Name: 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화 방법을. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학 연구에서 에탄올 약동학을 신속하고 재현 가능하게 측정할 수 있게 합니다.

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이 문서에 제시된 연구는 J.K.E에 국립 보건원/국립 치과 및 두개안면 연구 (NIH/NIDCR) R01DE020884에서 이전 교부금에 의해 지원되었습니다. 그리고 알코올 남용 및 알코올 중독에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 (NIH / NIAAA) F32AA021320 C.B.L.에 알코올 남용에 대한 국립 보건 원 / 국립 연구소의 현재 보조금에 의해 (NIH / NIAAA) R00AA023560 에 C.B.L. 우리는 가스 크로마토그래프 분석을 제공하고 지원해 준 Rueben Gonzales에게 감사드립니다. 티아나 온티베로스와 지나 노블스 박사의 글쓰기 지원에 감사드립니다.

이 절차에 사용된 모든 제브라피시 배아는 확립된 IACUC 프로토콜27에따라 사육및 사육되었다. 이 프로토콜은 오스틴텍사스 대학과 루이빌 대학에 의해 승인되었습니다.
참고: 제브라피쉬 라인 Tg(fli1:EGFP)y1은 본 연구에서 사용하였다28. 이 절차에 사용되는 모든 물은 멸균 역삼투수입니다. 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 v8.2.1을 사용하여 수행되었다.
1. 배아 미디어 만들기
<ol><li>배아 매체의 20x 스톡을 만들기 위해, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, CaCl2,K2HPO4의0.41 g, NA2HPO4의0.142 g, MgSO4·7H2O의4.9 g을 물 1L에 용해한다. 형성하는 백색 침전을 무시하십시오. 이는 미디어에 영향을 미치지 않습니다. 필터는 스톡 용액을 살균하고 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>작업 배아 매질 용액을 만들기 위해, 20x 배아 매물 스톡의 1 L에 NaHCO3의 1.2 g을 용해시키고 19 L의 물을 첨가합니다. 28°C에서 작업 배아 용액을 유지한다.</li>
</ol>2. 물 변위를 사용하여 배아 부피 측정
참고: 이 프로토콜에서는 24시간 후 유추(hpf) 배아(그림1)가사용된다. 부피 측정에 사용되는 배아는 에탄올 분석에 사용되지 않는다.
<ol><li>1.5 mL 미세원원지 튜브에 10개의 배아 및 엑스트라배아액을 250 μL의 부피로 표시하였다(그림2A). 250 μL 충진 라인에 물을 추가합니다(그림 2B의염색된 물이 있는 샘플 참조).</li>
	<li>2.1단계를 반복하여 조리를 제거한 배아에 대한 리셉터클을 설정합니다.<ol>
<li>융모를 제거하려면 배아를 100mm 페트리 접시에 실온(RT)에서 배아 매체에 2 mg/mL의 프로테아제 칵테일을 10분 동안 놓습니다. 몇 분마다 배아를 부드럽게 돌리면 융기를 깨십시오.</li>
		<li>모든 배아가 그들의 융모가 없는 후에, 프로테아제 칵테일/배아 매체에서 dechorionated 배아를 제거하고 배아를 세척하기 위하여 신선한 배아 매체를 가진 새로운 100 mm 페트리 접시에 두는. 이 세척 단계를 1번 더 반복합니다(총 2회 세척). 배아를 신선한 100mm 페트리 접시로 옮김.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가능한 가장 작은 팁을 사용하여 배아를 손상시키지 않고 p200 마이크로 피펫(그림 2C)을사용하여 배아 주위의 모든 액체를 조심스럽게 제거하고 &lt;0.1 mg의 정밀도로 물 무게를 측정합니다. 10개의 배아 샘플의 부피를 확인하려면 250 μL에서 제거된 물의 무게/부피(물 1 mL = 물 1g)를 뺍니다. 단일 배아의 부피를 결정하기 위해 250 μL의 차이와 제거된 물의 무게를 10으로 나눕니다.</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg">
3. 배아를 에탄올로 치료
<ol><li>결합 탱크에서 배아를 수집하고 표준 100mm 페트리 접시에 배치합니다. 단일 페트리 접시당 100개 이하의 배아를 계산하고 28.5°C에서 배양합니다. 참고 : 융기를 제거하려면 (단계 2.2), 에탄올을 추가하기 전에 제거해야합니다.</li>
	<li>6 hpf에서 배아 또는 배아 매체 + 1 % 에탄올 (v / v)를 사용하여 새로운 표준 100mm 페트리 접시에 최대 100 개의 배아를 추가하십시오. 뚜껑을 덮되 되 고 페트리 접시를 밀봉 하지 마십시오. 배아를 18시간 동안 28.5°C로 설정된 저온 인큐베이터에 놓거나, 또는 배아가 24 hpf의 발달 시점에 도달할 때까지.</li>
