Name: 라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 배우세요 Texas Red 덱스트란을 이용한 생체 머리카락 세포의 기계수용 채널 기능 평가 방법을. 생쥐 달팽이관에서 실시간으로 내포작용을 시각화하여 청각 세포 생물학 연구에 활용합니다.

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우리는 공초점 이미지 수집을 지원하기 위한 NICHD 현미경 검사법 및 이미징 코어의 빈센트 슈람과 식민지 관리 및 마우스 관리에 귀중한 도움을 준 Tsg-Hui Chang에게 감사드립니다. 이 연구는 NINDS, NIH, 베데스다, MD의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었으며, K.J.S. A.B.는 NINDS, NIH의 교내 연구 프로그램과 교내 연구 프로그램에서 로버트 웬홀드 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. NIDCD의

동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었다, 이는 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된 (동물 프로토콜 은 KJS에 #1336).
1. 생쥐
<ol><li>C57BL/6J 야생형의 번식 쌍을 세워 동물 시설에서 번식하여 새끼의 생년월일을 제어하고 새끼의 나이를 추적합니다.</li>
</ol>2. 달팽이관 해부
<ol><li>해부를 수행하기 위해 입체 현미경에 가까운 깨끗한 공간을 설정합니다(그림1A). 70% 에탄올을 사용하여 공간과 주변 환경을 청소하고 깨끗한 벤치 패드를 놓습니다. 동물 시체를 폐기하려면 의료 병리학 폐기물(MPW) 비닐 봉지가 필요합니다.</li>
	<li>Leibovitz의 L15 미디어로 35mm 요리를 준비합니다. 참고: Leibovitz의 L-15 세포 매체는 팁 링크의 무결성을 유지하는 데 필요한 1-2 mMCa2+를함유하고 있으며, 세포 건강과 생존을 개선하기 위해 필수 아미노산, 비타민 및 나트륨 피루바테를 함유하고 있습니다. 혈청은 그 잘못 정의된 조성물 및 덱스렌과의 잠재적 간섭으로 인한 실험적 가변성을 피하기 위해 배제되었다.</li>
	<li>산후-6(P6) 마우스를 참수에 의해 안락사시한다. 참고 : 6 일 된 마우스는 흡입 성 마취제에 다소 내성이 있습니다. 이소플루란 또는 장기간CO2 노출(최대 50분)이 안락사에 사용될 수 있지만, 사망을 보장하기 위해 이차적인 물리적 방법을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>외과 용 가위를 사용하여 전방에서 후방 끝및 외부 청각 운하를 가로 질러 피상적 인 컷을 만들어 두개골의 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>피부를 코쪽으로 접어 두개골을 노출시다(그림2B).</li>
	<li>두개골 의 앞쪽과 눈 선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다(그림 2B-C).</li>
	<li>두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하여 측두골에 노출시(그림 2C-D).</li>
	<li>작은 가위로, 측두골 주위를 자르고 조직을 절제하십시오.</li>
	<li>두 개의 측두뼈를 35mm 접시에 놓고 L15 용지로 덮여 있는지 확인합니다(그림2E). 참고: 다음 단계는 입체 현미경으로 수행됩니다. 검은 배경은 일반적으로 미세 해부 단계 동안 조직을 시각화하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>와이드필드 접안렌즈(10배 배율(WF10X)와 외부 교류 전류(AC) 할로겐 광원이 장착된 입체 현미경으로 주변 달팽이관 조직, 반원형 운하 및 수술용 집게가 있는 전정 기관을 제거합니다(그림2F).</li>
	<li>덱스렌 및 L15 용지가 달팽이관 덕트에 들어갈 수 있도록 해부된 달팽이관에 두 개의 펑크 경계를 수행합니다.</li>
	<li>9웰 유리 우울증 플레이트에서 각 우물에 Leibovitz의 L15 용지 300mL를 추가합니다.</li>
	<li>각 우물에 적어도 세 개의 해부 된 달팽이를 놓습니다.</li>
</ol>3. 덱스렌 라벨링
<ol><li>Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS-CFM)를 10 mg/mL의 최종 농도로 하지 않고 행크스의 균형 잡힌 소금 용액에 덱스렌을 재구성합니다. 이 스톡 용액은 불투명한 검정 튜브(빛으로부터 보호됨)로 aliquoted되고 사용 될 때까지 -30 °C에서 보관되어야합니다. 참고: 이 프로토콜의 성공적인 결과에는 lysine-fixable dextran의 사용이 중요합니다.</li>
	<li>Leibovitz의 L15 용지 500 mL에서 2 mg/mL의 최종 농도로 각 덱젠을 준비합니다.</li>
	<li>달팽이관에서 미디어를 제거하고 2 mg/mL의 최종 농도에서 관심 있는 덱스트란을 포함하는 Leibovitz의 L15 용지를 추가합니다. 참고: MET 채널의 비율이 나머지41,42에서열려 있지만, 덱스트렌 배양은 MET 채널의 개방 확률을 높이기 위해 이식의 완만한 흔들림으로 수행되었다.</li>
	<li>25°의 기울어진 각도로 3차원 셰이커를 사용하여 부드러운 흔들림(25rpm)으로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 참고: 형광으로 라벨이 부착된 덱스트렌은 가능하면 빛으로부터 보호되어야 합니다. 2시간 배양 동안 덱스트렌을 보호하기 위해, 알루미늄 호일에 싸인 세포 배양 P150 접시 안에 9웰 유리 판을 놓는다.</li>
