Name: 청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 청색 및 적색 이동 채널로도프신을 이용한 CRACM 기법으로 청각 뇌간의 장거리 신경 회로를 정밀 매핑하는 방법을. ChrimsonR을 활용한 광유전학적 접근으로 신경 연결성과 역학을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 도이치 Forschungsgemeinschaft 연구 펠로우십 (GO 3060/1-1, 프로젝트 번호 401540516, DG) 및 국립 보건 원부 R56 DC016880 (MTR)에 의해 지원되었습니다.

현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다. 이 프로토콜의 모든 절차는 미시간 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 승인되었습니다.
1. 수술 준비
<ol><li>무균 조건에서 수술을 수행합니다. 오토클레이브/수술 전에 모든 수술 도구 및 재료를 소독하십시오. 수술 가운과 마스크를 착용.</li>
	<li>수술 부위를 소독하고(70% 에탄올로 스프레이하고 닦아내고) 멸균 수건 커튼을 놓아 수술 부위를 덮습니다.</li>
	<li>복구 케이지를 준비합니다. 질식의 위험을 제한하기 위해 케이지 침구를 제거하십시오. 가열 패드를 케이지 아래에 놓습니다. 음식과 물 소스를 제공합니다.</li>
	<li>파이펫 풀러에서 나노 인젝터용 유리 모세관을 당깁니다. 당기는 과정 동안 가열 필라멘트의 강렬한 열은 유리 모세관을 살균합니다. 팁을 잘라내거나 끊어 직경 약 5 μm의 개구부를 얻습니다.</li>
	<li>모세관 팁을 약 30° 각도로 경사하여 조직 침투를 개선하고 막힘을 줄입니다. 미네랄 오일로 모세관을 채우고 나노 리터 인젝터에 삽입하십시오.</li>
	<li>원하는 채널로도셉신 인코딩 rAAV의 알리쿼트를 얻고 멸균 PBS를 사용하여 원하는 적시로 희석한다. 참고 : 우리는 혈청형 1 rAAv가 청각 뇌간 핵의 형질 전환에 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 구체적으로, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (청색 광 활성화 채널로돕신) 및 rAAV1.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (적색 이동 채널로도프신), 공개적으로 접근할 수 있는 저장소 및 벡터 코어에서 사용할 수 있음 CRACM 실험에 필요한 채널로도프신의 높은 발현 수준과 양호한 장거리 축색 인신매매를 일관되게 산출합니다.</li>
	<li>멸균 PBS에서 rAAV 1-3 μL로 모세관을 전면 에 필기하기 위해 인젝터 지침을 따르십시오.</li>
</ol>2. 수술
<ol><li>동물을 유도 챔버에 넣고 교정 된 이소플루란 기화기를 통해 전달되는 산소에 3 % 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 호흡이 깊고 느려지고 발가락 핀치 반사가 없을 때까지 마우스를 관찰하십시오(약 3-5분).</li>
	<li>동물을 입체적 프레임으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김 가스 마취 마스크가 있는 구개 바에 입을 대고 두 외이도에 비천복이 있는 이어 바를 배치하여 동물의 머리를 고정시하십시오.</li>
	<li>직장 온도 프로브를 삽입하고 항상성 온도 컨트롤러를 켭타.</li>
	<li>안과 연고를 바르면 눈이 마르지 않도록 하십시오.</li>
	<li>선제 진통제 (예를 들어, 5 mg / kg 카프로펜의 피하 주사)를 투여하십시오.</li>
	<li>마취 상태의 깊이에 따라 이소플루란을 1-2.5%로 조정합니다. 시술 중 적어도 15분마다 점막의 온도, 호흡 및 색상을 모니터링합니다.</li>
	<li>전기 클리퍼로 두피를 면도하십시오. 포비동 요오드와 70% 에탄올의 세 번갈아 면봉으로 두피를 무균적으로 준비합니다.</li>
