Name: 바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 임상 시험 현장에서 단일 혈액 무승부로 말초 혈액 단핵 세포 펠릿과 플라즈마를 준비하는 방법. 이 프로토콜은 약동학 및 약력학 연구를 위한 고품질 바이오샘플을 제공합니다.

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우리는 프로토콜에 대한 그들의 의견에 대한 아스트라 제네카 종양학 연구 및 조기 개발에서 번역 의학의 모든 구성원에게 감사드립니다, 특히 헤들리 카, Tammie Yeh와 네이선 스탠드니퍼는 ctDNA 분석을위한 플라즈마 준비에 대한 조언을, PBMC 절연에, PBMC 냉동 보존 및 면역 면역 페노티핑, 각각.

정보에 입각한 환자 동의 및 각 관할권의 관련 국가 윤리 요건(예: 인간 조직법(HTA – 영국, 2004) 및 건강 보험 이식 및 책임법(HIPAA – 미국, 1996)은 필수입니다. 인간이 파생한 자료에 대한 작업을 시작하기 전에 윤리 승인을 완전히 문서화했는지 확인하십시오. 이 프로토콜의 최적화에 사용된 혈액은 NIHR 케임브리지 임상 연구 시설, 케임브리지, 영국 케임브리지가 운영하는 자원봉사자 전진 의학 패널(VAMP)(VAMP)의 적절한 동의하에 제공되었으며, 영국 케임브리지 케임브리지 국립보건연구소(NIHR)와 인간 생물학적 샘플 공급 계약에 따라 영국 케임브리지 임상 연구 시설에서 실행되었다. 영국의 아스트라제네카 바이오뱅크는 인간 조직당국(면허 번호 12109)의 허가를 받았으며, 연구 조직은행(RTB)(REC No 17/NW/0207)으로 국가연구윤리위원회(NREC)의 승인을 받았습니다.
1. 일반적인 준비 지침
참고: 이 프로토콜의 혈액, 플라즈마 및 PBMC와 같은 고정되지 않은 인간 물질과 함께 모든 작업은 이러한 물질이 잠재적으로 전염성이 있는 물질을 운반할 수 있다는 가정 하에 작동해야 하므로 적절한 생체 안전 예방 조치에 따라 수행해야 합니다. 알려진 병원체에 대한 부정적 으로 테스트 된 환자의 경우 샘플이 비 전염성이라고 가정하지 않으므로 적절한 안전 예방 조치를 적용해야합니다. 이러한 재료에서 생성된 폐기물은 동일한 생체 안전 예방 조치로 처리되어야 하며 현지 규칙에 따라 폐기해야 합니다.
<ol><li>구연산나트륨이나 헤파린 나트륨을 항응고제로 활용하는 두 가지 유형의 단일핵 세포 준비 튜브 중에서 선택하십시오. 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한이 두 항 응 고 는 상호 교환 사용할 수 있습니다 하지만 두 항 응고제 재판에 대 한 하나를 선택 하기 전에 테스트 해야.</li>
	<li>환자의 코딩된 ID로 혈액 수집에 사용되는 8mL 단핵 세포 제제 튜브 1개를 라벨. 실내 온도(18-25°C)에서 튜브를 보관한다.</li>
	<li>실온(18-25°C)에 1x PBS를 보관하십시오. 준비당 30mL를 사용하십시오.</li>
	<li>별도의 플라즈마 샘플과 PBMC 샘플에 대한 극저온튜브가 실험실 매뉴얼의 적절한 섹션에 명시된 대로 고유한 식별자로 정확하게 레이블이 지정되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>PBMC가 인산화 된 단백질을 모니터링하는 데 사용될 경우, 포스파타제 억제제로 보충 된 PBS를 준비하십시오 : 5mL의 포스파타아제 억제제 칵테일 2 + 50 μL의 인산염 억제제 칵테일 3을 혼합하십시오. 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>PBMC가 냉동 보존될 경우 90% FBS + 10% DMSO를 혼합하여 샘플당 1mL 동결 혼합물을 준비합니다.</li>
</ol>2. PBMC 컬렉션(그림 1A)
<ol><li>제조업체에 의해 설명된 표준 기술을 사용하여 단핵 세포 준비 튜브에 8mL 혈액을 그립니다. 튜브를 부드럽게 8~10회 반전하여 항응고제 첨가제를 혈액과 혼합합니다. 혈청을 피하기 위해 흔들리지 마십시오. 피가 그려진 시간을 기록한다.</li>
	<li>수집 후 원심분리까지 실온에서 튜브를 똑바로 세워두십시오. 가능한 한 빨리 샘플을 처리, 이상적으로이 혈액 수집의 1 시간 이내에 하지만 늦어도 4 시간 포스트 수집. 혈액 처리를 시작할 때 타이밍을 기록합니다.</li>
	<li>원심분리 직전에 튜브를 8~10회 더 부드럽게 반전시켜 혈액 샘플을 리믹스합니다.</li>
	<li>원심분리기는 1,500 ~1,800 x g에서 1,500 ~1,800 x g에서 실온(18-25°C)에서 튜브/혈액 샘플 튜브를 원심분리합니다. 모든 튜브가 제대로 균형을 이루도록 하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> 그림 1: 원심분리기의 프로토콜 및 대표 이미지에 대한 일반적인 개요입니다. (A)PBMC 및 플라즈마의 제조를 위한 프로토콜의 회로도 개요. *시간 제약이 있는 경우 2.4단계를 20분으로 단축할 수 있으며 3.3~3.6단계를 제거할 수 있습니다. ** 필요한 경우, 셀을 계산하기 위해 알리쿼트를 가져 가라. 2단계 2.4에 대한 스윙 아웃 헤드 로터 원심분리기 세트의 ctDNA 분석/메타볼로믹스(B) 이미지에 필요한 2개의 추가 원심분리 단계. (C)단핵 세포 준비 튜브를 회전하는 어댑터를 포함하는 두 개의 버킷을 포함하는 로터의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: x g(RCF라고도 함, 상대 원심 단위라고도 함) 및 RPM(분당 회전)은 서로 다른 단위입니다. X g(RCF)에 대한 원심분리기를 설정해야 합니다. 변환을 위해 온라인 계산기(자료 표참조)를 사용합니다. 고정 각도 로터만 사용할 수 있는 경우 1,500 ~ 1,800 x g에서10분 동안 이 단계를 수행하십시오.
