Name: 브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기를 정량화하는 방법을. 유전적 및 약리학적 조작이 간 성장에 미치는 영향을 평가하고 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 이 연구의 일부를 수행하기 위해 제브라피시 축산, 실험실 공간 및 장비를 제공한 유타 대학교의 Maurine Hobbs와 중앙 집중식 Zebrafish 동물 자원(CZAR)을 인정하고 싶습니다. CZAR의 확장은 NIH 교부금 # 1G20OD018369-01에 의해 부분적으로 지원된다. 우리는 또한 로드니 스튜어트, 클로이 림, 랜스 그레이엄, 코디 제임스, 개럿 니쿰, 그리고 헌츠맨 암 연구소 (HCI) 제브라피시 치료에 대한 제브라피시 시설에 감사드립니다. 우리는 R 프로그래밍에 도움을 케네스 콤파스에게 감사드립니다. 이 작품은 헌츠맨 암 재단 (헌츠맨 암 연구소에 수여 된 보조금 P30 CA042014와 함께) 및 NIH / NCI R01CA22570 (KJE)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

동물 연구는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 다음 절차에 따라 수행됩니다.
1. 애벌레 고정
<ol><li>3-7 일 후 수정 (dpf), 트리카인 메탄설포네이트 (0.03 %)와 애벌레를 안락사 유리 피펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 2 mL 튜브에 최대 15 마리의 애벌레를 수집합니다.</li>
	<li>얼음에 1 mL의 차가운 (4 °C) 1 x 인산완식염수 (PBS)로 애벌레를 두 번 씻으하십시오. 각 세척에 대해 유리 파이펫과 파이펫 펌프로 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음 튜브에 1 mL의 차가운 PBS를 추가하십시오.</li>
	<li>유리 파이펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 PBS에 1 mL의 냉기 (4 °C) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의: PFA는 자극적이고 발암물질로 의심됩니다. PFA를 취급할 때 장갑을 착용해야 하며 농축 된 솔루션은 화학 연기 후드에서 처리해야합니다.</li>
	<li>부드러운 흔들림으로 적어도 하룻밤 (하지만 몇 개월까지) 4 °C에서 배양.</li>
</ol>2. 간을 둘러싼 조직 해부
<ol><li>1 mL의 차가운 (4 °C) PBS로 3x를 헹구고 헹구 사이에 5 분 동안 흔들어 서 PFA에서 유충을 제거하십시오. 참고 : 4 °C에서 하루 이틀 동안 PBS에 헹구는 애벌레를 유지하는 것이 괜찮습니다.</li>
	<li>PBS의 여러 유충을 9웰 바닥 유리 접시의 한 우물에 피펫.</li>
	<li>간 을 둘러싼 피부를 제거합니다.<ol>
<li>미세 한 포셉을 사용 하 여 애벌레를 등 (배 위로) 잡고, 가능한 한 부드럽게 머리의 양쪽에 그립. 그런 다음 다른 손에 아주 미세한 집게를 사용하여 심장을 덮는 피부를 잡으십시오.</li>
		<li>물고기를 꼬리쪽으로 대각선으로 내리고 물고기의 왼쪽 또는 오른쪽에있는 접시의 바닥을 당깁니다. 다른 쪽(오른쪽 또는 왼쪽)에서 반복합니다.</li>
		<li>피부의 플랩을 잡고 아래로 당겨 계속 / 다시 모든 피부와 멜라 노 포어오버 또는 간 근처 제거 될 때까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>노른자를 제거하십시오( 있는 경우).<ol>
<li>5-6 dpf 애벌레의 경우, 생선을 등에 미세한 포셉으로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 노른자를 부드럽게 프로핑하여 한 조각으로 노른자를 들어 올립니다.</li>