	<li>귀 사이를 시작하여 눈에 로스트랄을 계속하여 람다와 bregma 봉합사를 노출시킴을 따라 두피에 절개를 하십시오. 피부를 옆으로 밀어 내고 필요한 경우 노출된 뼈에서 골막을 제거합니다.</li>
	<li>멸균 수술 마커로 람다 봉합사를 표시하고 나노 인젝터의 끝을 배치하여 람다만 만지고 미세 조작자 좌표를 0으로 설정합니다. 나노 인젝터 팁과 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 람다 봉합사와 bregma 봉합사 사이의 고도 차이를 측정하십시오. 입천장 바 높이를 조정하여 람다와 브레그마를 ± 100 μm 높이 차이로 가져옵니다.</li>
	<li>나노 인젝터 팁 및 마이크로 매니더레이터 좌표계를 사용하여 사출 부위를 매핑하고 멸균 수술 마커로 부위를 표시합니다. P21-P30 마우스의 IC 또는 DCN을 주입하려면 표 1과같이 람다 봉합사를 기준으로 좌표를 사용하십시오. 좌표의 Z 깊이는 람다의 두개골 표면에서 측정됩니다.</li>
	<li>멸균 0.5mm 드릴 버가 있는 마이크로모터 드릴을 사용하여 사출 부위에 개두술을 수행합니다.</li>
	<li>표적 핵에 있는 뉴런의 광범위한 형질침입을 보장하기 위하여, 조직으로 각종 깊이에서 주사를 합니다(표 1,Z 좌표), IC같이 더 큰 두뇌 지구의 경우에, 다른 X와 Y 좌표에 있는 2개 이상의 침투의 과정을 통해 주사를 합니다(표 1,오른쪽 IC 침투 1 및 오른쪽 IC 침투 2).</li>
	<li>주사를 수행합니다. IC 주사의 경우, 2,250 μm와 1,750 μm 깊이 사이의 Z 축 (주입 깊이)을 따라 250 μm 간격으로 20 nL의 바이러스를 침전시 입힙니다. DCN 주사의 경우, 각각 4,750 μm 및 4,550 μm의 깊이에서 20 nL의 바이러스를 증착합니다.</li>
	<li>각 Z 좌표에 주입한 후 인젝터를 다음 Z 좌표로 이동하기 전에 2-3분 정도 기다립니다. 이렇게 하면 바이러스가 주사 부위에서 멀리 확산되어 나노 인젝터가 재배치될 때 바이러스가 주사 관으로 빨려 들어올 확률을 줄입니다.</li>
	<li>침투에 마지막 주입 후, 대기 3-5 두뇌에서 나노 인젝터를 철회 하기 전에 분.</li>
	<li>나노 인젝터가 침투와 동물 사이의 뇌에서 제거되면 팁에서 소량의 바이러스를 꺼내 팁이 막히지 않은지 확인하십시오.</li>
	<li>주사 후 멸균 된 PBS를 사용하여 두피의 절단 된 가장자리를 적신 다음 피부를 중간 선으로 부드럽게 이동하십시오. 6-0 (0.7 미터미터) 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 상처를 닫습니다.</li>
	<li>상처에 2 % 리도카인 젤0.5-1 mL을 적용하십시오.</li>
	<li>이어 바와 온도 프로브를 제거하고, 이소플루란을 끄고, 구개 바에서 마우스를 제거하고 복구 케이지로 옮김을 옮니다.</li>
	<li>복구를 면밀히 모니터링합니다. 동물이 완전히 깨어 나고, 움직이고, 통증이나 고통의 흔적을 보이지 않는 경우, 케이지로 다시 옮기고 케이지를 사육장으로 되돌릴 수 있습니다.</li>
	<li>수술이 하루에 여러 동물에 수행 될 경우, 수술 도구를 살균하고 다음 수술 전에 드릴 버를 뜨거운 비드 소독기를 사용합니다.</li>
</ol>3. 외과 후속 조치
<ol><li>다음 10일 동안 상처 폐쇄, 감염 또는 통증이나 고통의 징후가 있는지 매일 동물을 검사하여 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.</li>
	<li>실험에서 동물을 사용하기 전에 3-4 주를 기다려 채널로도프신의 최적의 발현을 허용하십시오.</li>
</ol>4. 두뇌 슬라이스 준비 및 주입 대상의 확인
<ol><li>CRACM의 경우, 표준 체외 전기생리학 실험에서 형질감염된 동물로부터 급성 준비된 뇌 슬라이스를 사용하며, 여기서 는 간략하게 설명된다(자세한설명27에대한 Goyer et al. 2019 참조).</li>
	<li>(mM에서) 포함하는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 준비하십시오 : 125 NaCl, 12.5 D-포도당, 25 NaHCO3,3 KCl, 1.25 NaH2PO4,1.5 CaCl2,1 MgSO4. 버블 ACSF는 7.4의 pH로 5%CO2를 95%O2로한다.</li>