<ol start="5"><li>원심 분리 후 장벽 아래에 어두운 적층 (주로 적혈구 포함)과 장벽 위의 2 층의 존재를 확인하십시오. 상단 층은 플라즈마 (빨대 색)이며 그 아래에있는 희끄무레한 층은 PBMC를 포함하는 버피 코트입니다. 이러한 레이어는 어두운/검은색 배경에 대해 튜브를 볼 때 쉽게 구별할 수 있습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> 그림 2: PBMC를 격리하는 튜브. (A)원심분리(2.4단계), 빈(왼쪽) 또는 혈액(오른쪽)을 함유하기 전에 튜브의 이미지. (B)원심분리 후 PBMC 층의 성공적인 분리(단계 2.5). (C)원심분리 후 PBMC 층의 이미지와 모든 PBMC가 수집되도록 하기 위해 약간의 플라즈마가 남아 있다(단계 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 이러한 레이어가 표시되지 않으면 원심 분리 단위를 설정하는 데 오류가 있음을 나타냅니다. 올바른 원심분리기 어댑터가 사용되고 올바른 "x g"가 설정되어 있는지 확인합니다. 2.4 단계를 반복합니다.
<ol start="6"><li>원심 분리 직후, 혈장의 약 절반을 캡으로 라벨이 붙은 15mL 크기의 원심분리기 튜브로 옮기는 동시에 PBMC 층(약 4-5mL)을 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 튜브를 젖은 얼음에 플라즈마로 임시로 저장하여 4단계에서 나중에 사용할 수 있습니다. 지금은 따로 두십시오.</li>
	<li>파저 파이펫으로 전체 PBMC 층을 수집하고 피펫을 세포의 층 내에 배치하고 캡이 있는 다른 15mL 크기의 원심분리기 튜브로 이송합니다. 또한 모든 PBMC 층을 완전히 얻기 위해 필요한 경우 소량의 플라즈마를 섭취하는 것도 허용됩니다. 볼륨은 일반적으로 1-2 mL입니다. 아래 3단계로 즉시 계속됩니다.</li>
</ol>3. PBMC 세척 단계
참고: 세척 단계의 목적은 PBMC 펠릿에서 잔류 혈소판과 플라즈마를 희석하고 제거하는 것입니다. 모든 원심 분리 단계는 실온(18-25°C)에서 수행해야 합니다.
<ol><li>PBMC 튜브에 실온 PBS를 추가하여 15mL로 볼륨을 가져옵니다. 튜브를 캡. 튜브를 부드럽게 5번 반전시켜 세포를 섞는다.</li>
	<li>300 x g에서15 분 동안 원심 분리기. 이것은 초기 원심 분리보다 훨씬 부드러운 원심 분리입니다.</li>
	<li>어두운/검은색 배경에 튜브를 보고 펠릿을 시각화합니다. 진공 포부 또는 파이펫으로 상체를 제거합니다(그림3A). 상체를 폐기하여 휘청빛 색PBMC 펠릿 위에 약 500 μL의 부피를 남깁니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> 그림 3: PBMC 펠릿. (A)제1세척단계에서 얻은 펠릿(3.3). (B)제2 세척(3.7단계)에서 분리된 펠릿. (C)혈액으로부터 4시간 이상 처리된 혈액으로부터 얻은 높은 수준의 혈류를 가진 펠릿은 제2 세척(3.6단계)에서 분리된 혈액 추첨으로부터 분리된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="4"><li>잔류 상수에서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 셀 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>1x PBS를 추가하여 볼륨을 10mL로 가져옵니다. 튜브를 캡. 튜브를 부드럽게 5배 반전시켜 세포를 섞는다. 연구 프로토콜에서 세포 계수가 필요한 경우 3.5.1 단계로 이동하면 필요하지 않은 경우 3.6 단계로 직접 이동하십시오.<ol>
<li>다시 매달린 셀의 40 μL 알리쿼트(aliquot)를 가져와서 40 μL의 트라이팬 블루와 섞습니다. 혈전계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>300 x g에서10 분 동안 3.5 단계에서 서스펜션원심분리. 셀 펠릿을 방해하지 않고 합리적으로 가능한 만큼 상체를 제거하십시오.</li>