		<li>3-4 dpf 애벌레의 경우 노른자를 조각으로 긁어냅니다. 생선을 등에 미세한 집게로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 복부 쪽에서 시작하여 노른자를 쓰다듬습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 해부 된 유충을 신선한 차가운 PBS에 넣습니다.</li>
</ol>3. 이미징
<ol><li>애벌레를 장착하려면 깨끗한 플라스틱 페트리 접시뚜껑에 3 % 메틸 셀룰로오스 몇 mL을 붓습니다.</li>
	<li>유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 추가하고 가능한 한 애벌레로 적은 PBS를 추가하십시오.</li>
	<li>낮은 배율에서 해부 현미경에서, 그들은 왼쪽을 향하고, 자신의 오른쪽에 누워 있도록 물고기의 방향을 미세 한 집게를 사용합니다. 참고: 물고기가 측면에 완벽하게 향하도록 하거나 간 측정이 정확하지 않을 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>각 물고기의 사진을 찍는다.<ol>
<li>촬영할 물고기가 한쪽 눈이 다른 눈 바로 위에 있는 것과 완벽하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 미세 한 집게를 사용하여 물고기의 머리 또는 꼬리를 가볍게 두드려 방향을 조정하십시오. 물고기의 꼬리가 구부러진 경우, 물고기가 평평하게 누워 있도록 그것을 제거하기 위해 집게로 강제로 꼬집어 꼬리를 제거합니다.</li>
		<li>높은 배율을 확대하고 간을 집중하여 간 윤곽이 선명하게 보이도록 합니다.</li>
		<li>사진을 스냅하고 파일을 저장합니다.</li>
		<li>모든 물고기에 대해 반복하여 각 그림에 대해 배율이 동일한지 확인합니다.</li>
		<li>동일한 배율을 사용하여 마이크로미터의 사진을 찍습니다(그림 2H참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 각 물고기의 간 면적을 측정합니다.<ol>
<li>잠재적 인 조사자 편견을 피하고 과학적 엄격을 촉진하기 위해 모든 간 사진을 블라인드15. 이 단계는 다른 랩 멤버가 수동으로 수행하거나 컴퓨터프로그램(보충 자료)을사용하여 수행할 수 있습니다. 파일의 이름을 임의로 변경하고 원본 파일 이름과 해당 블라인드 파일 이름 목록이 포함된 "무작위 파일"을 만듭니다.</li>
		<li>파일 1부터 순서대로 임의파일을 엽니다.</li>
		<li>자유형 선택 도구를 선택하고 각 간을 윤곽을 잡습니다.</li>
		<li>각 간 면적을 측정하려면 Ctrl-M을 누릅니다.</li>
		<li>정확하게 측정할 수 없는 간은 자리 표시자 측정값을 삽입합니다(매우 작거나 매우 크므로 나중에 쉽게 제외할 수 있음).</li>
		<li>측정값을 텍스트 파일("측정 파일")에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>블라인드 해제 및 데이터 분석<ol>
<li>스프레드시트 프로그램에서 "측정 파일" 및 "무작위 파일"을 엽니다.</li>
		<li>"측정 파일"에 새 열을 삽입하고 "무작위 파일"을 사용하여 블라인드 파일의 원래 파일 이름을 추가합니다. 이 파일을 "눈이 멀지 않은 측정 파일"로 저장합니다.</li>
		<li>원본 파일 이름으로 데이터를 정렬합니다.</li>
		<li>사진이 부적절한 간 측정은 제외해야 합니다(그림 2A-G참조).</li>
		<li>필요한 경우 측정 값을 원하는 축척(예: mm2,예:)으로 변환합니다.<ol>
<li>이미지 처리 소프트웨어에서 축척 막대를 엽니다.</li>
			<li>직선 도구를 사용하여 축척 막대에서 1mm를 측정합니다. 이미지 처리 소프트웨어는 간(픽셀)과 동일한 단위로 측정하여 변환 계수를 제공합니다.</li>
			<li>변환 계수를 사용하여 "눈이 멀지 않은 측정 파일"에서 측정을 변환합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>스프레드시트 프로그램을 사용하거나 데이터를 과학 그래프 및 통계 소프트웨어에 붙여넣음으로 평균 및 표준 편차를 결정하고 p 값을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