	<li>채널로독신의 활성화를 제한하기 위해 거의 어둠 또는 붉은 빛에서 시험관 내 전기 생리학을 포함한 모든 다음 단계를 수행합니다.</li>
	<li>깊이 이소플루란으로 마우스를 마취하고 신속하게 참수. ~ 34 °C ACSF에서 뇌를 빠르게 해부하십시오.</li>
	<li>IC를 함유한 관상동맥 슬라이스(200-250 μm)를 진동 마이크로토메로 ~34°CACSF로 절단하고, ACSF로 채워진 홀딩 챔버에서 30분 동안 34°C에서 슬라이스를 배양하여 95%O2에서5%CO2로 버블링하였다. 배양 후, 기록에 사용될 때까지 실온에서 슬라이스를 저장합니다.</li>
	<li>주사 대상이 IC가 아닌 경우, 주입된 뇌 영역의 추가 관상 동맥 조각을 절단하고 형광 현미경 하에서 표적 핵의 형질변형을 확인한다. 표적 핵에 형질감염이 없거나 다른 뇌 영역에서 추가형형이 없다면 실험을 계속하지 마십시오.</li>
</ol>5. 체외 녹음 및 CRACM 실험
참고: 크로노스와 ChrimsonR의 광학 자극을 제공하기 위해 현미경의 에피플루오레전 포트에 결합된 LED를 사용합니다. 그러나 레이저는 LED 대신 사용할 수 있습니다. 레이저를 사용 하는 경우, 기관 안전 관계자로부터 사전 승인을 얻고 안전한 레이저 사용에 대 한 적절 한 지침을 따르십시오.
<ol><li>보로실리케이트 유리에서 3.5-4.5 MΩ의 저항으로 전극을 당깁니다. 전극 내부 용액은 (mM) 포함해야합니다 : 115 K-글루코네이트, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 포스포크크레아틴, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 0.1% 바이오시틴(w/v),pH는 KOH와 290 mosm/kg으로 7.3으로 조정되었습니다.</li>
	<li>레코딩하려면 표준 패치 클램프 방법을 사용하십시오. 고정 된 단계 직립 현미경 아래에 기록 챔버에 슬라이스를 놓고 지속적으로 ~ 2 mL / min에서 ACSF와 함께 침전. 생리 적 온도 근처 기록을 실시 (~ 34-36 °C).</li>
	<li>적절한 패치 클램프 앰프를 사용하여 시각적 제어 하에 뉴런을 패치합니다. 계열 저항, 파이펫 정전 용량 및 액체 접합 전위가 정확합니다.</li>
	<li>전체 셀 레코딩 중에 시판되는 LED를 통해 580 nm 빛의 짧은 펄스(1-5ms)의 470nm 빛 또는 ChrimsonR을 전달하여 크로노를 활성화합니다. opsin 활성화의 임계값을 결정하고 포스트 내피 전위를 유도하기 위해 최소한의 자극 프로토콜을 사용합니다. 일반적으로 PSP를 유도하는 최단 자극 지속 시간을 사용하고 PSP를 유도하는 데 필요한 임계 전력의 120%로 광학 전력을 설정합니다.</li>
	<li>막 전위에 기록된 변경이 실제로 뉴런에 시냅스 입력인것을 확인하기 위하여는, 흥분성/억제 성 후약 수용체를 위한 표준 길항제는 실험 도중에 세척될 수 있습니다. PSP에 다른 수용체 기여도를 조사하기 위해 (예를 들어 NMDA 대 AMPA 수용체), 적합한 수용체 길항제는 세척될 수 있다. 각 수용 체 길 항 제에 대 한, 약물 효과 세척 후 반전 한다.</li>
	<li>PSP의 대기 시간, 지터 및 신뢰성을 사용하여 중간에 채널로도신 을 발현하는 시냅스의 활성화와는 달리, 기록된 뉴런에 대한 시냅스의 직접적이고 광학적인 활성화에서 비롯된 광시냅스 입력이 발생한다는 것을 확인합니다. 기록 된 뉴런에 시냅스 뉴런. 일반적으로 낮은 대기 시간(&2ms), 낮은 지터(&1 ms 표준 대기 시간 편차), 높은 신뢰성(>50%) 기록된 뉴런에 시냅스 전 뉴런을 발현하는 채널로덕신으로부터 직접 시냅스 연결을 나타낸다.</li>
</ol>

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<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
