브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

이 방법은 애벌레 얼룩말물고기에서 간 크기를 정량화하는 방법을 제공합니다. 그것은 또한 간 성장 및 개발에 유전 및 약리학 조작의 효과의 평가에 대 한 허용. 이 기술은 간뿐만 아니라 창자와 췌장을 시각화하고 측정하는 신속하고 정확한 방법을 제공합니다.

간 크기를 정량화하는 것 외에도,이 해부 방법은 시상 혼성화 또는 공초점 이미징에서 간, 창자 및 췌장을 준비하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험용 애벌레에 책상을 만들기 전에 실험적이지 않은 샘플에서 연습하는 데 충분한 시간을 보냈는지 확인하고 상당한 성공률을 기록하십시오. 주변 장기를 방해하지 않고 피부를 제거하기 위해 제브라피시 애벌레와 집게의 적절한 방향과 움직임을 시각화하는 것이 중요합니다.

3~7일 후 유충을 안락사한 후 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 2밀리리터 튜브에서 최대 15개의 애벌레를 수집합니다. 얼음 위에 차가운 1X PBS 1밀리리터로 애벌레를 두 번 씻으시다. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 PBS에 차가운 4 % PFA의 1 밀리리터를 추가하십시오.

적어도 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 부드러운 흔들림으로 배양하십시오. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 튜브에서 PFA를 제거하고 차가운 PBS 1 밀리리터로 세 번 헹구십시오. 헹도 사이에 5분간 바위를 휘두르고 있습니다.

파이펫 PBS에서 여러 애벌레9 잘 둥근 바닥 유리 접시의 하나의 우물에. 현미경으로, 미세 한 포셉을 사용하여 간을 둘러싼 피부를 제거하여 한 애벌레를 등에 고정시키고 가능한 한 부드럽게 머리 양쪽에 움츠러들게 합니다. 그런 다음 다른 한편으로는 매우 미세한 집게를 사용하여 심장을 덮어 피부를 잡습니다.

생선의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 접시 의 바닥에 있는 생선의 꼬리쪽으로 대각선으로 피부를 당깁니다. 다른 쪽을 위해 반복합니다. 피부의 플랩을 잡고 모든 피부와 멜라노포어가 오버위 또는 간 근처에 제거 될 때까지 아래로 당겨 계속.

노른자가 5~6일 동안 비옥한 후 유충을 가지고 있다면, 뒤쪽에 미세한 집게로 물고기를 들고 매우 미세한 포셉을 사용하여 노른자를 부드럽게 노른자를 프로딩하여 노른자를 한 조각으로 들어 올립니다. 3~4개의 DPF 애벌레의 경우, 뒤쪽에 미세한 집게로 물고기를 잡고 매우 미세한 집게를 사용하여 복부 쪽에서 시작하는 노른자를 쓰다듬습니다. 노른자를 조각으로 긁어냅니다.

해부된 유충을 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 2밀리리터 튜브에 신선하고 차가운 PBS에 넣습니다. 애벌레를 장착하려면 깨끗한 플라스틱 페트리 접시뚜껑에 3% 메틸셀룰로오스를 몇 밀리리터를 붓습니다. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 메틸셀룰로오스에 애벌레를 추가하여 가능한 한 유충에 PBS를 추가하십시오.

낮은 배율에서 해부 현미경에서, 그들은 왼쪽을 향하고 자신의 오른쪽에 누워 있도록 물고기를 방향을 미세 한 집게를 사용합니다. 촬영할 물고기가 한쪽 눈과 완벽하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 물고기의 꼬리가 구부러진 경우, 물고기가 평평하게 놓이도록 제거하기 위해 강제로 집게로 꼬리를 제거합니다.

높은 배율에 확대하고 간 윤곽선이 명확하게 보이는지 확인, 간에 초점을 맞춥니다. 이미지 캡처 버튼을 눌러 사진을 찍고 파일을 저장합니다. 모든 물고기를 반복하여 각 그림에 대해 배율이 동일한지 확인합니다.

동일한 배율을 사용하여 마이크로미터의 사진을 찍습니다. 프로그램 R을 사용하여 잠재적인 조사자 편견을 피하고 과학적 엄격함을 촉진하기 위해 모든 간 사진을 촬영하려면 파일을 무작위로 이름을 변경하고 원본 파일 이름과 해당 맹목적인 파일 이름 목록을 포함하는 무작위 화 파일을 만듭니다. 파일 파일파일로 시작하여 무작위로 지정된 파일을 순서대로 엽니다.

프리핸드 선택 도구를 선택하고 각 간을 간 윤곽을 잡습니다. 각 간 영역을 측정하기 위해 제어-M을 누릅니다. 잔류 피부를 가지고 있기 때문에 정확하게 측정할 수 없는 간, 노른자, 초점이 닿지 않거나 손상되지 않은 간은 자리 표시자 측정을 삽입합니다.

텍스트 파일에 측정값을 저장합니다. 블라인드를 해제하고 데이터를 분석하려면 스프레드시트 프로그램에서 측정 파일 및 무작위화 파일을 엽니다. 측정 파일에 새 열을 삽입하고 무작위화 파일을 사용하여 맹목적인 파일에 대한 원래 파일 이름을 추가합니다.

이 파일을 맹목적인 측정 파일로 저장합니다. 원본 파일 이름으로 데이터를 정렬합니다. 사진이 적절하지 않은 간 측정을 제외하십시오.

필요한 경우 측정 값을 정사각형 밀리미터단위로 원하는 스케일로 변환합니다. 이미지 처리 소프트웨어에서 Scale 막대를 엽니다. 직선 도구를 사용하여 스케일 표시줄에서 1밀리미터를 측정합니다.

그런 다음 이미지 처리 소프트웨어는 간과 동일한 단위로 측정하여 변환 계수를 제공합니다. 변환 계수를 사용하여 시각 장애가 없는 측정 파일의 측정값을 변환합니다. 평균 및 표준 편차를 결정하고 P 값을 계산합니다.

6 일 후 수정, 비 형질 전환 제 브라위시 애벌레는 창 자를 덮어 간 자연 위치와 모양을 보였다. 형질 전환 제 브라위스는 비 형질전환 형제에 비해 크게 간 크기를 증가시켰습니다. 부적절한 이미지와 마이크로미터의 몇 가지 예가 여기에 표시됩니다.

간을 덮고 있는 피부를 가진 애벌레, 간을 가리는 노른자를 가진 애벌레, 간이탈과 떨어지는 간유충, 간이 빠진 애벌레, 식별하기 어려운 간 윤곽이 있는 애벌레, 부적절한 포지셔닝을 가진 애벌레. 이 절차를 시도할 때, 간 손상을 방지하기 위하여 작고 통제된 운동을 사용하는 것이 중요합니다. 밝은 필드 현미경 검사법 이외에, 우리는 또한 이방법으로 해부된 애벌레를, 공초점 현미경 검사, 형광 기자 단백질 또는 면역 형광 얼룩을 시각화하고, 현장 혼성화를 위해 사용할 수 있습니다.

포름알데히드 또는 PFA는 자극제 및 의심되는 발암 물질입니다. 장갑은 PFA를 취급할 때 착용되어야 하며 농축 된 솔루션은 화학 연기 후드로 처리해야합니다.