</ol>4. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 위해 배아를 처리하기 전에 워크플로우 준비
<ol><li>모든 단백질을 변성시키고 에탄올 대사를 방지하기 위해 5 M NaCl을 물에서 (샘플 튜브 당 450 μL이 필요합니다)의 용액을 만듭니다. 배아 매체에서 2 mg/mL의 농도로 프로테아제 칵테일(재료표)을만듭니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브와 2 mL 가스 크로마토그래프 바이알을 라벨로 지정합니다. 아래에 설명된 에탄올 표준뿐만 아니라 공기, 물 및 5M NaCl/프로테아제 칵테일 블랭크에 대해 2mL 가스 크로마토그래프 바이알을 추가로 라벨링합니다.</li>
	<li>3개의 p200 마이크로피클러를 50 μL로 2개 세트, 제3 세트는 200 μL로 설정; p1000 마이크로파이터는 450 μL로 설정하고 p2 마이크로피펫터는 2 μL로 설정합니다. 페트리 접시에서 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 배아를 옮기는 데 사용되는 유리 파이펫의 경우, 파이펫 팁을 불꽃을 통해 빠르게 통과하여 파이펫을 파이펫으로 끌어올 때 배아를 손상시키지 않도록 가장자리를 부드럽게 합니다.</li>
</ol>5. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피용 배아 처리
참고 : 그들의 chorions에 있는 태아 및 그들의 chorions에서 이전에 제거된 그 둘 다 희석 요인의 계산에 있는 일관성을 위해 동일하게 취급됩니다.
<ol><li>50 μL로 설정된 두 개의 p200 마이크로피펫을 사용하여 프로테아제 칵테일 용액 50 μL을 하나로 끌어내고 50 μL의 물을 두 번째로 그립니다.</li>
	<li>유리 파이펫 및 마이크로파이터를 사용하여, 1.5 mL 미세원심지 튜브에 10개의 배아(단계 3.2로부터)를 신속하게 배치하고 캡을 닫는다(도 2A에설명된 대로). 모든 시료를 검사, 대조군 및 에탄올 처리배아에 대해 반복한다.</li>
	<li>p200 마이크로파이터 세트를 200 μL로 설정하여, 캡을 빠르게 열고 모든 잔류 배아 매체를 제거한다(도 2C에설명된 대로). 50 μL의 물을 함유한 파이펫을 튜브에 빠르게 넣고 (배아를 손상시키지 않도록) 부드럽게 추가한 다음 물을 제거합니다. 대기 파이펫터에서 프로테아제 칵테일 용액의 50 μL을 신속하게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2D). 참고: 이 프로세스는 한 번에 하나의 샘플을 수행합니다.</li>
	<li>프로테아제 칵테일이 코리온을 저하시킬 수 있도록 샘플을 RT에 10분 동안 앉게 합니다. 그런 다음 5 M NaCl의 450 μL을 신속하게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2E). 10 분 동안 샘플을 소용돌이. 공정 속도를 높이려면 믹서를 동시에 여러 샘플을 소용돌이로 설정합니다. 참고: 실리카 비드 혼합물(2사이즈, 0.5mm 및 1mm 비드)의 소량(~100 μL)을 24hpf 이상의 배아가 있는 튜브에 추가합니다. 오래된 배아에서는, notochord는 균질화되는 기간에 관계없이 그대로 유지됩니다.</li>
	<li>10 분 동안 균질화 한 후, 균질화 된 배아 상판제 2 μL을 신속하게 제거하고 가스 크로마토 그래피 바이알을 첨가하십시오. 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 바이알을 빠르게 밀봉합니다.</li>
</ol>6. 미디어 및 에탄올 표준 준비
<ol><li>미디어 표준을 준비하려면 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액으로 미디어를 10배 씩 희석합니다. 각 시료의 2 μL을 가스 크로마토그래프 바이알에 넣고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.</li>
	<li>에탄올 표준을 준비하려면 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 mM의 농도로 5 M NaCl/protease 칵테일 용액에 100% 에탄올의 직렬 희석을 만듭니다. 가스 크로마토그래프 바이알에 각 표준의 2 μL을 추가하고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.</li>
</ol>7. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래프 준비
참고: 이 설정 및 프로토콜은 사용되는 가스 크로마토그래프에 따라 변경해야 할 수 있습니다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 분리가 아닌 에탄올 수준을 정량화하는 데 사용됩니다.