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<li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 CRACM이 마우스 IC에 있는 뉴런에 장거리 시냅스 입력을 확인하고 특성화하기 위한 강력한 기술이다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 DCN 및 IC에서 뉴런의 강력한 트랜스펙션뿐만 아니라 IC의 시냅스 터미널에 크로노스와 ChrimsonR의 신뢰할 수있는 축산 인신 매매를 달성했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 PSP 진폭, 하프 폭, 부패 시간 및 수용체 약리학을 포함하여 포스트나피 사건의 측정 그리고 분석을 가능하게 한다는 것을 설명했습니다. 우리의 경험은 이 접근이 청각 뇌간 및 그 너머에 걸쳐 기능적인 회로 매핑 실험을 능력을 발휘하기 위하여 쉽게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.
전반적으로, 광유전학 회로 매핑의 특이성은 축색의 전기 자극에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 바이러스성 형질감염은 시냅스 전 뉴런의 표적 집단에 채널로도인의 발현을 공간적으로 그리고 분자적으로 제한하는 기능을 제공한다. 대조적으로, 전기 자극...

시냅스 연결은 신경 회로 기능에 매우 중요하지만, 신경 회로 내의 시냅스의 정확한 토폴로지와 생리학은 종종 실험적으로 조사하기가 어렵습니다. 이는 세포 전기 생리학의 전통적인 도구인 전기 자극이 자극 부위 근처의 축사를 무차별적으로 활성화하고 대부분의 뇌 영역에서 다른 소스(로컬, 오름차순 및/또는 내림차순)의 축축을 서로 연결하기 때문입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)1,2를사용하여, 이러한 제한은 이제3을극복 할 수있다 . 채널로도셉신(ChR2)은 원래 녹색 조류 클라미도모나스 린하르트티에서발견되는 광 활성화, 양이온 선택적 이온 채널이다. ChR2는 450-490 nm 의 파장의 청색광에 의해 활성화될 수 있으며, 양이온 유입을 통해 세포를 탈분극화할 수 있다. ChR2는 먼저 나겔과 동료4에의해 제노푸스 oocytes에서 설명하고 표현되었다. 그 직후, Boyden과 동료5 포유류 뉴런에서 ChR2를 표현하고 그들이 안정적으로 밀리 초 타임 스케일에 스파이크를 제어하는 광 펄스를 사용할 수 있음을 보여 주었다, 블루 라이트와 ChR2의 활성화 후 ~ 10 ms 행동 전위를 유도. 더 빠른 역학을 가진 광유전학 채널은 최근에 발견되었습니다 (예를 들어, 크로노스6).
CRACM 실험에 대한 기본적인 접근법은 채널로도프신에 대한 유전 정보를 전달하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)로 가설전전 시냅스 뉴런의 집단을 트랜스펙트하는 것이다. rAAV를 가진 뉴런의 형질감염은 인코딩된 채널로도프신의 발현을 이끈다. 전형적으로, 채널로집신은 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 tdTomato (적색 형광 단백질) 같이 형광 단백질로 꼬리표를 붙입니다, 그래서 표적 지구에 있는 신경의 형질감염은 형광 화상 진찰로 쉽게 확인될 수 있습니다. rAAV는 비병원성이기 때문에, 낮은 염증 전위 및 오래 지속되는 유전자발현7,8,그들은 뉴런에 채널로도신을 전달하는 표준 기술이 되었다. 만약, 뉴런의 시냅스 전 형질전환 후, 빛 깜박임을 통한 채널로도냅신의 활성화가 표적 뉴런의 후통 전위 또는 전류를 유도하는 경우, 이것은 형질전환된 핵에서 기록된 세포로의 축삭 연결의 증거이다. 뇌 슬라이스 실험에서 절단 된 축삭은 channelrhodopsin 활성화를 통해 신경 전달 물질을 방출하도록 구동 될 수 있기 때문에, 급성 슬라이스의 외부에 놓여 있지만 후시 냅스 뇌 영역으로 축삭을 보내는 핵은 CRACM으로 식별 할 수 있습니다. 이 기술의 힘은 확인 된 장거리 시 냅 스 입력의 연결 및 생리 직접 조사 될 수 있다.