	<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 미세 한 팁 파스퇴르 파이펫 또는 마이크로 파이프를 사용하여 파이펫을 사용하여 셀 펠릿 위에 남아있는 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 완료한 후 펠릿 위에 액체를 거의 또는 전혀 남기지 마십시오. 이 프로토콜의 끝점이 PBMC 펠릿이 3.8 단계로 이동하는 경우; 종점이 극저온 보존된 경우 PBMC는 3.10 단계로 이동합니다.</li>
	<li>새로운 PBS의 50 μL을 추가 (또는 끝점에 적용 하는 경우 단계 1.5에서 준비 된 보충 PBS) 펠 릿과 파이펫을 사용 하 여 부드럽게 모든 세포를 재일시 중단 하는 마이크로 피펫을 사용 하 여. 전체 셀 서스펜션을 1.5mL 극저온으로 옮기고 샘플을 동결할 때까지 즉시 젖은 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>표시된 샘플을 액체 질소 또는 드라이 아이스에 직접 배치하여 동결합니다. 세포는 또한 셀 동결 상자를 사용하여 -80 °C 냉동고에서 냉동 될 수있다. 이 경우, 세포관을 첨가하기 전에 -80°C에서 상자를 완전히 미리 식힌다. 세포 펠릿이 동결된 시간을 기록합니다. 세포가 얼면 -80°C에 저장하여 드라이 아이스에 얼어 붙은 배를 넣습니다.</li>
	<li>선택적으로, PBMC가 동결 혼합물(1.6단계)의 1mL에서 펠릿을 재중단시키고 표지된 극저온으로 이송한다. 3.9 단계에서 설명된 대로 계속되지만,이 경우 셀 동결 상자를 사용하여 샘플을 동결하는 것만으로 허용됩니다. 최소 24시간 동안 동결 상자에 들어서고 후 배송 및 보관을 위해 액체 질소로 옮겨.</li>
</ol>4. 플라즈마 준비 단계(그림 1A)
<ol><li>PBMC 펠릿의 -80°C 저장에 따라, 이제 일시적으로 2.6단계에서 젖은 얼음에 저장된 플라즈마 알리쿼트를 준비한다. 샘플의 목적이 ctDNA 분석인 경우 플라즈마를 명확히 하기 위해 다음 원심분리 단계를 수행하되 그렇지 않으면 4.2단계로 직접 이동한다.<ol>
<li>고정 각도 로터에서 10 분 - 4 - 8 ° C에서 10 분 동안 플라즈마를 원심 분리합니다 (또는 스윙 아웃 로터에서 15 분).</li>
		<li>조심스럽게 플라즈마 상류체에서 파이펫, 어떤 펠릿을 방해하고 새로운 15 mL 튜브로 전송하지 않도록주의. 펠릿 소재를 포함하는 튜브를 폐기합니다.</li>
		<li>고정 각도 로터에서 10 분 - 4 - 8 ° C에서 10 분 동안 플라즈마를 원심 분리합니다 (또는 스윙 아웃 로터에서 15 분).</li>
		<li>플라즈마 상체를 새로운 15mL 튜브로 조심스럽게 옮기고 펠릿 소재를 방해하지 않도록 합니다. 펠릿 소재를 포함하는 튜브를 폐기합니다. 참고: 냉장 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 각 스핀 또는 콜드룸의 원심분리기 샘플 사이에 5분 동안 얼음 위에 세포를 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라즈마를 1mL 알리쿼트에서 5개의 신선한 2mL 마이크로튜브로 전송합니다. 1mL 알리쿼트로 5개의 바이알을 채울 플라즈마가 충분하지 않은 경우 5개 미만의 바이알을 사용하며 마지막 유리병은 1mL 플라즈마 미만을 함유할 것으로 예상됩니다. 5mL 이상의 플라즈마가 있는 경우 나머지는 폐기하십시오. 각 튜브에서 플라즈마의 총 부피를 기록합니다.</li>
	<li>플라즈마 알리인용을 -80°C로 보관하여 즉시 똑바로 고정하십시오.</li>
</ol>5. 샘플 발송물
<ol><li>PBMC 펠릿과 플라즈마 샘플을 드라이 아이스에 모두 발송합니다.</li>
	<li>시료가 발송 전과 도중 해동되지 않았는지 확인합니다. 운송 중에 발생할 수 있는 지연을 고려하여 시료와 충분한 드라이 아이스를 포장하여 운송 프로세스 전체에 대해 냉동 상태를 유지합니다.</li>
</ol>6. DDR 바이오마커의 전혈 조사 및 서부 얼룩 분석(도 4A)
참고: 이것은 진료소에 있는 대부분의 경우에 필요하지 않을 ex vivo 처리입니다, 그러나 이 실험은 적당한 임상 biomarkers를 찾아내기 위하여 귀중한 탐사 전략입니다. 혈액 샘플은 최상의 결과를 보장하기 위해 수집 시 가능한 한 빨리 처리되어야 합니다.