간 크기의 정량화는 간 발달, 재생 및 종양 발생을 이해하는 것을 목표로 하는 연구에서 매우 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 라발 제브라피시의 간 크기 정량화를 위한 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴한 기술입니다. 프로토콜의 특정 측면을 수행 하는 동안 적절 한 주의 행사 결과의 증가 정확도 및 감소 좌절에 도움이 될 수 있습니다.
유충의 적당한 고정은 잘 보존된 생물학 견본을 얻고 그들의 붕괴를 방지하는 쪽으로 중요합니다. 4% PFA 용액의 희석은 헹구된 유충에 PFA를 첨가하기 전에 PBS가 완전히 제거되지 않을 때 발생할 수 있다. 잘 만들어진 PFA 솔루션을 사용하고 PFA를 추가하기 전에 PBS 솔루션의 전부 또는 대부분을 파이펫팅하면 이 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.
많은 연습 후 빠르고 쉽게 수행 할 수 있지만, 해부 기술은 상당한 수동 손재주를 필요로한다. 해부하는 동안, 전체 간이 노출되도록 피부와 노른자를...

간세포암(HCC)은간1의 가장 흔한 1차 악성종양이며 암 관련사망률의세 번째 주요 원인2. 간암발생의 메커니즘을 더 잘 이해하고 잠재적인 HCC 치료제를 식별하기 위해, 당사와 다른 사람들은 β-카테닌3,4,Kras(V12)5,6,Myc7,또는 Yap18과 같은 종양유전자의 간세포 특이적 발현이 성인 동물의 HCC로 이어지는 형질전환 제브라피시를 개발했습니다. 이 제브라피시에서, 간 확대는 일찍 부터 지적된다 6 일 후 수정 (dpf), 종양 유전자 구동 간 과성장에 약물과 유전 변경의 효과를 테스트하기위한 허실 플랫폼을 제공. 애벌레 간 크기의 정확 하 고 정확한 측정은 이러한 조작의 효과 결정 하기 위해 필수적 이다.
간 크기 및 형상은 CY3-SA라벨링 9 또는 간세포 특이적 형광 리포터 및 형광 해부현미경5,6을사용하여 살아있는 제브라피시 유충에 의해 고정된 제브라피시 유충에서 반정량적으로 평가될 수 있다. 후자의 방법은 비교적 빠르며, 그 정밀도의 부족은 이미지 처리 소프트웨어7,10을사용하여 각 간 면적을 촬영하고 측정하여 해결할 수 있다. 그러나, 2차원 간 영역이 간 크기의 정확한 표현이 되도록 실험에서 모든 살아있는 애벌레를 균일하게 배치하는 것은 기술적으로 어려울 수 있다. 간 크기를 정량화하기위한 유사한 기술은 간이 다른 차원에서 비균일하게 확장 될 때 크기 차이를 검출하기 위해 더 정확 할 수있는 애벌레 간 볼륨8을정량화하기 위해 가벼운 시트 형광 현미경 을 사용하는 것을 포함한다. 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 애벌레간에서형광표지된 간세포 및 기타 간 세포 유형의 수를 카운트하는데 사용할 수 있다8,11. 이 방법에서는 애벌레 간이 풀화되고 해리되므로 개별 간 크기와 모양에 대한 정보가 손실됩니다. 다른 간 크기 측정 방법과 함께, FACS 증가 세포 수 사이 분화를 가능 (증식) 그리고 증가 세포 크기 (비 대). 이러한 모든 방법은 고가의 형광 기술 (현미경 또는 세포 선별기)을 사용하며 CY3-SA 라벨링을 제외하고 형광 리포터로 간세포를 라벨링해야합니다.
여기서 우리는 밝은 필드 현미경 및 화상 처리 소프트웨어3,12,13,14를사용하여 제브라피시 애벌레 간 영역을 정량화하는 방법을 상세히 기술한다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법의 사용없이 그 안에 있는 개별 간 의 지역의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 간 크기를 분석하는 동안, 우리는 조사자 편견을 줄이고 과학적 엄격을 개선하기 위해 이미지 정체성을 블라인드15.

<table><tbody><tr><td>해부용 카메라</td><td>Leica, 예:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부용 현미경</td><td>Leica, 예</td><td></td><td></td>:</tr><tr><td>Fine (Dumont #5) 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Image J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI는 무료로 다운로드할 수 있습니다: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>다양한 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 펌프</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>블라인드 파일 소프트웨어</td><td>R project</td><td></td><td>R은 무료로 다운로드 받을 수 있습니다: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Scientific 그래프 및 통계 소프트웨어</td><td>GraphPad 프리즘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프레드 시트 프로그램</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td> <td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Very fine (Dumont # 55) 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

간세포 암종 (HCC)의 여러 형질 전환 제브라피시 모델에서, 간갈기는 초기 애벌레 단계 동안 관찰 될 수있다. zebrafish HCC 모델에서 애벌레 간 크기를 정량화하면 종양 유전자 관련 표현형에 대한 약물 및 기타 조작의 효과를 신속하게 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 유충을 고치고, 간을 둘러싼 조직을 해부하고, 밝은 필드 현미경을 사용하여 간을 촬영하고, 간 면적을 측정하고, 결과를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간 크기의 신속하고 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법은 간 면적을 측정하는 것을 관련시키기 때문에, 간 양에 있는 다름을 과소평가할 수 있고, 상호 보완적인 방법론은 세포 크기에 있는 변경 및 세포 수에 있는 변경을 구별하기 위하여 요구됩니다. 본 명세서에 기재된 해부 기술은 면역형광 염색 및 내부 혼성화를 포함한 무수한 하류 응용을 위한 그들의 자연적인 위치에서 간, 창자 및 췌장을 시각화하는 훌륭한 도구이다. 애벌레 간 크기를 정량화하기 위한 기술된 전략은 간 발달 및 재생의 많은 양상에 적용가능하다.