<ol><li>자동 샘플러용 히터를 58°C로 설정하고 켭니다. 히터가 58 °C에 도달하도록 하고 가스 크로마토그래프를 공급하는 공기 및 수소 가스 라인을 켭니다 (에탄올을 정량화하는 데 사용되는 화염 이온화용). 참고: psi는 제조업체의 사양에 따라 크로마토그래프를 올바르게 작동하도록 설정해야 합니다. 헬륨 선이 켜졌는지 확인하고 적절한 psi로 설정하십시오.</li>
	<li>중격의 경우 주입된 샘플 수가 &gt;100이 아닌지 확인하십시오. 사출 섬유의 경우 주입된 샘플 수가 &gt;500이 아닌지 확인하십시오. 참고: 주사량이 초과된 경우 테스트 샘플을 실행하기 전에 변경해야 합니다.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 켜고 워크스테이션이 제대로 설정되어 있는지 확인합니다. 실험실/부서 표준에 따라 모든 데이터를 저장합니다. 실행할 샘플에 대한 새 샘플 목록을 만듭니다.</li>
	<li>시동 방법을 시작하고 샘플을 실행하기 전에 화염 이온화 검출기가 안정화될 때까지 기다립니다. 일단 안정되면, 섬유를 청소하는 소프트웨어 시작 방법을 실행합니다.</li>
</ol>8. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용한 시료 측정
<ol><li>시작 메서드가 완료되면 샘플 목록에서 샘플당 1개의 새 줄을 만듭니다. 분석 소프트웨어의 방법 메뉴에서 436 전류 spme 에탄올 2013 3min 흡수 2_5min rg 실행을 로드합니다. 샘플 목록의 각 샘플에 대한 메타음.<ol>
<li>공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크로 시작하여 샘플 목록을 작성하십시오. 그런 다음 0.3125에서 40mM까지 순서대로 표준을 입력합니다. 공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크의 두 번째 라운드와 표준을 따르십시오.</li>
		<li>가장 낮은 예측 에탄올 농도에서 가장 높은 예측 된 에탄올 농도까지 시험할 모든 균질화된 배아 상피 샘플을 입력합니다. 공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크의 세 번째 및 최종 라운드를 입력하여 종료합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 입력한 순서대로 자동 샘플러에 가스 크로마토그래프 바이알을 추가합니다. 샘플을 10-15분 동안 데우도록 허용합니다.</li>
	<li>모든 샘플과 최종 공백이 실행된 후 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기를 실행하여 소프트웨어의 종료 방법을 활성화합니다. METH. 샘플 실행 중에 수집된 모든 데이터를 백업합니다. 다음 순서로 장비를 끄십시오 : 자동 샘플러 히터, 수소 탱크 및 크로마토 그래프 온도가 30 °C에 도달 한 후에만 공기 탱크. 왁스 컬럼을 보존하기 위해 헬륨 탱크를 그대로 둡니다.</li>
</ol>9. 샘플 에탄올 피크 통합 및 시료 농도 분석
참고: 9.3on의 모든 값은 모든 방정식이 미리 채워진 엑셀 파일에서 계산되었습니다.