<ol><li>X선 캐비닛을 따뜻하게 합니다. 각각 0, 0.2 및 7 Gy로 세 개의 15 mL 튜브를 라벨.</li>
	<li>한 개인에게서 갓 뽑은 혈액을 포함하는 3개의 단핵 세포 준비 관을 취하고 관을 부드럽게 반전한 후에 8 10 회 혈액을 3개의 15 mL 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>0.2 Gy 튜브를 X선 캐비닛에 놓고 문을 닫고 선반 번호와 용량을 선택하여 튜브에 0.2 Gy 용량을 적용합니다. 캐비닛에서 선택한 용량을 조정하여 7 Gy 튜브에 7 Gy 방사선 량을 적용합니다.</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 3개의 튜브를 배양합니다.</li>
	<li>혈액을 다시 단일핵 세포 제제 튜브로 이송하고 2.4 단계에서 3.8 단계로 임상 설정에 관해서는 PBMC 준비 프로토콜을 수행한다.</li>
	<li>각 셀 펠릿에 프로테아제 및 포스파아제 억제제(RIPA 버퍼의 70μL)로 보충된 용액 버퍼의 부피를 각 세포 펠릿에 추가하고, 파이펫을 위아래로 10분 간 얼음에 배양한다. 초음파 처리기가 사용 가능한 경우 샘플을 초음파 처리 (3 사이클, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), 대안적으로 샘플의 점도를 제거하기 위해 핵산을 깰 샘플을 주사기를 주사기를.</li>
	<li>원심 분리는 4 °C에서 ≥ 15,000 x g에서10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 각 상체를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고, 질적으로 혈류(육안 검사)의 수준을 평가하고, 선호하는 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다.</li>
	<li>총 40μg의 sDS 및 샘플 감소제를 포함하는 샘플 적재 버퍼와 혼합합니다. 열 블록에서 5 분 동안 샘플을 끓입니다.</li>
	<li>4-12% 비스 트리스 단백질 젤에 차선당 각 샘플의 20 μg를 복제하고 SDS-PAGE를 실행합니다.</li>
	<li>분리 후, 상용 시스템을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 옮기고(20V, 10분) TBST에서 5%의 우유로 차단한다.</li>
	<li>관련 분자 크기에서 멤브레인을 자르고 4 °C에서 하룻밤 동안 1 차 항체와 배양하십시오 (항체 및 희석을위한 재료 표 참조).</li>
	<li>1 차적인 항체를 제거하고 실온에서 5 분 동안 TBST로 멤브레인을 3 번 세척하십시오. HRP-컨쥬게이드 이차 항체와 함께 실온에서 45분 동안 배양한다.</li>
	<li>TBST로 3회 5분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>ECL 시약을 적용하고 HRP 신호에 비해 얻은 이미지를 분석합니다.</li>
</ol>

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모든 저자는 아스트라제네카의 직원이자 스테이크 소유자입니다. VM은 아세르타 제약의 직원이며 아스트라제네카와 길르앗 과학의 주식을 소유하고 있습니다.

임상 시험 현장에서 견고하고 재현적으로 제조할 수 있는 PBMC및 플라즈마의 고품질 제제는 임상 시험 주변 예측 및 약동적인 번역 바이오마커 종점을 알리는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 임상 시험 환경에서 실행 오류에 취약한 일반적으로 문제가되는 단계를 해결하는 짧고 명확한 프로토콜을 제공했습니다. 그러나, 프로토콜은 임상 현장이나 다운스트림 분석유형의 시간 제약조건과 같은 특정 요구 사항을 충족하도록 더욱 최적화될 수 있다(보충 파일참조).
이를 위해 단핵세포 제제튜브를 이용하여 PBMC와 플라즈마를 전혈에서 분리하여 다양한 다운스트림 분석에 적합한 냉동 PBMC 펠릿과 냉동 플라즈마를 생산하는 방법을 보여주었습니다. 우리는 단계 2.5에서 PBMC 층의 원심 분리 및 식별을 포함하는 특히 중요한 프로토콜 단계와 3.3 및 3.6 단계에서 PBMC 펠릿에주의를 기울였습니다. 역사적으로, 임상 사이트가 종종 잘못된 경우 올바른 단위 (RCF 또는 X g 값을 RPM 값으로 혼동)로 원심분리기를 설정하는 것입니다, 혈액 샘플의 처리를 지연, 온도 및 냉동 된 세포 펠릿 위의 PBS의 대량의 존재. 대부분의 원심분리기 로터는 RPM 설정으로 x g 값을 잘못 입력하면 PBMC 층이 제대로 정의되지 않거나 결석한 PBMC 층과 함께 상당한 저심분리가 발생하고 비효율적인 세포 펠릿화로 인해 세척 단계에서 의도하지 않은 PBMC가 폐기될 수 있습니다. 