</ol>4. 화상 진찰을 위한 견본 준비
<ol><li>덱스렌으로 배양한 후, 2분 동안 미디어를 두 번, HBSS로 한 번 씻는다.</li>
	<li>행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분 동안 조직을 배양하십시오. 주의: 포름알데히드에 노출되면 눈, 코 및 상부 호흡기에 자극적일 수 있습니다. 특정 개별에서는, 포름알데히드에 반복된 피부 노출은 알레르기성 피부염 귀착될 수 있는 과민반응을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 포름알데히드는 알려진 인간 발암 물질이며 생식 위험이 의심됩니다.</li>
	<li>HBSS로 고정 된 조직을 두 번 신속하고 부드럽게 세척하여 파라 포름 알데히드를 제거하십시오. 참고 : 달팽이관의 이 발달 단계에서는 측두골의 데칼화가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>코르티의 기관을 해부하는 미세 팁 집게로 나선형 인대와 지각 막을 제거하십시오(그림 2G).</li>
	<li>조직의 모든 작은 조각을 제거하고 HBSS로 조직을 씻어.</li>
	<li>형광표지된 파할로이드를 함유한 PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 조직을 투과하여(TR-또는 FITC 라벨이 부착된 덱스트란의 흡수를 각각 테스트할 때 녹색 또는 적색으로 공액화) 1:200 희석하여 F-액틴라벨을 30분 동안 액틴 기반 의 스테레오실리아.</li>
	<li>HBSS 완충액으로 매번 2-3회 조직을 세척하여 트리톤과 파할로이드의 과잉을 제거하고, 한 번 PBS로 소금을 제거한다.</li>
	<li>현미경 슬라이드에 코르티 조직의 기관을 장착하고 장착 매체로 덮습니다. 참고: 티슈를 장착할 때, 모발 세포 스테레오실리아를 포함하는 조직의 측면이 커버슬립을 향하고 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>마운팅 미디어를 추가하는 동안 발생하는 잠재적인 기포를 제거하고 커버슬립을 배치하는 동안 새로운 기포가 생성되는 것을 방지합니다. 참고: 마운팅 매체를 추가하는 동안 생성된 모든 기포를 파이펫으로 흡인합니다. 기포가 커버슬립 아래에 갇히지 않도록 하기 위해 커버슬립 가장자리를 시료 가까이에 놓고 집게 나 파이펫 팁을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 천천히 하강합니다.</li>
	<li>유리 커버 슬립으로 마운팅 매체에 티슈를 덮습니다(그림2H). 참고: 수치 조리개가 0.4이상인 대점은 #1.5개의 커버슬립(두께 0.17mm)을 사용하도록 설계되었습니다. 잘못된 커버슬립을 사용하면 이미지의 강도와 품질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>장착 된 조직을 실온에서 하룻밤 동안 배양하여 마운팅 매체가 건조하게하고 이미징이 될 때까지 슬라이드를 4 °C에서 저장합니다.</li>
</ol>5. 이미지 수집 및 이미지 처리
참고: 공초점 이미지는 초고해상도(SR) 모드43및 63x 대물렌즈에서 32채널 Airyscan 검출기가 장착된 LSM 880 공초점 현미경으로 촬영되었습니다.
<ol><li>목표에 약간의 침지 오일을 추가합니다.</li>
	<li>침지 오일을 향한 유리 커버슬립을 사용하여 장착된 조직 샘플을 포함하는 현미경 슬라이드를 현미경 단계에 놓습니다.</li>
	<li>샘플에 초점을 맞추고 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 매개 변수를 설정합니다.</li>
	<li>각 독립적인 실험에 대해 동일한 이미지 수집 설정과 x, y 및 z 해상도에 대해 최적의 매개변수를 사용합니다. 이미지의 z 스택을 획득할 때 목표를 빠르고 정확하게 이동하려면 압전 기반 포커스 시스템이 필요합니다. 참고: 모발 세포의 전체 정점 영역을 이미지화하려면 최적의 설정을 사용하여 스테레오실리아에서 모발 세포 체의 정점 절반까지 이미지의 z 스택을 수집합니다. 소포 와 같은 입자의 이미징을 보장하기 위해 모발 세포를 따라 큰 z 스택을 수집하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 Airyscan 3D 재구성 알고리즘을 사용하여 자동 기본 데콘볼루션 필터 설정을 사용하여 원시 공초점 이미지를 처리합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어에서 공초점 이미지를 열어 밝기와 대비를 조정하고 배율 막대를 추가하고 최종 그림에 대한 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 3 kDa dextran 텍사스 레드와 코르티 이식의 뮤린 기관에서 섭취 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 목표는 이전에 시험된 그 외 보다는 더 큰 분자가 또한 특히 청각 머리 세포를 표지하고 MET 채널을 통해 침투할 수 있었다는 것을 시험하는 것입니다. 유사한 실험 프로토콜은 이전에 FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 (1.29-1.43 kDa)와 같은 다른 형광 염료에 대한 모발 세포의 투과성을 평가하기 위해 이전에 사용되었습니다13,52. 이 형광 분자를 사용하여 모발 세포에 라벨을 붙이는 데 필요한 시간은 크기에 따라 다릅니다. 최대 라벨링은 FM1-43<sup cla...