<ol><li>종료 방법이 완료되면 크로마토그램 열기를 클릭합니다. 결과가 포함된 폴더를 엽니다. 샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다.</li>
	<li>결과에서 올바른 피크가 통합되었는지 확인합니다(에탄올 피크는 2에서 2.5 사이). 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.</li>
	<li>그래프에 에탄올 표준의 피크 높이를 플로팅합니다. 에탄올 표준에 대한 경사, Y 절편 및R2 값을 계산합니다(R2는 &gt;0.99여야 합니다). 참고: 이러한 값은 샘플 피크 높이에서 에탄올 농도를 결정하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 에탄올 표준의 Y 절편에서 샘플의 피크 높이를 뺍니다. 이 값을 에탄올 표준의 경사로 나누어 GC 바이알내의 각 샘플에 대한 에탄올 값을 얻습니다.</li>
</ol><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg">
<ol start="5"><li>배아의 에탄올 농도를 계산하려면 먼저 각 샘플에 대한 희석 계수를 계산합니다. 이 프로토콜의 2.3단계에서 계산된 볼륨 측정값을 볼륨 측정값과 500 μL로 나눕니다. 이것은 배아 처리 동안 각 샘플에 첨가된 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액을 나타낸다(단계 5.3 및 5.4).</li>
</ol><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg">
<ol start="6"><li>이 샘플 희석 계수를 사용하여 각 샘플에 대한 샘플 에탄올 값을 곱합니다. 결과는 mM 농도에 있을 것입니다. 매체 에탄올 값을 희석 계수 10으로 곱하여 미디어 참조 샘플을 계산합니다.</li>
</ol><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg">
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg">

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

개발 모델 시스템인 zebrafish는 환경 요인이 개발에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다. 그(것)들은 에탄올 연구 결과에 있는 정확한 타이밍 그리고 복용량 패러다임을 허용하는 외부기름지게 한 태아의 다수를 일으킵니다. 이것은 살아있는 화상 진찰 기능 및 인간을 가진 유전과 발달 보존과 결합하여, zebrafish를 기형학 연구를 위한 강력한 모형 체계를 만듭니다. 기재된 것은 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아를 개발할 때 배아 에탄올 농도를 측정하기 위한 프로토콜이다.
배아 에탄올 농도를 결정하는 것은 에탄올이 발달 하는 배아에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 설치류 모델에서, 혈액 에탄올 농도는 조직 농도와 상관 관계26. 그러나, 제브라피시의 초기 배아 발달에서 혈액 에탄올 수준을 평가하는 것은 불가능합니다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 제브라피시25...

태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 배아 에탄올 노출과 관련된 광범위한 신경 장애 및 두개안면이상학을1. 에탄올 노출 및 유전적 배경의 타이밍 및 투여량을 포함한 여러 요인이 FASD2,3의변이에 기여한다. 인간에서는, 이 변수의 복잡한 관계는 공부하고 FASD의 병인학을 이해하는 도전을 만듭니다. 동물 모델은 에탄올 기형의 기계적 기초에 대한 우리의 이해를 개발하는 데 중요한 것으로 입증되었습니다. 다양한 동물 모델 시스템이 FASD의 여러 측면을 연구하는 데 사용되었으며 결과는 인간에서 노출에서 발견되는 것과 현저하게 일치했습니다4. 설치류 모델 시스템은 FASD의 많은 측면을 검사하는 데 사용되며 마우스가 가장 일반적인5,6,7입니다. 이 작업의 대부분은 초기 에탄올 노출에 발달 결함에 초점을 맞추고있다8,에탄올에 나중에 노출뿐만 아니라 개발 이상을 일으키는 것으로 나타났다하지만9. 더욱이, 마우스의 유전 적 능력은 FASD10,11의유전 적 기초를 탐구하는 우리의 능력에 크게 도움이되었습니다. 마우스에서 이러한 연구는 강하게 소닉 고슴도치 경로와 유전자 에탄올 상호 작용이 있음을 제안, 레티노산 신호, 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제, 산화 산화 신타제 I, Aldh2 및 Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. 이러한 연구는 동물 모델이 FASD와 그 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.