그러나, 환자가 백혈병을 개발한 경우 적절한 원심분리 설정 및 로터 어댑터를 사용했음에도 불구하고 PBMC 층이 보이지 않을 가능성이 있다. 이 조건은 화학요법 또는 방사선 치료 때문에 종양학 예심에 등록된 환자에 영향을 미칠 수 있고 고려되어야 합니다. 프로토콜에서 명확히 된 또 다른 중요한 점은 혈액 무승부에서 1-2 시간 이내에 샘플을 처리하여 용혈이 프로토콜에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 감소시켜야한다는 것입니다. 더욱이, 혈액 드로우의 첫 번째 시간 동안 시료를 처리하는 것을 목표로 하는 것은 전 생체 내 가변성을 감소시키며, 이는 약동학 판독및 혈액 보존 또는 활성 신호 경로에 의해 영향을 받는 바이오마커에 큰 영향을 미칠 수 있는 4도에도시된 경우와 같은 것이다. 세포가 냉동 보존 될 것 인 경우 샘플 처리의 지연은 세포 생존능력에 해로운 영향을 미칠 수있습니다(34). 수율과 적혈구 오염에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요인은 실온(18-25°C)에서 보관해야 하는 저장 및 원심분리 온도입니다. 낮은 온도는 밀도 그라데이션 매체의 밀도를 증가, 이러한 세포뿐만 아니라 집계하지 않기 때문에 적혈구와 과립 세포 오염의 높은 정도를 초래. 한편, 더 높은 온도는 응집된 적혈구 사이에 갇힌 PBMC로 이어지므로준비(15,27,28)의수율을 감소시킵니다. 그리고 마지막으로, 이러한 PBMC 제제의 하류 처리에서 얻은 단백질 용액의 농도에 부정적인 영향을 미치기 때문에 50-100 μL 이하의 액체가 극저온에서 세포 펠릿에 존재하지 않는 것이 중요합니다. 액체의 과잉은 바이오 마커 분석에 적합하지 않은 매우 낮은 단백질 농도로 용액으로 이어지는 샘플을 과도하게 희석합니다. 또한, 번역 후 수정의 보존이 손상되고, 용해의 효율성도 크게 감소될 것이다.
단핵 세포 준비 튜브는 우리의 경험에서 우수한 재현성을 가진 임상 시험을 위한 단 하나 혈액 무승부에서 PBMC와 플라즈마둘 다 격리하는 가장 간단한 방법을 제공하기 때문에 선택되었습니다. 혈액 처리는 고도로 훈련된 연산자가 필요하지 않으며, 단일 튜브의 사용은 혈액과 다른 튜브로의 이송을 희석할 필요성을 제거하여 위험 위험을 낮춥니까; 브레이크가 있는 원심분리 단계를 수행하기 때문에 프로토콜을 단축; 모든 시약은 튜브에 있어 가변성을 줄입니다. 우리의 경험에서, 이러한 혜택은 밀도 그라데이션 분리 매체27,28 (60 단위 당 £ 410 의 사용을 포함하는 다른 고전적인 방법에 비해 이러한 튜브의 높은 비용을 능가66 50-mL 준비에 대한 림프 준비 매체는 £ 215입니다). 이들은 두 가지 유형의 항응고제, 헤파린 및 구연산염으로 제공되며, 둘 다 격리된 PBMC35의기능을 유지하는 데 필적하며, 따라서 한 항응고제의 선택은 다운스트림 바이오마커 연구에서 헤파린 또는 구연산의 가능한 영향에 기초하게 될 것이다. EDTA 튜브가 헤파린 또는구연산13에비해 PBMC 격리 율이 가장 높은 것으로 나타났지만, 1관 전용 조작 의 사용 편의성의 이점은 이러한 고려 사항의 균형을 이뤄낸다. 사이토카인이 분석될 경우 항응고제는 플라즈마에서 검출된 수준의 효과를 가질 수 있으므로 임상시험(36)을선택하기 전에 두 항응고제를 모두 테스트해야 한다. 플라즈마가 메타볼로믹스 연구에 사용될 경우, 헤파린을 항응고제로 사용하는 것이 바람직할것이다(37). 따라서 최종 사용자 또는 임상 시험 번역 과학자에게 남은 유일한 점은 구연산또는 헤파린이 비용을 평가한 후에 그들의 목적을 위해 더 적합할지 여부입니다.
세포 준비 튜브를 사용하는 이점은 그들이 제기하는 한계에 비해 많은 반면 (항응고제의 제한된 범위의 높은 비용 및 가용성), 임상 시험에서 PD 바이오 마커를 얻기 위해 PBMC 또는 플라즈마의 사용의 주요 제한, 특히 종양학에서, 격리 방법과 관련이있을 수 있습니다. 종양이 말초 혈액에서 직접 샘플링되는 혈액학적 암을 제외하고, 다른 암 징후 플라즈마 및 PBMC는 반드시 1 차 종양을 모방하지 않는 대리 조직입니다. 말초 조직은 1 차종양과 게놈 및 후성유전체를 공유하지 않을 수 있으므로, 특정 종양 돌연변이에 의존하는 바이오마커의 말초 분석은 주로 ctDNA 분석(혈장에서) 또는 CTC(PBMC 층의 후속 정렬에 의하여)로 제한됩니다. 또한, 종양 증식을 구동하거나 기여하는 캐스케이드를 신호하는 것은 말초 혈액에서 활성화되지 않을 수 있다. 이러한 과제는 혈액8을 대상으로 바이오마커 발견 접근법을 적용하여 대체 바이오마커를 식별하거나 전 생체 내 치료를 플라즈마38 및 PBMC제제(26)의격리에 결합함으로써 극복할 수 있다.