청색광에 의해 흥분되는 channelrhodopsins 이외에, 조사자는 최근에 Chrimson및 그것의 더 빠른 아날로그 ChrimsonR를 포함하여 몇몇 적색 이동 채널로도실9,10를확인했습니다, 둘 다 ~ 660 nm6의빨간 빛으로 흥분됩니다. 적색시프트 옵신은 청색광보다 조직에 더 잘 침투하기 때문에 관심의, 적색광은청색광(10,11,12)보다세포독성이 낮을 수 있다. 적색 이동 채널러도프신은 또한 동일한 뉴런상에 상이한 핵으로부터 축세포의 수렴이 하나의실험6,13,14에서시험될 수 있는 이중색 CRACM 실험의 가능성을 열어주어있다. 그러나, 현재 적색 이동 opsins 종종 블루 라이트와 원치 않는 교차 활성화를 전시15,16,17,두 가지 색상 실험을 어렵게 만들기. 또한, 일부 보고서는 ChrimsonR이 제한된 축산 인신 매매를 겪고 있음을 지적했으며, 이는 CRACM 실험16,17에ChrimsonR을 사용하기가 어려울 수 있습니다.
하부 청각 뇌간 핵에서 거의 모든 오름차순 예측은 열등한 콜리큘러스 (IC)에 수렴, 중앙 청각 통로의 중뇌 허브. 이는 달팽이관 핵(CN)18,19,대부분의 우수한 올리바리 복합체(SOC)20,및 측면 lemniscus21의등쪽(DNLL) 및 복부(VNLL) 핵으로부터의 투영을 포함한다. 부가적으로, 청각 피질로부터의 큰 내림차순 투영은 IC18,19,20,21,22,및 IC 뉴런 자체가 IC23의국소 및 반대측 엽 내에서 광범위하게 시냅스로 종료된다. 많은 소스에서 축색의 혼합은 전기 자극(24)을사용하여 IC 회로를 프로브하기 어렵게했다. 그 결과, IC 내의 뉴런들이 건전한 국소화 및 음성 및 기타 통신소리의 식별에 중요한 계산을 수행하더라도25,26,IC 내의 신경 회로의 조직은 크게 알려지지 않았다. 우리는 최근에 IC27에있는 첫번째 분자로 식별가능한 뉴런 으로 VIP 뉴런을 확인했습니다. VIP 뉴런은 청각 시상및 우수한 콜리큘러스를 포함한 여러 장거리 표적에 투영되는 글루타마테르이트 성세포 뉴런이다. 이제 VIP 뉴런에 대한 로컬 및 장거리 입력의 소스와 기능을 결정하고 이러한 회로 연결이 사운드 처리에 어떻게 기여하는지 확인할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 마우스의 IC에서 VIP 뉴런에 대한 시냅스 입력을 조사하기 위해, 특히 반대쪽 IC 및 DCN(그림1)에서맞춤화된다. 프로토콜은 입력의 다른 근원, 다른 신경 모형 또는 전부 다른 두뇌 지구에 쉽게 적응될 수 있습니다. 우리는 또한 ChrimsonR청각 뇌간에서 장거리 회로 매핑을위한 효과적인 적색 이동 채널로도프신임을 보여줍니다. 그러나 ChrimsonR은 낮은 강도에서도 청색광에 의해 강력하게 활성화되어 있으므로 ChrimsonR과 크로노스를 2가지 색상의 CRACM 실험에서 결합하기 위해서는 ChrimsonR의 교차 활성화를 방지하기 위해 신중한 컨트롤을 사용해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>AAV1입니다. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td><td>애드진</td><td>59171-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Addgene</td><td>59170-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>Ai14 리포터 마우스(B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J)</td> <td>Jackson Laboratory</td><td>stock # 007914</td><td></td></tr><tr><td>호박색 (590nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LED</td><td>SP-01-A8</td><td></td></tr><tr><td>블루 (470nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LED</td><td>SP-01-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carproject (carprofen)</td> <td>Henry Schein Animal Health</td><td>59149</td><td></td></tr><tr><td>Drummond glas 모세관</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject 3</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-300-207</td><td></td></tr><tr><td>전극 베벨러</td><td>셔터 기기</td><td>FG-BV10-D</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 6-0(0.8 미터법) 나일론 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>지역 약국</td><td></td></tr><tr><td>고정 무대 현미경</td><td>모든</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>가스 마취 헤드 홀더</td><td>David Kopf 기구</td><td>933-B</td><td></td></tr><tr><td>일반 수술 도구</td><td>정밀 과학 도구</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Golden A5 애완 동물 클리퍼</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>사용자 정의 빌드</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>진공 시스템 포함 후드 