제브라피쉬는 에탄올 기형의 여러 측면을 검사하는 강력한 모델 시스템으로 부상하고있다 22,23. 그들의 외부 풍부하게 함, 높은 fecundity, 유전 성 및 살아있는 화상 진찰 기능 때문에, zebrafish는 이상적으로 에탄올 기형의 타이밍, 복용량 및 유전학과 같은 요인을 공부하기 위하여 적당합니다. 에탄올은 정확하게 단계적 배아에 투여될 수 있고 배아는 발달 과정 동안 에탄올의 직접적인 영향을 조사하기 위해 이미지화될 수 있다. 이 연구는 개발의 유전 프로그램이 제브라피시와 인간 사이에서 매우 보존되어 있기 때문에 인간과 직접 관련될 수 있으며 따라서 FASD 인간 연구24를안내하는 데 도움이 될 수 있다. 제브라피쉬가 에탄올 기형 생성을 검사하는 데 사용되었지만, 배아 에탄올 농도보고에 대한 합의가 부족하면 인간과 비교하기가 어렵다25. 포유류 시스템에서, 혈중 알코올 수준은 조직 에탄올 수준과 직접 상관 관계26. 제브라피쉬 연구의 대부분은 순환계가 완전히 형성되기 전에 배아를 치료합니다. 검사할 모계 샘플이 없는 경우, 에탄올 농도를 평가하는 과정이 배아 내의 에탄올 수준을 정량화하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 개발 하는 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 과정을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>대학에 계약에 의해 제공되는</td> <td>공기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>자동 샘플러, CP-8400</td><td>바리안</td><td></td><td>가스 크로마토 그래프 자동 샘플러</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡 2 mL</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td>이 있는 가스 크로마토그래프 바이알 <td>세척 후 바이알을 재사용할 수 있지만 캡/셉타는 재사용할 수 없습니다</td></tr><tr><td>가스 크로마토그래프, CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>헬륨</td><td></td><td></td><td>대학에 계약에 의해 제공</td></tr><tr><td>HP Innowax 모세관 컬럼</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &mu; m 필름 두꺼운</td></tr><tr><td>Hyrdogen</td><td></td><td></td><td>대학에 계약에 의해 제공</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (Heptahydrate)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 팁 10 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 팁 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 팁 200 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>가스 크로마토그래프 바이알용 교체 캡/격막</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨(이염성)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>실리카 비드 .5mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>실리카 비드 1.0mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(이염기성)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>고체상 미세추출, 섬유 어셈블리 Carboxen/Polydimethylsiloxane</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>교체용 섬유</td></tr><tr><td>스타 크로마토그래피 워크스테이션</td><td>Varian</td><td></td><td>크로마토그래피 소프트웨어</td></tr><tr><td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>Replacement inlet septa</td></tr></tbody></table>

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

태아 알콜 스펙트럼 무질서 (FASD)는 안면 이형성증 및 신경 손상을 포함하여 에탄올 유도한 발달 결함의 높게 변명한 연속체를 기술합니다. 복잡한 병리학으로, FASD는 미국에서 태어난 100명의 아이들에 대하여 대략 1에 매년 영향을 미칩니다. FASD의 매우 가변적인 특성으로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 개발 결함에 대한 현재의 기계적 이해에서 중요한 것으로 입증되었습니다. 점점 더 많은 실험실에서 제브라피시를 사용하여 에탄올로 인한 발달 결함을 검사하는 데 주력하고 있습니다. Zebrafish는 외부에서 수정되고 유전적으로 견인할 수 있는 반투명 배아를 다수 생산합니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 타이밍과 복용량을 정확하게 제어하고 라이브 이미징 기술을 통해 배아 에탄올 노출의 영향을 정량화할 수 있습니다. 이것은 유전학과 인간과의 발달의 높은 수준의 보존과 결합되어, 에탄올 기형의 기계적 기초를 연구하는 강력한 모델로 제브라피쉬가 입증되었습니다. 그러나, 에탄올 노출 식이요법은 이 연구 결과에 걸쳐 제브라피시 데이터의 해석을 혼동한 다른 제브라피시 연구 사이에서 변화했습니다. 여기서는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 프로토콜이다.