현재 프로토콜에서 냉동 PBMC 펠릿은 서양 블로팅 또는 ELISA 기술에 의해 평가될 수 있는 단백질 리세이를 제공하기 위해 임상 부위에서 쉽게 처리될 수 있다. IHC 메서드를 활성화 하기 위해 PBMC를 사용 하 여 다른 방법 도 제시 되었습니다(보충 파일). 또한 면역 세포 모니터링을 위한 PBMC(보충 파일참조)의 가능성을 상세히 설명했으며, 종양학분야의 관련 응용 분야인 면역 검사점 억제제 및 ADC가 임상 시험에서 점점 더 많이 테스트되고 있습니다. ADCC(16) 및 면역페노티핑과 같은 면역 기능의 평가는 단핵 세포 준비튜브(15)로부터분리된 냉동 보존 PBMC와 호환되는 응용 응용이다. 특정 표면 및 내부 마커의 하향 조절을 촉진하고 특정 세포 기능을 손상시킬 수 있으므로 냉동 보존에 주의해야 하지만, PBMC 냉동 보존은 여러 임상 부위로부터 시료를 처리할 때 시간 제약으로 인해 이러한 실험을 수행할 수 있는 유일한 실현 가능한방법이며,이러한 해로운 효과는 좋은 해빙 방법 및39의양해한 방법으로 크게 극복할 수 있다.
결론적으로, 여기에 제공된 프로토콜은 말초 혈액에서 의 번역 종점이 글로벌 임상 시험에서 강력하게 활성화 될 수 있도록 공통 장비 및 재료와 모든 임상 기관에서 PBMC및 플라즈마 샘플의 신뢰할 수있는 준비를 할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 PBMC lysates의 분석이 임상 발달을 형성하는 데 사용할 수있는 주요 DDR 요인의 용량 의존 적 번역 후 수정을 보여줌으로써 DNA 손상 제에 대한 반응을 기계적으로 알릴 수있는 방법을 보여줍니다. 미래 지향적, 서양 블로팅(예를 들어, 질량분석법 40)보다양적및 덜 입력 물질(예: 모세관 서부 블로팅 및 ELISA)을 필요로 하는 방법의 구현은 이러한 전임상 결과를 PBMC 환자 샘플의 보다 강력하고 체계적인 평가로 이동하는 데 도움이 될 것이다.

신약 개발은 충족되지 않은 의료 적 요구와 보다 표적화된 맞춤형 의학을 다루는 새로운 치료법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 다중 약물 기전은 키나아제1,프로테아제2,또는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP) 억제제3,단백질 분해제4,치료항체5,항체-공주약물(ADC)6,그 외 로의 효소 억제를 포함하는 활성 조사를 받고 있다. 종양학에서 더 나은 치료를 얻기 위한 노력의 예는 암세포가1,7로확산되는 신호 캐스케이드를 중지하는 것을 목표로 키나아제 억제제의 사용이다. 이러한 키나아제에 특이적인 기판 인산화의 수준을 측정하는 것은 이들 억제제의 작용 메커니즘을 정량화하는 최고의 약력학적바이오마커이다 8. 다른 약물은 주어진 단백질의 발현을 조절할 수 있으며, 이 경우 치료 과정 전반에 걸쳐 표적 단백질의 농도 변화를 세로로 정량화할 수 있는 것이 가장 중요하다. 따라서 약물 또는 병리학의 특성과는 별개로 약물 노출과 표적 변조 사이의 약동학(PK)/약역학(PD) 관계를 확립하기 위한 바이오마커의 평가는 초기 임상 개발에서 모범 사례이며 안전하고 용대한 약리활성 용량/일정9의결정을 가능하게 한다.
종양학 임상 개발에 있는 동안, 생검에 있는 biomarker 분석은 약의 기계장치의 증명을 확립하기 위하여 제일 설정일지도 모르지만, 예심에 있는 유효한 생검의 수는 일반적으로 아주 제한된10,11입니다. 대안적으로, 말초 혈액 샘플은 최소한의 침습적 절차를 수반하고, 종로 분석을 용이하게 하기 쉽고, 생검보다 저렴하며, 치료의 결과를 실시간으로 모니터링하기 위한 방대한 정보를 제공하기 때문에 임상 시험에 매우 중요합니다. 말초 혈액에서 PD 바이오마커를 평가하는 추가적인 이점은 PK/PD 정량적 관계 및 후속 PK/PD 모델링12,13을결정하는 정확한 기능을 허용하는 PK를 정량화하기 위해 바이오샘플을 사용하는 능력이다. 전혈의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 발현 수준 또는 번역 후 수정의 변화를 경험하는 단백질 마커를 연구하기 위해 격리 될 수 있습니다. 또한, PBMC는 RNA 절연을 통해 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC) 16 및 후성유전학 적 분석을 평가하는 것과 같은 면역페노티핑 목적14, 15,면역 기능 성 분석에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 전혈에서 혈장은 환자의 면역 반응을 특성화하고, 대사 연구를 수행하고, 또한 치료약제로부터 선택하에 질병의 클론 진화를 모니터링하기 위한 종양 DNA(ctDNA)를 분리 및 서열화하기 위해 사이토카인을 정량화하는 데 사용될 수 있으며,치료저항성 17,18,19세대의 후속 치료제 개발을 가능하게 한다. 마지막으로, 말초 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)의 분리는 세로 열거, DNA/RNA 염기서열분석 및 단백질-바이오마커분석(21)에의한 질병 진행의 평가를 가능하게 한다. 이러한 격리는 본 명세서에서기재된 프로토콜과 호환되지만, 많은 암 유형 및 초기 단계에서 CTC의 낮은 풍부는 CTC분해(23)를최소화하기 에 더 적합한 전문 튜브의 사용을 만든다.