유도 챔버</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917760</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기 Steri 250</td><td>Inotech</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>요오드 용액 10%</td><td>MedChoice</td><td>지역 약국</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>Patterson Scientific</td><td>07-8703592</td><td></td></tr><tr><td>리도카인 국소 젤리 2%</td><td>Akorn</td><td>현지 약국</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 모터 드릴 1050</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>7094351</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 모터 드릴 비트 0.5mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>전동 Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/R</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고 인공 눈물</td><td>Akorn</td><td>지역 약국</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 전극 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기 포함 데이터 수집 소프트웨어</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 마취기</td><td>Patterson Scientific</td><td>07-8914724</td><td></td></tr><tr><td>소동물 스테로택시 프레임</td><td>David Kopf Instruments</td><td>930-B</td><td></td></tr><tr><td>표준 화학 물질</td><td>현지 공급업체</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>표준 이미징 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 수건 드레이프</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>수술 마커</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>사용자 정의 빌드</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VIP-IRES-Cre 마우스 (Viptm1(cre)Zjh/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock #010908</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

신경 회로를 조사할 때, 시험관 내 패치 클램프 접근법의 표준 제한은 여러 소스의 축슨이 종종 혼합되어 전기 자극을 가진 개별 소스로부터 입력을 분리하는 것을 어렵게 만드는 것입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)을 사용하여, 이러한 한계는 이제 극복 할 수있다. 여기에서, 우리는 낮은 청각 뇌간 핵및 commissural 입력에서 청각 시스템의 중간 뇌 핵인 열등한 콜리큘러스 (IC)에 있는 신경의 확인된 부류에 오름차순 입력을 지도로 하기 위하여 CRACM를 이용하는 방법을 보고합니다. IC에서, 로컬, 커미션, 오름차순 및 내림차순 축색은 무겁게 얽혀 있고 따라서 전기 자극과 구별할 수 없습니다. 시냅스 핵에서 채널로덕신의 발현을 유도하기 위해 바이러스 성 구조를 주입하고, 패치 클램프 기록을 이어서 채널로도셉신 발현 시냅스 입력, 특정 소스로부터의 프로젝션의 존재 및 생리학을 특성화한다. IC 뉴런의 특정 집단에 세포 유형별 정확도로 매핑될 수 있다. 이 접근법은 청색 광 활성화 채널러도셉신인 크로노스와 적색 채널로도이프신인 ChrimsonR과 함께 작동한다는 것을 보여줍니다. 전뇌의 이전 보고서와는 달리, 우리는 ChrimsonR이 등지 달팽이관 핵 주요 뉴런의 축축을 강력하게 인신 매매하고 있음을 발견하며, 이는 ChrimsonR이 뇌간 CRACM 실험에 유용한 도구가 될 수 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 쥐의 등쪽 달팽이관 핵 및 IC에 주사를 표적으로 하는 입체 좌표를 포함하여 두개내 바이러스 주사 수술에 대한 자세한 설명과 전체 세포 패치 클램프 기록을 결합하는 방법 등이 포함되어 있습니다. IC 뉴런에 대한 장거리 프로젝션을 조사하기 위해 채널로도셉신 활성화를 통해 이 프로토콜은 IC에 청각 입력을 특성화하는 데 맞춤화되어 있지만, 청각 뇌간 및 그 너머의 다른 장거리 예측을 조사하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

우리는 VIP-IRES-Cre 마우스(VIPtm1 (cre)Zjh/J)와 Ai14 Cre-리포터 마우스 (B6)를 교차했습니다. CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)는VIP 뉴런이 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 F1 자손을 생성한다. 어느 성별의 F1 자손이 사용되었고, 산후일(P) 21 에서 P70으로 사용되었다. 이 연구에서는 총 22마리의 동물이 사용되었습니다.