혈액 에탄올 수준은 완전히 형성된 순환 계통이 부족하기 때문에 초기 배아 제브라피시에서 결정될 수 없습니다. 제브라피쉬 배아에서 에탄올 농도수준을 결정하기 위해 에탄올 수준은 균질화된 배아 조직에서 직접 측정됩니다. 배아 에탄올 농도를 적절하게 측정하려면 배아 량을 고려해야 합니다. 배아 (노른자 부착)는 초원 내부에 앉아 (달걀 껍질) 엑스트라 배아 유체에 둘러싸여(그림 1). 배아의 모든 부피는 배아의 크기가 증가함에 따라 배아의 양이 발달 시간에 걸쳐 변화하기 때문에 노출 시 배아에서 이루어져야 합니다. 또한, 배아처리 방법은 배아 부피뿐만 아니라 배아 의 양을 고려해야 하는데, 이는 이 두 원소가 배아 에탄올 수준을 계산하는 데 사용되는 희석 인자를 생성하기 때문이다.
배아는 완벽한 구체가 아니기 때문에, 특히 10 hpf 후에, 물 변위는 배아 부피를 평가하기 위하여 이용되었다. 이 연구는 24 hpf에서 배아를 사용...

이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

이 프로토콜은 제브라피시 배아 를 개발하는 에탄올의 약동학을 이해하는 데 도움이되며 이것은 제브라피시 연구에서 에탄올 노출 정권을 표준화하는 데 도움이 되기 때문에 중요합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 연구원이 배아 발달 도중 에탄올 수준을 신속하고 재현적으로 측정할 수 있다는 것입니다, 특히 혈액 공급이 유효하지 않는 태아에서. 이 방법은 적절한 기술 및 장비 설정을 가정하는 다른 환경 요인뿐만 아니라 다른 모델 시스템에 쉽게 적용 할 수 있습니다.나는 태아 처리 도중 에탄올 증발을 방지하는 데 필요한 속도로 투쟁하기 위하여 처음으로 이 프로토콜을 능력을 발휘하는 개별을 기대할 것입니다. 250 마이크로리터의 부피에서 라인으로 표시된 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 여분의 배아 액을 가진 10개의 배아를 이송하는 것으로 시작합니다. 채우기 라인에 물을 추가합니다.비반향 샘플을 위해 추가 미세 원심 분리튜브를 준비하십시오. 초리온을 제거하려면 배아를 10분 동안 배아 매체에 밀리리터 당 2밀리그램의 페트리 접시에 배아를 배양합니다. 몇 분마다 부드럽게 접시를 소용돌이어 초리온을 깨뜨린다.모든 배아가 초리온이 없는 후에는 프로테아제 칵테일에서 제거하고 신선한 매체로 두 번 씻으시다. 그런 다음 배아를 신선한 100밀리미터 접시로 옮기습니다. 모든 시료가 부피 측정준비가 되면, 배아 주위의 모든 액체를 주의 깊게 제거하기 위해 가능한 가장 작은 팁이 있는 P200 마이크로파이프를 사용하십시오.0.1 밀리그램 이하의 정밀도로 수량을 계량한 다음 250 마이크로리터에서 제거된 물의 무게를 빼서 10개의 배아의 부피를 결정합니다. 단일 배아의 부피를 결정하기 위해 차이를 10으로 나눕니다. 짝짓기 탱크에서 배아를 모아 표준 100mm 페트리 접시에 넣은 다음 28.5섭씨로 접시를 배양합니다.수정 후 6 시간에서, 배아 미디어와 1 % 에탄올 또는 미디어 혼자 새로운 접시에 최대 100 배아를 전송합니다. 뚜껑을 덮지만 페트리 요리를 밀봉하지 않고 18시간 동안 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣거나 수정 후 24시간 까지 보관하십시오. 50 마이크로리터로 설정된 두 개의 P200 마이크로파이펫을 사용하고 프로테아제 칵테일 용액을 하나와 물을 두 번째로 흡인시합니다.그런 다음 유리 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 10 개의 배아를 신속하게 배치하고 캡을 닫습니다. 모든 샘플을 테스트, 제어 및 에탄올 치료 배아에 대해이 과정을 반복하십시오. 한 번에 하나의 샘플로 작업하여 캡을 빠르게 열고 200 마이크로리터로 설정된 P200 마이크로파이펫으로 모든 잔류 배아 미디어를 흡인합니다.빠르게 하지만 부드럽게 추가 하 고 물 50 마이크로 리터를 제거, 다음 프로테이즈 칵테일의 50 마이크로 리터를 추가 하 고 튜브 캡을 닫습니다. 