최근 몇 년 동안, 액체 생검의 사용은 임상 시험및 PBMC 수집에서 얻은 정보를 개선하여 일부 유형의 혈액학적 악성 종양에 대한 종양 세포에서 직접 표적 참여 및 메커니즘의 증거를 모니터링하거나,24,25,26의PD 대리로서 PBMC 자체에 포함되었다. 고품질 시료의 제조는 주어진 병리학에 대한 가장 안전하고 가장 효과적인 치료를 결정하는 데 긍정적 으로 영향을 미치지만, 우리의 경험에서, 다른 임상 사이트에서 얻은 PBMC 준비의 품질은 다운스트림 분석의 목적에 맞지 않는 샘플의 결과로 품질에 넓은 가변성을 겪고있다. 이것은 그 연구 결과에서 수집될 수 있는 PD 데이터의 양에 영향을 미쳤습니다.
여기서 우리는 임상 환경에서 단일 혈액 무승부에서 PBMC와 플라즈마 샘플을 효율적으로 분리하는 방법을 보여주는 프로토콜을 쉽게 따르기 쉬운 것을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 원심분리 문제, 처리 지연 및 극저온으로의 샘플 전송과 같은 임상 사이트에서 보고한 프로토콜 실행의 어려움을 실제 경험이 강조한 수정을 통합하는 단일 핵 세포 준비 튜브 제조업체의 지침을 기반으로 합니다. 혈액(27)으로부터용액을 분리하는 장벽 유무에 관계없이 다당류 용액을 이용한 밀도 그라데이션 분리를 기반으로 한 단일핵 세포 제제 튜브의 사용에 대한 대체 상업적 사용 방법이 있다. 관련 임상 사이트가 이미 이러한 대체 방법론에서 경험이 부족한 경우, 이 프로토콜은 이 프로토콜을 이와 함께 받아들일 수 있게 대체할 수 있다. 이러한 경우, 두 가지 요인을 고려할 수 있다: 일부 대체 방법은 인간 1차 생물학적 물질의 추가 전달이 약간 증가한 안전 위험을 초래할 수 있는 별도의 준비 튜브로 전혈의 전혈을 전달해야 하며, 다당류 용액으로부터 혈액을 분리하는 장벽이 없는 방법의 성공은 항상 정제되지 않은 실험실 의 정제 된 수준의 개발을 필요로 하는 밀도 그라데이션 매체에 혈액 샘플을 겹쳐 올리는 것과 같은 중요한 단계에 의존한다. 위의 점에도 불구하고, 전반적인 생존력과 세포 회수는 이러한기술(15,28)과비교된다. 방법론의 선택은, 그러므로, 이전 기술 경험에 다소 의존적이지만, 우리의 손에, 단핵 세포 준비 튜브는 광범위한 임상 맥락에서 성공적으로 사용될 수 있고, 그렇지 않으면, 추천입니다.
이 프로토콜의 한 종점은 용액으로의 추가 처리를 위한 PBMC 펠릿을 생성하는 것이지만, PBMC 수집의 다른 최종 응용 은 핵산의 격리, 또는 면역 히스토케미크(IHC) 방법에 적합한 PBMC 얼룩 또는 PBMC 블록을 생성하는 것과 같은 구현될 수 있었다. 중요한 것은, 환자로부터 채취한 각 생체샘플은 적어도 어느 정도 침습적인 절차를 나타내기 때문에, 이 프로토콜은 사이토카인 분석, 메타볼로믹 연구 또는 ctDNA 시퀀싱에 사용될 수 있는 플라즈마를 격리하여 각 시료로부터 유용한 물질을 극대화한다.
