성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

신호 변환은 생물학 및 제약 연구에서 가장 중요한 주제 중 하나입니다. 세포 내 신호 파트너 단백질에 신호를 전송하는 막 단백질이 필요합니다. 이 프로토콜은 구조 결정을 목표로 하는 신호 복합체를 준비하기 위해 체계적인 세제 스크리닝을 수행하도록 설계되었습니다.

이 프로토콜은 잘 확립 된 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수있는 기술을 사용하고 현장에서 초보자에 의해 쉽게 수행 할 수 있습니다. 우리는 막 단백질 복합체의 준비에 있는 가장 중요한 파라미터를 찾아내기 위하여 이 방법을 구성했습니다. 시작하려면, 해동 30 HEK293 GNT I-결핍 세포 펠릿의 실온에 그것을 전송 하 고 비커로 전송.

120밀리리터의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하고 있으며, 13, 000 RPM에서 13, 000 RPM의 전기 균질화제를 사용하여 균질성을 30초 간 첨가합니다. PBS 버퍼로 볼륨을 150 밀리리터로 조정합니다. 균질화된 셀에 10%DDM을 부드럽게 추가하여 1시간 동안 얼음에 1.25%의 최종 농도를 부여합니다.

용해 후, 원심분리는 4섭씨 4도, 000배 G에서 용해되어 45분 동안 용해되지 않은 잔해를 제거합니다. 500 밀리리터 병에 상체를 전송하고 50%1D4 면역 친화성 아가로즈 수지의 10 밀리리터를 추가합니다. 용해성 세포 용해및 수지를 섭씨 4시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 섞어 단백질 결합을 허용합니다.

수지 수지 혼합물을 열린 컬럼에 로드하여 수지수집합니다. 수지 10컬럼 의 세척 버퍼 A로 세척하여 단백질 오염물질을 제거합니다. 밸브를 닫고 두 개의 열 버퍼 A.Next로 수지의 재일시 중단, 희미한 붉은 빛 상태에서, 50 마이크로 몰러의 최종 농도에 재중단 수지에 9 시스 레티날을 추가합니다.

망막 바인딩을 위해 어둠 속에서 4 ~ 16 시간 동안 섭씨 4도에서 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 값을 열고 열에서 버퍼를 제거합니다. 버퍼 A의 20 컬럼 볼륨으로 수지 세척하고 15개의 열 버퍼 B 볼륨을 사용하여 바운드되지 않은 망막을 제거합니다.

버퍼 B의 두 컬럼 볼륨에서 수지들을 다시 한 다음 수지 현탁액을 10 10 밀리리터 처리 열로 균등하게 나눕니다. 10개의 컬럼에서 버퍼를 제거한 다음 세제 변경을 위해 완충 C의 1밀리리터로 각각 수지를 다시 분리합니다. 얼음에 1 시간 동안 배양.

버퍼 C에서 세척 및 인큐베이션을 한 번 더 반복합니다. 열에서 버퍼를 제거한 다음 각 열에 대해 용출 버퍼의 0.8 밀리리터로 수지를 다시 일시 중지합니다. 부드럽게 2 시간 동안 혼합.

각 컬럼에서 튜브로 용출을 수집합니다. 각 열에 대해 용출 버퍼의 0.7 밀리리터에서 수지재를 다시 중단합니다. 1시간 동안 부드럽게 섞습니다.

각 컬럼의 용출을 동일한 튜브로 수집합니다. 어둠 속에서, 석영 cuvette에 배제 된 단백질을로드합니다. 단백질 샘플의 스펙트럼을 측정합니다.

495 나노미터 길이의 패스 필터를 통과하는 가벼운 패스로 2 분 동안 큐벳에서 직접 단백질을 비춥니다. 조명된 샘플의 스펙트럼을 측정합니다. 다른 9개의 세제에서 정제된 모든 단백질 샘플에 대해 동일한 측정을 수행합니다.