AAV1의 입체 주입. 표 1에 나타낸 좌표를 사용하여 VIP-IRES-Cre x Ai14 마우스의 오른쪽 IC에 Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH가 오른쪽 IC에서 강한 크로노스-EGFP 발현을 초래하였다(도<strong class="xfig"...

Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

채널로독신 지원 회로 매핑은 장거리 신경 프로젝션의 기능적 매핑을 위한 정밀 기술입니다. 여기에서, 우리는 청각 두뇌 줄기에 있는 회로를 조사하기 위하여 이 접근을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 슬라이스에서 여러 소스의 축축이 혼합되어 전기 자극을 사용하여 개별 입력을 분리하기가 어렵습니다.CRACM을 사용하면 이러한 제한을 극복할 수 있습니다. lambda를 찾고 지속적으로 스테레오탁스 좌표 시스템을 정의하는 것은 절차의 지속 시간을 짧게 유지하는 것처럼 어렵습니다. 모든 단계를 신중하게 매핑하면 성공률이 높아집니다.먼저 수술 부위를 70%에탄올로 분사하여 살균 할 수 있도록 수건 커튼을 배치하여 수술 부위를 덮습니다. 케이지 침구를 제거하여 복구 케이지에서 질식의 위험을 제한합니다. 다음으로, 케이지 아래에 난방 패드를 넣고 음식과 수원을 제공합니다.다음으로, 동물을 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 마취를 계속합니다. 직장 온도 프로브를 삽입하고 동종 온도 컨트롤러를 켭타코전환합니다. 그런 다음 안과 연고를 적용하여 눈이 건조되는 것을 방지하십시오.선제적 진통제를 투여합니다. 마지막으로, 전기 클리퍼와 두피를 면도. 포비도네 요오드3개와 70%에탄올로 두피를 소독합니다.중간선을 따라 두피에 절개를 하고, 귀사이를 시작하고 눈에 장밋빛을 계속시켜 람다와 브레그마 봉합사를 노출시켜 수술을 시작합니다. 피부에 옆으로 밀어 내고 필요한 경우 노출된 뼈에서 골라기질을 제거합니다. 다음으로, 램다 봉합사를 외과 마커로 표시하고, 나노 인젝터의 끝을 배치하여 람다만 만지고 마이크로 조작기 좌표를 0으로 설정합니다.나노 인젝터 팁과 미세 조작기를 사용하여 람다와 브레그마 봉합사 사이의 표고 차이를 측정합니다. 팔레트 바 높이를 조정하여 람다와 브레그마를 플러스 또는 마이너스 100 마이크로미터 높이 차이로 가져옵니다. 나노 인젝터 팁 및 미세 조작기 좌표 시스템을 사용하여 사출 부위를 매핑하고 수술 마커로 사이트를 표시합니다.그런 다음 0.5밀리미터 드릴 버가 있는 마이크로모터 드릴을 사용하여 주사 부위에 두개골 절제술을 수행합니다. 표적 핵에서 뉴런의 광범위한 침투를 보장하기 위해 나노 인젝터를 사용하여 조직의 다양한 깊이에서 주사를 만들고 열등한 콜리큘러스와 같은 더 큰 뇌 영역의 경우 다른 X 및 Y 좌표에서 두 개 이상의 침투를 통해 주사를 만듭니다. 열등한 콜리큘러스를 주입하려면 2, 250 마이크로미터 와 1, 750 마이크로미터 깊이 사이의 Z 축을 따라 250 마이크로미터의 간격으로 20 나노리터의 바이러스를 증착하십시오.등쪽 달팽이관 핵에 주사를 대 한, 예금 20 나노 리터의 깊이4, 750 마이크로 미터 와 4, 550 마이크로 미터 각각. 각 Z 좌표에 주입 한 후, 바이러스가 주입 부위에서 확산 될 수있는 시간을 허용하기 위해 다음 Z 좌표로 인젝터를 이동하기 전에 2 ~ 3 분 기다린 후, 나노 인젝터가 재배치 될 때 바이러스가 주사 기관을 빨아 질 확률을 감소. 그런 다음 마지막 주사 후 뇌에서 나노 인젝터를 철회하기 전에 3 ~5 분 정도 기다립니다.