에서 하룻밤 사이에 식민지를 배양합니다. 다음 날, 신선한 CAMHB에서 배양액을 약 40배 희석하고 0.4~0.8 사이의 600나노미터에서 광학 밀도로 박테리아를 중간 로그 단계로 성장시다.

다음으로, 멸균수에 20%디메틸 설프리산화물에서 밀리리터당 1.28 밀리그램의 각 형광 항생제의 스톡 솔루션을 준비하고 96웰 플레이트의 첫 번째 컬럼의 각 웰에 10마이크로리터의 항생제를 첨가한다. 첫 번째 컬럼의 각 웰에 90 마이크로리터를 추가하고 다른 모든 우물에 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 플레이트 를 가로 질러 직렬 두 배 희석을 수행합니다.

철저하게 혼합한 후, 중간 로그 상 배양을 밀리리터당 제6식민지 형성 단위로 약 10배로 희석하고 각 배양물의 50마이크로리터를 희석유에 첨가하여 밀리리터당 5배 10분의 1의 최종 농도를 얻었다. 모든 박테리아가 도금되었을 때 뚜껑을 접시에 놓고 흔들림없이 섭씨 37도에서 18 ~24 시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 시각적으로 판을 검사합니다.

최소 억제 농도는 눈에 띄는 성장없이 잘 가장 낮은 농도가 될 것입니다. 프로브 축적 분석을 위해 세균균균의 글리세롤 재고를 LB 한천 플레이트에 37°C의 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 아침, 섭씨 37도에서 리소제니 국물에 하룻밤 문화를 위해 접시에서 하나의 식민지를 선택합니다.

다음 주 아침, 신선한 매체에서 하룻밤 문화를 약 50배 희석시 희석시. 문화권이 중간 로그 단계에 도달하면, 원심분리에 의해 박테리아를 펠릿하고 배지를 데수. PBS의 1 밀리 리터에서 박테리아를 다시 일시 중단 하 고 다시 박테리아원심 분리.

슈퍼나탄을 데수제와 PBS에서 세척된 펠릿을 600 나노미터의 광학 밀도로 재보설한다. PBS에 10 밀리머 CCCP의 10.1 마이크로리터를 박테리아 1밀리리터에 넣고 10분 동안 섭씨 37도에서 박테리아를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 PBS에서 10 에서 100 마이크로 몰러 형광 항생제 용액의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.

섭씨 37도에서 30분 간 배양한 후, 세척당 차가운 PBS 1밀리리터에서 세포를 4회 원심분리하여 세척합니다. 세척 후, 리시스 버퍼의 180 마이크로 리터와 리소지메의 70 마이크로 리터와 박테리아를 lyse. 섭씨 37도에서 30분 후, 세균을 영하 78도에서 각각 섭씨 5분, 섭씨 34도에서 3회 동결해 보겠습니다.

동결 해빙의 마지막 라운드 후, 65섭씨에서 30분 배양후 20분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 lysed 샘플을 수집하고 10 킬로달톤 필터 멤브레인을 통해 튜브 내용물을 변형. 세척당 100 마이크로리터의 물로 필터를 네 번 씻고, 각 세척을 블랙 플랫 하부 96웰 플레이트의 개별 우물로 씻어 넣습니다.

그런 다음 형광에 적합한 흥분 및 방출 파장을 플레이트 판독기의 형광 강도를 측정합니다. 이러한 전형적인 결과는 불광 분광법의 존재와 불룩스의 부재에 의한 세포내 축적의 평가에서 유래한 것으로, 박테리아의 세포내 형광이 CCCP를 통해 사전 처리 한 후 박테리아의 세포 내 형광이 박테리아 내축적을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 대표적인 공초점 현미경 이미지에서 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의, 박테리아 내항생제의 국소화는 CCCP 치료 후 시각화될 수 있다.

이 현상은 CCCP가 추가되지 않을 때 관찰되지 않습니다. 형광 성 항생제를 사용할 때, 수집하는 것을 목표로하는 정보를 염두에 두고이 데이터를 얻을 때 어떤 프로토콜이 가장 유용할지 고려해야합니다. 그들의 합성 에 따라, 형광 항생제 약물 대상 상호 작용 및 저항 수정을 포함 하 여 세균 과정의 수를 연구 하는 데 사용할 수 있습니다.