내이의 모발 세포는 소리를 감지하고 궁극적으로 우리의 뇌에 의해 해석되는 전기 신호의 기계적 자극을 은폐하는 감각 세포입니다. 이 세포는 그들의 정점 지역1,2에서돌출하는 스테레오실리아로 알려져 있는 actin 기지를 둔 필라멘트의 3개의 행의 계단 모양 의 묶음을 가지고 있습니다. 기계적 자극은 스테레오실리아 필라멘트를 가장 긴 행쪽으로 편향시키고 메카노트랜스덕션(MET) 채널3의개구부를 트리거합니다. MET 채널의 개통은 세포를 탈분극화하고 결과적으로 모발 세포의 기저 부위에 시냅스 소포의 방출을 신호하는 양이온의 유입으로 이어집니다.
청력에 필수적인 MET 채널의 생물물리학적 특성은 광범위하게 특징지어졌습니다. 다른 특성 들 중, 이들 채널은 양이온 선택적이며 상대적으로 큰 전도도 (낮은Ca2 +에서 150-300 pS)4,5,6,7,8,9,10을갖는다. 놀랍게도, FM1-43 및 텍사스 적색 표지된 아미노글리코시드와 같은 큰 형광 분자는 MET 채널의 퍼시블 차단제이며, 형광 현미경 검사법을 사용하여 가시화될 수 있는 모발 세포체에 축적되는 결과를11,12,13,14. 반대로, 분자 정체성 및 MET 채널및 그 투과 통로의 구조는 애매하게 남아 있습니다. 증가하는 실험적 증거는 막막유사 채널 단백질 1(TMC1)이 성숙한 모발 세포15,16,17,18,19에서MET 채널의 성분임을 나타낸다. 막형 채널 1(TMC1)의 돌연변이는 MET 채널 속성19,20,21,22를 변경하고 청각 장애를 일으킨다. 또한, TMC1은 MET채널(18,23)의 부위에 국소화하고, 기계적 힘을 MET채널(24,25)으로전송하는 것을 담당하는 팁 링크와 상호작용한다. 더욱이, 최근 생물정보학 분석은 TMC 단백질을 메카노민성 채널 TMEM63/OSCA 단백질 및 TMEM16 단백질, 칼슘 활성 염화물 채널 및 지질 스크램블라제 26,27,28와관련된 진화로 확인하였으며,28. 이들 단백질 간의 관계에 기초한 TMC1의 구조적 모델은 단백질-지질계면(27)에서큰 공동의 존재를 밝혀낸다. 이 공동은 상염색체 지배적 난청(DFNA36)을 유발하는 2개의 TMC1 돌연변이(DFNA36)27,29,30,31,32,및 캐비티 내의 잔류물을 위한 시스테인 돌연변이체의 선택적 변형MET 채널특성(28)을수용하며, 이는 MET 채널의 투과 경로로서 기능할 수 있음을 나타낸다. TMC 단백질에 있는 이 예측한 구멍의 큰 규모는 MET 채널을 침투하는 큰 분자의 기능을 설명할 수 있었습니다. MET 채널이 비정상적으로 큰 투과 경로를 포함하고 TMC1에서 관찰된 공동의 크기의 한계를 밀어내기 위해, 우리는 더 큰 분자를 가진 코르티 이식의 기관에서 섭취 실험을 수행하는 프로토콜을 개발, 3 kDa dextran 형광으로 텍사스 레드로 표지.
Dextran은 알파 1,6 글리코시딕 결합에 의해 결합된 많은 D-포도당 분자로 구성된 복잡한 분지 다당류입니다. 물의 높은 용해도, 낮은 세포 독성 및 생체 불활성은 여러 세포 과정을 연구할 수있는 다목적 도구입니다. 또한, 덱스렌은 다양한 크기와 형광으로 여러 가지 색상의 형광로 표지로 제공됩니다. 형광표지덱스트랜스는 세포 및 조직 투과성 연구33,34,다중 세포 시스템35,36,및 신경 추적37,38에서내분비증을 연구하는 데 일반적으로 사용된다. 청각 분야에서, 덱스렌 분자는 또한 코르티39,40의친칠라 기관에서 강렬한 소음에 노출 된 후 세포 세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실을 평가하는 데 사용되었습니다.
이 작품에서, 우리는 뮤린 내이 모발 세포에서 의 한 부분의 관세포 실험을 수행하고 내이 모발 세포 MET 채널의 투과 경로의 크기를 탐구하기 위해 가장 작은 (3 및 10 kDa) 형광 덱스 트랜스의 일부의 특성을 이용했다. 또한, 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM) 880을 사용하여 에어리스캔 검출기가 장착되어 입체 및 청각 모발 세포의 세포체에서 형광 덱젠을 시각화하고 국소화했습니다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 유리 커버 슬립 18mm</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0714</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 488 팔로이딘</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 594 팔로이딘</td><td>ThermoFisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>알파 Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td><td>Carl Zeiss</td><td>420780-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>아밀로라이드 염산염</td><td>EMD 밀리포어</td><td></td><td></td>129876</tr><tr><td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td><td>벤치마킹 과학적</td><td>B3D5000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 야생형 마우스</td><td>균주 000664</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td></tr><tr><td>Cell impermean BAPTA 테트라칼륨</td>염 <td>ThermoFisher</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 10,000MW, 음이온성, 라이신 고정성</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 10,000MW, 라이신 고정성</td><td>ThermoFisher</td><td>D1863</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3000MW, 라이신 고정성</td><td>ThermoFisher</td><td>D3328</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 수용액 EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Image J 또는 FIJI</td><td>NIH</td><td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F 오일 이멀젼 미디어</td><td>Carl Zeiss</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 매체, GlutaMAX 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>네오마이신 트리설페이트 염 수화물</td><td>Sigma</td><td>N6386</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-CF405M</td><td>Biotium</td><td>00034</td><td></td></tr><tr><td>ProLong 다이아몬드 퇴색 방지 마운팅 미디어</td><td>ThermoFisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