간세포 특이적 활성화된 β-카테닌(Tg(fabp10a:pt-β-cat)을 발현하는 형질전환 제브라피시3 및 비형질조절 형제는 6dpf에서 안락사되었고, 간부위는 브라이트필드 현미경 및 영상처리 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 형질전환 제브라피쉬는 비형질전환형제(0.0004cm2,p&lt; 0.0001)에 비해 간 크기(0.0006cm2)가현저히 증가하였다. 그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60744/60744fig1a.jpg"> 그림 1: 6 dpf의 간 크기 분석 (일 후 수정) 얼룩말. (A-B)<...

여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

이 방법은 애벌레 얼룩말물고기에서 간 크기를 정량화하는 방법을 제공합니다. 그것은 또한 간 성장 및 개발에 유전 및 약리학 조작의 효과의 평가에 대 한 허용. 이 기술은 간뿐만 아니라 창자와 췌장을 시각화하고 측정하는 신속하고 정확한 방법을 제공합니다.간 크기를 정량화하는 것 외에도,이 해부 방법은 시상 혼성화 또는 공초점 이미징에서 간, 창자 및 췌장을 준비하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험용 애벌레에 책상을 만들기 전에 실험적이지 않은 샘플에서 연습하는 데 충분한 시간을 보냈는지 확인하고 상당한 성공률을 기록하십시오. 주변 장기를 방해하지 않고 피부를 제거하기 위해 제브라피시 애벌레와 집게의 적절한 방향과 움직임을 시각화하는 것이 중요합니다.3~7일 후 유충을 안락사한 후 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 2밀리리터 튜브에서 최대 15개의 애벌레를 수집합니다. 얼음 위에 차가운 1X PBS 1밀리리터로 애벌레를 두 번 씻으시다. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 PBS에 차가운 4 % PFA의 1 밀리리터를 추가하십시오.적어도 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 부드러운 흔들림으로 배양하십시오. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 튜브에서 PFA를 제거하고 차가운 PBS 1 밀리리터로 세 번 헹구십시오. 헹도 사이에 5분간 바위를 휘두르고 있습니다.파이펫 PBS에서 여러 애벌레9 잘 둥근 바닥 유리 접시의 하나의 우물에. 현미경으로, 미세 한 포셉을 사용하여 간을 둘러싼 피부를 제거하여 한 애벌레를 등에 고정시키고 가능한 한 부드럽게 머리 양쪽에 움츠러들게 합니다. 그런 다음 다른 한편으로는 매우 미세한 집게를 사용하여 심장을 덮어 피부를 잡습니다.생선의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 접시 의 바닥에 있는 생선의 꼬리쪽으로 대각선으로 피부를 당깁니다. 다른 쪽을 위해 반복합니다. 피부의 플랩을 잡고 모든 피부와 멜라노포어가 오버위 또는 간 근처에 제거 될 때까지 아래로 당겨 계속.노른자가 5~6일 동안 비옥한 후 유충을 가지고 있다면, 뒤쪽에 미세한 집게로 물고기를 들고 매우 미세한 포셉을 사용하여 노른자를 부드럽게 노른자를 프로딩하여 노른자를 한 조각으로 들어 올립니다. 3~4개의 DPF 애벌레의 경우, 뒤쪽에 미세한 집게로 물고기를 잡고 매우 미세한 집게를 사용하여 복부 쪽에서 시작하는 노른자를 쓰다듬습니다. 노른자를 조각으로 긁어냅니다.해부된 유충을 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 2밀리리터 튜브에 신선하고 차가운 PBS에 넣습니다. 애벌레를 장착하려면 깨끗한 플라스틱 페트리 접시뚜껑에 3% 메틸셀룰로오스를 몇 밀리리터를 붓습니다. 유리 파이펫과 파이펫 펌프를 사용하여 메틸셀룰로오스에 애벌레를 추가하여 가능한 한 유충에 PBS를 추가하십시오.낮은 배율에서 해부 현미경에서, 그들은 왼쪽을 향하고 자신의 오른쪽에 누워 있도록 물고기를 방향을 미세 한 집게를 사용합니다. 촬영할 물고기가 한쪽 눈과 완벽하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 물고기의 꼬리가 구부러진 경우, 물고기가 평평하게 놓이도록 제거하기 위해 강제로 집게로 꼬리를 제거합니다.높은 배율에 확대하고 간 윤곽선이 명확하게 보이는지 확인, 간에 초점을 맞춥니다. 