샘플이 실온에서 10분 동안 앉아 서염화 나트륨 5개 중 450마이크로리터를 빠르게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다. 10분 동안 소용돌이를 통해 시료를 균질화하고 두 개의 초미세먼지를 가스 크로마토그래피 바이알로 이송한다.바이알을 폴리테트라플루오로틸렌 캡으로 밀봉합니다. 시작 방법을 완료한 후 현재 SPME 에탄올 436개를 로드하여 2~5분 RG 런을 로드합니다. 샘플 목록의 각 샘플에 대한 분석 소프트웨어의 메서드 메뉴에서 메타메타.공기, 물, 5개의 어금니 나트륨 염화 나트륨 프로테아제 칵테일 블랭크로 시작하여 샘플 목록을 작성합니다. 그런 다음 0.3125에서 40 밀리머까지 순으로 에탄올 표준을 입력합니다. 공백의 두 번째 라운드와 표준을 따르십시오.모든 균질화 배아 상체 샘플을 입력하여 가장 낮은 에서 가장 높은 예측 에탄올 농도까지 테스트하고 빈칸의 세 번째 라운드를 입력하여 완료합니다. 가스 크로마토그래피 바이알을 자동 샘플러에 추가하여 시료를 입력하고 10~15분 동안 따뜻하게 할 수 있도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 샘플 실행을 시작합니다.실행이 완료되면 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기.meth를 실행하여 종료 방법을 활성화합니다. 샘플 실행 중에 획득한 모든 데이터를 백업합니다. 종료 방법이 완료되면 열 크로마토그램을 클릭하고 결과와 함께 폴더를 엽니다.샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다. 결과에서 올바른 피크가 통합되었는지 확인합니다. 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.그래프에서 에탄올 표준의 피크 높이를 플롯한 다음 경사, y-intercept 및 r 제곱 값을 계산합니다. 표준의 y-intercept에서 샘플의 피크 높이를 빼고 이 값을 표준의 경사로 나누어 각 샘플에 대한 에탄올 값을 가져옵니다. 배아에서 에탄올 농도를 계산하려면 각 샘플에 대한 희석 계수를 계산하고 이 희석 계수에 의해 샘플 에탄올 값을 곱합니다.마지막으로 미디어 에탄올 값을 10의 희석 계수로 곱하여 미디어 참조 샘플을 계산합니다. 배아 에탄올 농도를 제대로 계산하기 위해, 그들의 초리온에서 배아의 양을 측정하고 그들의 초리온에서 제거되었습니다. 이 분석에서, 태아는 초리온 내부의 총 부피의 56%를 구성하였다.이전에 발표된 작업을 기반으로, 73.6%는 제시된 모든 분석을 위한 배아 수분 함량으로 사용되었다. 이로 인해 배아 부피의 1.1 마이크로리터의 0.82 마이크로리터를 포함하는 물. 총 물 부피 중 49%는 배아에 함유되어 있으며 51%는 배아 유체에 함유되어 있습니다.가스 크로마토그래피 분석을 위해, 15개의 샘플과 처리된 매체의 2개의 단이 그룹당 5회 측정되었다는 것을 분석하였다. 미디어 에탄올 수준은 그룹 1용 143.6 밀리몰어, 그룹 2의 경우 133.6 밀리몰러였다. 배아의 에탄올 농도는 각각 63.5 밀리몰러와 53.1 밀리몰러를 각각 1개와 2군으로 측정했다.각 샘플에 대해 에탄올의 미디어 수준에 배아 에탄올 농도의 비율이 계산되었다. 그룹 1은 미디어 에탄올 레벨의 44%를, 그룹은 미디어 에탄올 레벨의 40%를 차지했다. 처리되지 않은 대조군 배아는 0 밀리몰라 미디어 에탄올 농도로 측정하였다.이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 에탄올이 휘발성이고 빠르게 증발하기 때문에 GC 분석을 위한 배아를 제대로 처리하는 것이 중요하다는 것입니다. 이 단계를 수행하는 가장 좋은 방법은 설명, 하지만 적절 한 근육 메모리를 개발 하기 위해 연습 해야. 이 절차는 제브라피시의 에탄올 치료 정권을 표준화하고 에탄 테라토겐성의 유전 및 세포 메커니즘을 해부하는 미래의 작업을 허용하는 데 도움이됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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