모발 세포 메카노트랜스덕션(MET) 채널은 청력에 중요한 역할을 합니다. 그러나, MET의 분자 정체성 및 구조 정보는 알려지지 않은 남아 있습니다. 모발 세포의 전기 생리학적 연구는 MET 채널이 큰 전도도를 가지며 일부 스타일 염료 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 항생제를 포함하여 상대적으로 큰 형광 양이온 분자에 투과성임을 밝혔다. 이 프로토콜에서, 우리는 기능적 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 이용될 수 있는 Corti 이식의 기관의 머리 세포에 있는 형광 덱스트랜스의 픽업을 구상하고 평가하는 방법을 기술합니다. 우리는 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱스른이 1-2 시간 배양 후 기능성 청각 모발 세포를 구체적으로 라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. 특히, 3 kDa dextran은 기능성 MET 채널이 존재할 때 두 개의 짧은 스테레오실리아 행을 라벨하고 확산 패턴으로 세포체에 축적한다. 라벨링의 추가 소포 같은 패턴은 모발 세포와 주변 지지 세포의 세포체에서 관찰되었다. 우리의 데이터는 3 kDa 텍사스-레드 dextran가 세포 염료 관전자를 위한 2개의 통로를 구상하고 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다; 기능성 MET 채널 및 내분비증을 통한 모발 세포 특이적 진입 경로, 더 큰 덱스렌에 사용할 수 있는 패턴.