이미지 캡처 버튼을 눌러 사진을 찍고 파일을 저장합니다. 모든 물고기를 반복하여 각 그림에 대해 배율이 동일한지 확인합니다.동일한 배율을 사용하여 마이크로미터의 사진을 찍습니다. 프로그램 R을 사용하여 잠재적인 조사자 편견을 피하고 과학적 엄격함을 촉진하기 위해 모든 간 사진을 촬영하려면 파일을 무작위로 이름을 변경하고 원본 파일 이름과 해당 맹목적인 파일 이름 목록을 포함하는 무작위 화 파일을 만듭니다. 파일 파일파일로 시작하여 무작위로 지정된 파일을 순서대로 엽니다.프리핸드 선택 도구를 선택하고 각 간을 간 윤곽을 잡습니다. 각 간 영역을 측정하기 위해 제어-M을 누릅니다. 잔류 피부를 가지고 있기 때문에 정확하게 측정할 수 없는 간, 노른자, 초점이 닿지 않거나 손상되지 않은 간은 자리 표시자 측정을 삽입합니다.텍스트 파일에 측정값을 저장합니다. 블라인드를 해제하고 데이터를 분석하려면 스프레드시트 프로그램에서 측정 파일 및 무작위화 파일을 엽니다. 측정 파일에 새 열을 삽입하고 무작위화 파일을 사용하여 맹목적인 파일에 대한 원래 파일 이름을 추가합니다.이 파일을 맹목적인 측정 파일로 저장합니다. 원본 파일 이름으로 데이터를 정렬합니다. 사진이 적절하지 않은 간 측정을 제외하십시오.필요한 경우 측정 값을 정사각형 밀리미터단위로 원하는 스케일로 변환합니다. 이미지 처리 소프트웨어에서 Scale 막대를 엽니다. 직선 도구를 사용하여 스케일 표시줄에서 1밀리미터를 측정합니다.그런 다음 이미지 처리 소프트웨어는 간과 동일한 단위로 측정하여 변환 계수를 제공합니다. 변환 계수를 사용하여 시각 장애가 없는 측정 파일의 측정값을 변환합니다. 평균 및 표준 편차를 결정하고 P 값을 계산합니다.6 일 후 수정, 비 형질 전환 제 브라위시 애벌레는 창 자를 덮어 간 자연 위치와 모양을 보였다. 형질 전환 제 브라위스는 비 형질전환 형제에 비해 크게 간 크기를 증가시켰습니다. 부적절한 이미지와 마이크로미터의 몇 가지 예가 여기에 표시됩니다.간을 덮고 있는 피부를 가진 애벌레, 간을 가리는 노른자를 가진 애벌레, 간이탈과 떨어지는 간유충, 간이 빠진 애벌레, 식별하기 어려운 간 윤곽이 있는 애벌레, 부적절한 포지셔닝을 가진 애벌레. 이 절차를 시도할 때, 간 손상을 방지하기 위하여 작고 통제된 운동을 사용하는 것이 중요합니다. 밝은 필드 현미경 검사법 이외에, 우리는 또한 이방법으로 해부된 애벌레를, 공초점 현미경 검사, 형광 기자 단백질 또는 면역 형광 얼룩을 시각화하고, 현장 혼성화를 위해 사용할 수 있습니다.포름알데히드 또는 PFA는 자극제 및 의심되는 발암 물질입니다. 장갑은 PFA를 취급할 때 착용되어야 하며 농축 된 솔루션은 화학 연기 후드로 처리해야합니다.

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

명시야 기반 입체 현미경을 사용하여 전체 조직 규모에서 제브라피시 유충 꼬리 지느러미 재생의 역학을 캡처하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 해상도로 재생 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 방법론은 CCD 카메라와 타임랩스 소프트웨어가 장착된 모든 실체현미경에 적용할 수 있습니다.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

이 프로토콜은 간 재생의 연구를 가능하게 하기 위하여 성인 얼룩말물고기에 있는 간의 복부 엽을 제거하기 위한 절차를 기술합니다.

성인 얼룩말 피시의 부분 간 절제술

여기서는 종양 거동 분석, 전산 면역형화 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

여기에서는 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경 및 면역 세포 환경에 미치는 영향을 연구하기 위해 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 관련 간세포 암종 (HCC) 제브라 피쉬 모델을 생성하는 방법을 제시합니다.

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

배우세요 브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기를 정량화하는 방법을. 유전적 및 약리학적 조작이 간 성장에 미치는 영향을 평가하고 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

더 많은 동영상 탐색