나노 인젝터가 침투와 동물 사이의 뇌에서 제거되면 팁이 막히지 않은지 확인하기 위해 팁에서 소량의 바이러스를 배출합니다. 주사 후 멸균 PBS를 사용하여 두피의 절단 된 가장자리를 적신 다음 피부를 미드 라인쪽으로 부드럽게 움직입니다. 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 상처를 닫습니다.그런 다음 상처에 2 %리도카인 젤리의 1 밀리리터에 0.5를 적용하십시오. 이어 바 및 온도 프로브를 제거하고 이소플루란을 돌리고 팔레트 바에서 동물을 제거하고 복구 케이지로 옮습니다. 마지막으로 복구를 면밀히 모니터링합니다.동물이 완전히 깨어 나고, 움직이고, 고통이나 고통의 흔적을 보이지 않고, 케이지로 다시 옮기고 케이지를 비바리움으로 되돌리십시오. 표준 패치 클램프 메서드를 사용하여 레코딩을 만듭니다. 먼저 고정 된 단계 직립 현미경 의 밑에 기록 챔버에 슬라이스를 배치하고 분당 2 밀리리터에서 인공 뇌척수액으로 지속적으로 교감하십시오.다음으로, 적절한 패치 클램프 증폭기사용으로 시각적 제어 하에 뉴런을 패치한다. 마지막으로, 도매 녹음 중에 시판되는 LED를 통해 580나노미터 광의 짧은 펄스로 470나노미터 광 또는 ChrimsonR의 짧은 펄스를 제공함으로써 크로노를 활성화합니다. 결과는 ChrimsonR 주입이 세포와 섬유에서 보이는 tdTomato 형광을 가진 DCN에 있는 강한 발현으로 이끌어 낸다는 것을 표시했습니다.반대로 ICC에서는, tdTomato로 강하게 표지된 섬유는 청각 두뇌 줄기 핵에 주입될 때 ChrimsonR-tdTomato 구조물의 장거리 인신 매매 능력을 보여주는 3 주 후에 명확하게 보였습니다. ChrimsonR의 광학 활성화는 IC VIP 뉴런에서 EPSP를 유도하여, 실험 파라미터가 청색광 대신 적색광사용을 요구할 때 ChrimsonR이 장거리 CRACM 실험을 위한 유용한 도구임을 나타냅니다. 그러나 ChrimsonR이 블루 라이트로 쉽게 활성화되어 크로노스와 동일한 청색광 활성화임계값을 표시하는 것으로 나타났습니다.이 프로토콜의 경우 입체 좌표가 올바른지 확인하고 바이러스가 대상 뇌 영역에서만 표현되었는지 확인하는 것이 가장 중요합니다. 크로노스 ChrimsonR viroconstruct을 다른 바이러스와 교환함으로써, 예를 들어, 세포 특정 플렉스 바이러스, 수술 프로토콜을 변경하지 않고 여러 해부학적 또는 생리적 질문에 대답할 수 있다.

long-range-channelrhodopsin-assisted-circuit-mapping-inferior

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

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유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

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의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

이 기사에서는 HEK293 세포를 사용한 전기생리학적 전체 세포 패치 클램프 기록으로 채널로돕신의 이온 선택도를 측정하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 음이온 선택성 채널로돕신의 염화물 선택성을 조사하기 위한 실험 절차를 설명합니다. 그러나 이 절차는 뚜렷한 선택성을 가진 다른 채널로돕신으로 이전할 수 있습니다.

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