우리는 텍사스 레드 (dextran-TR)로 표지 된 3 kDa dextran 형광으로 야생 형 산후 - 6 (P6) 마우스에서 코르티 방종의 장기를 2 시간 배양 한 후 모발 세포의 강력하고 구체적인 라벨링을 관찰했습니다(그림 2A-B). Dextran 라벨링은 코르티 의 기관의 기저, 중간 및 정점 영역에서 내부 및 외부 모발 세포(IHC 및 OHC)에서 관찰되었다(도2B).
형광 표지된 파할로이드는 필라멘트 액틴(F-actin)을 역염색하고 액틴 계 모발 세포 스테레오실리아를 시각화하는 데 사용되었다. 우리는 또한 짧은 배양 시간에 유사한 실험을 수행하고, 우리는 모발 세포 체체에 dextran-TR 축적을 관찰했지만, 신호는 2 시간 배양에서보다 약하고 더 많은 변수였다...

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능성 메카노 트랜스유도 채널을 가진 살아있는 머리 세포에 있는 텍사스 Red로 표기된 정규 dextran 형광의 uptake를 공부하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 3킬로달톤 텍사스 레드 엑스트라른이 살아있는 모발 세포에서 메카노트랜스유도채널 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 달팽이관을 수확하려면, 산후 6마우스의 두개골을 Leibovitz의 L-15 배지가 들어 있는 60mm 배양 접시에 넣고 외과 가위를 사용하여 앞쪽 끝에서 두개골의 후불 끝까지 그리고 외부 청각 운하를 가로질러 피상적 인 절단을합니다.코를 향해 피부를 접어 두개골을 노출하고 두개골의 전면과 눈선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다. 두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하십시오. 측두골뼈를 관찰할 수 있을 때, 작은 가위를 사용하여 이 뼈 주위를 절단하여 조직을 소비합니다.신선한 L-15 배지를 함유한 35mm 접시에 현세적인 뼈를 담그고 넓은 필드 접안렌즈와 외부 교대 전류 할로겐 광원이 장착된 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 집게를 사용하여 주변 달팽이관 조직, 반 원형 운하 및 전정 기관을 제거하십시오. 달팽이관이 해부되고 신선한 L-15 미디어가있는 새로운 접시에 놓이면 외과 용 집게를 사용하여 둥근 창에 펑크 상처 1 개와 정색 달팽이관 부위의 천자 1 개를 만듭니다.모든 달팽이관이 수확되면, 신선한 L-15 배지의 200 마이크로 리터를 포함하는 9 웰 유리 우울증 플레이트의 우물에 조직을 배치합니다. 격리된 조직의 dextran 라벨링의 경우 각 샘플의 배지를 200 마이크로리터의 신선한 L-15 배지로 잘 교체하여 형광컨의 밀리리터당 2밀리그램으로 보충됩니다. 실온에서 2시간, 분당 25회 회전을 빛으로부터 보호하는 25도의 기울어진 각도로 3차원 셰이커로 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 HBSS로 1회, 세척당 2분간 중형으로 1회 세척합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 30분 동안 4%의 파라포름알데히드로 표본을 수정한 다음 HBSS에서 빠르고 부드러운 세척 2개를 넣습니다. 두 번째 세척 후, 미세 팁 집게를 사용하여 달팽이관 뼈, 나선형 인대 및 지각 막을 제거하고 HBSS에서 코르티의 고립 된 장기를 세척하십시오.모발 세포의 조직이 이 단계에서 쉽게 손상될 수 있기 때문에 투명한 지각막을 제거할 때 각별한 주의를 기울이십시오. F-actin에 라벨을 붙이려면 PBS에서 0.5%트리톤 X-100으로 샘플을 투과화하여 빛으로부터 보호되는 실온에서 30분 동안 형광라벨이 부착된 팔로이드를 100~200희석으로 보충한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 단일 세척을 시연한 대로 세척당 신선한 HBSS로 2~3회 세척합니다.적절한 장착 매체를 사용하여 코르티 조직의 장기를 유리 현미경에 장착하여 모발 스테레오실리아 측면을 위로 밀어 내고 63X 오일 침지 목표를 사용하여 형광 공초점 현미경에 샘플을 이미지화합니다. 