어둡고 조명된 상태 모두. 정상 빛 하에서, 각 세제 조건에 대 한 준비 100 진 도 신의 마이크로 리터에서 0.7 밀리 그램 밀리 리터 당 밀리 리터 당 밀리 그램. 희미한 붉은 빛 아래에서, 밀리리터 당 0.7 밀리그램에서 rhodopsin의 혼합물의 100 마이크로 리터를 준비하고 밀리리터 당 0.2 밀리그램에서 미니 GO.

혼합물을 염화 마그네슘 1마리로 보충합니다. 495 나노미터 길이의 패스 필터에서 빛으로 혼합물을 비추고 30 분 동안 배양합니다. 샘플을 자동 샘플러 바이알로 옮기고 샘플 트레이에 배치합니다.

샘플의 77 마이크로리터를 기둥에 적재하고 실행당 SEC 버퍼 25밀리리터를 배출하는 정화기로 각 샘플에 대해 순차적 SEC 실행을 자동화하는 메서드 파일을 프로그래밍합니다. 흡광도는 280 나노미터 및 380 나노미터로 기록합니다. 약 12.9 밀리리터의 유지 볼륨에서 진도 및 진도 미니 GO 단지의 피크 분수를 수집합니다.

왼쪽 진두부시 샘플과 코마시 블루 스테닝을 사용하여 4~12% SDS 의 그라데이션 그라데이션 젤에 rhodopsin-mini-GO 복합체의 피크 분수를 분석합니다. 밀리리터당 1밀리그램에서 200 마이크로리터 의 마이크로리터 혼합물을 준비하고 PNGase F는 밀리리터당 0.01 밀리그램으로 준비합니다. 잘 섞어서 하룻밤 동안 얼음에 배양하십시오.

밀리리터당 1밀리그램에서 200 마이크로리터 의 마이크로리터 혼합물을 준비하고 엔도 F1-13은 밀리리터당 0.01 밀리그램으로 준비합니다. 잘 섞어서 하룻밤 동안 얼음에 배양하십시오. SDS 페이지와 쿠마시 블루 스테인링으로 소화 결과를 분석합니다.

이 연구에서는, 작은 규모의 정제 설정은 추가 분석을 위한 충분한 단백질을 산출했습니다. 진달신의 자외선 눈에 보이는 스펙트럼은 파란색 곡선에 어두운 상태 9-시스 레티날 바운드 rhodopsin을 보여줍니다. 조명 후, 9-cis 망막은 모든 트랜스 망막으로 단백질이 분해되고 이소말리즈입니다.

흡수제 488나노미터 이상 280나노미터의 흡수제 와 흡수제의 비율은 380나노미터에서 흡수제 280나노미터에서 각 세제에서 정제된 로독신의 안정성을 묘사한다. 10가지 세제로 정제된 진도신 및 진도미니-GO 복합체의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일이 여기에 나와 있다. 표준 마커 단백질의 프로파일은 DDM 샘플과 함께 오버레이로 표시됩니다.

DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 및 OGNG에 대한 이상적인 시나리오와 함께 피크 프로파일의 해석이 DMNG에 표시됩니다. OGNG 샘플의 확대 프로파일은 진도선과 진도미니-GO 복합체가 동일한 보존 부피를 피한 것을 보여줍니다. 진도신 미니 고 컴플렉스의 진도선 및 SEC 정제 샘플의 SDS 페이지 분석은 여기에 표시됩니다.

이 수치는 엔도 F1 및 PNGase F 효소를 가진 rhodopsin 탈당의 SDS 페이지 분석을 보여줍니다. 각 개별 세제의 영향이 모호함 없이 명확하게 비교될 수 있도록 체계적인 방법으로 세제 스크리닝을 수행하는 것이 중요합니다. 다양한 양의 단백질의 경우, 열 시프트 분석은 세제가 단백질 안정성에 미치는 영향을 연구하는 데도 사용될 수 있습니다.

이 방법 덕분에 안정적인 단백질 복합체를 준비하고 결국 지오 조립에서 잃어버린 결정 구조를 해결할 수 있습니다. 그것은 GPCR-G 단백질 상호 작용 특이성에 중요한 통찰력을 제공했습니다.