텍사스 레드와 형광3킬로달톤 의 형광과 2 시간 배양 후, 야생 유형 산후 날 6 마우스에서 코르티의 기관은 내부와 외부 머리 세포 모두의 견고하고 특정 라벨을 보여줍니다. 모발 세포 스테레오실리아 및 세포 체의 화상 진찰은 그들의 세포 바디에 있는 3 킬로달톤 dextran 텍사스 Red를 통합한 그 세포만이 또한 그들의 입체의 형광 표시를 보여주었다는 것을 밝힙니다.중요한 것은, 메카노트랜스유도 채널이 있는 짧은 스테레오실리아 행의 끝에서 농축과 함께 입체를 따라 균일한 형광 신호가 관찰된다. 모발 세포의 세포 본체와 인접한 지지 세포의 소포와 같은 구조는 또한 dextran 텍사스 레드도 내분비증에 의해 채택 될 수 있음을 시사 관찰된다. 더 큰 10 킬로달톤 덱스트랜스는 또한 모발 세포의 세포 체및 지지 세포의 세포 체에서 소포와 같은 패턴을 생성했습니다.특히, 칼슘 첼라토르 또는 메카노트랜스덕션 채널 차단제의 존재는 모발 세포에서 3킬로달톤 엑스트라 텍사스 레드의 스테레오실리아 라벨링과 섭취를 방지합니다. 소포와 같은 패턴은 여전히 메카노트랜스덕션 채널 봉쇄가 있는 상황에서 관찰되고 있지만, 이러한 섭취 패턴은 기능적인 MET 채널과무관임을 나타냅니다. 코르티 조직의 장기를 주의 깊게 해부하고 이미징 조직을 장착하기 전에 모발 세포의 적절한 방향을 확인하는 것이 매우 중요합니다.살아있는 및 기능성 모발 세포의 dextran 라벨링 후, 고정 된 조직의 면역 염색은 관심있는 단백질의 특정 세포 유형을 식별하기 위해 수행 될 수있다.

dextran-labeling-uptake-live-functional-murine-cochlear-hair

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

이 비디오는 쥐귓바퀴의 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합된 기록을 보여줍니다. 형광성 염료에 노출되기 전과 후에 모낭 신경 말단의 기계적 자극, 생성된 활동 전위의 전기 생리학 기록, 모낭의 신경 말단 라벨링의 시각화와 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles(쥐 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합 기록)

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

동물 모델의 달팽이관에 이독성 물질을 도입하는 다양한 방법이 있습니다. 제시된 것은 이독성 물질을 둥근 창 틈새에 전달하기 위한 수술 프로토콜입니다. 이 절차는 신뢰할 수 있고, 표적화된 달팽이관 내 병변을 생성하며, 마이크로아키텍처에 대한 기계적 손상을 방지합니다. 달팽이관 자가 수리/재생에 대한 검사가 가능합니다.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

쥐, 귀, 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말끝의 피침형 말단의 기계적 자극으로 인한 구심성 방전을 기록하는 간단하고 새로운 기술이 제시됩니다.

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

여기에서는 스티릴 피리디늄 염료로 염색 및 탈색하는 동안 마우스, 귀 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말뚝 말단의 살아있는 피침형 감각 말단을 이미징하기 위한 새로운 준비에 대해 설명합니다.

의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 귀 피부

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

배우세요 Texas Red 덱스트란을 이용한 생체 머리카락 세포의 기계수용 채널 기능 평가 방법을. 생쥐 달팽이관에서 실시간으로 내포작용을 시각화하여 청각 세포 생물학 연구에 활용합니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

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