종양학 예심에 있는 말초 바이오마커의 분석은 PBMC 용재의 많은 응용의 한개입니다. 한 가지 예는 화학요법, 방사선 요법 또는 인산다이들리노시톨-3 키나제 관련 키나아제(PIKKs)7 및 PARPs3,13과같은 DDR에 관여하는 효소의 억제제의 사용과 같은 치료에서 DNA 손상 반응(DDR)의 평가이다. 이러한 치료의 목적은 암세포와 같은 손상된 DDR 메커니즘 및 세포 주기 검사점을 가진 세포에서 높은 독성을 생성하는 증식 세포에서 DNA 손상을 증가시키는 것입니다. 여기서 우리는 엑스레이를 실시하는 말초 혈액에 있는 DDR biomarkers의 연구 결과와 예를 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL cryovial</td><td>Nalgene, ThermoFisher</td><td>5000-1020</td><td>PBMC 펠릿 및 재현탁액 PBMC 보관용</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td>예를 들어, 선호하는 제공업체</td></tr><tr><td>15 mL 원추형 멸균 프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Nunc, ThermoFisher 339651</td><td></td><td>다른 브랜드는</td></tr> 캡<tr><td>이 부착된</td> <td>2 mL 스크류 캡 튜브 멸균 가능ThermoFisher</td><td>3463</td><td>플라즈마 분취량</td></tr><tr><td>20X TBS 버퍼</td>용 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>28358</td><td>Final은 25mM Tris, 0.15M NaCl, pH 7.5입니다. 이것은 예를 들어, 자신의 재고를 준비하거나 다른 공급자를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28360</td><td>또는 TBS 버퍼를 준비하기 위해 0.05 %로 TBS를 보충</td></tr><tr><td>자동 세포 카운터 또는 혈구 측정기</td><td>ThermoScientific</td><td>AMQAX1000</td><td>우리는 Countess 장치와 슬라이드를 사용하지만 다른 방법 일 수 있습니다.</td></tr><tr><td>조정 가능한 마이크로피펫으로 50 &마이크로; L 측정</td><td></td><td></td><td>소량 처리(예: 웨스턴 블롯, PBMC 펠릿을 1.5mL 튜브로 이동)BD</td></tr> <tr><td>Vacutainer CPT 단핵 세포 준비 튜브(Na-구연산염 또는 Na-헤파린) 8mL</td><td>BD</td><td>362761, 362753</td><td>4mL 튜브가 있지만 단일 채혈에서 더 많은 PBMC를 얻으려면 가능한 경우 8mL 튜브를 사용하는 것이 좋습니다</td></tr>. 세포 <tr><td>동결 상자</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>예를 들어 선호하는 공급자를 사용합니다.</td></tr><tr><td>원심분리 장치 변환기</td><td>LabTools</td><td></td><td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>D2438</td><td>선호하는 공급자를 사용하십시오. PBMC 동결 보존용</td></tr><tr><td>ECL 양고추냉이 과산화효소 기질</td>: <td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>웨스턴 블롯으로 바이오마커를 검출하는 데 필요한 감도에 따라 선호하는 시약을 사용하십시오. 이미징 시스템과 함께 IRDye 2차 항체와 같은 다른 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Faxitron MultiFocus X-ray 캐비닛</td><td>Faxitron Bioptics</td><td></td><td>혈액을 조사합니다. 다른 모델/제조사는</td></tr><tr><td>소태아혈청(FBS), 열비활성화</td><td>ThermoScientific</td><td>102706</td><td>선호하는 제공업체를 사용할 수 있습니다. PBMC 동결 보존을 위한 Ued</td></tr><tr><td>파인 팁, 멸균 1.5mL 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>414004-018</td><td>옵션</td></tr><tr><td>고정각 로터 원심분리기</td><td></td><td></td><td>ctDNA/대사체학을 위한 플라즈마 준비용 옵션</td></tr><tr><td>겔 독 이미징 시스템</td><td>SYNGENE</td><td></td><td>이미징용 HRP 개발 멤브레인</td></tr><tr><td>히트 블록</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블롯에서 실행하기 전에 용해물을 변성시키려면 적절한 튜브 어댑터가 장착된 모든 제조업체</td></tr><tr><td>수평 로터(스윙 아웃 헤드) 원심분리기</td><td>Thermoscientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>이것은 예입니다</td></tr><tr><td>액체 질소/드라이 아이스</td><td></td><td></td><td>샘플 급속 동결 마</td></tr><tr><td>블 건조 탈지유</td><td>프리미어 식품</td><td></td><td>이것은 예입니다. 선호하는 공급업체</td></tr><tr><td>를 사용하십시오.범위 1-200 &micro용 마이크로피펫 팁; L</td><td></td><td></td><td>소량 처리(예: 웨스턴 블롯, PBMC 펠릿을 1.5mL 튜브로 이동)NuPAGE</td></tr> <tr><td>4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1mm, 10</td>웰 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>이것은 직접 주조하거나 선호하는 공급업체를 사용하십시오</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>HRP에서 개발한 멤브레인 이미징용</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>이것은 예입니다.</td></tr><tr><td>PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco, ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>이것은 일반적으로 임상 키트에 제공됩니다.</td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일 2</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P5726-1ML</td><td>3.7단계 선택</td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일 3</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P0044-1ML</td><td>3.7단계 선택 사항</td></tr><tr><td>토끼 항 GAPDH</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>CST 2128</td><td>1:1000 5% 우유 TBST</td></tr><tr><td>토끼 항 및 감마에 희석; H2AX</td><td>세포 신호 기술</td><td>CST 2577, lot 11</td><td>1:2000 5% 우유 TBST</td></tr><tr><td>Rabbit anti pS1981 ATM</td><td>Abcam</td><td>ab81292</td><td>1:2000 5% 우유 TBST</td></tr><tr><td>Rabbit anti pS635 RAD50</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>CST 14223</td><td>1:1000 5% 우유 TBST</td></tr><tr><td>Rabbit anti total ATM</td><td>Abcam</td><td>ab32420</td><td>1:1000 5% 우유 TBST</td></tr><tr><td>Rabbit anti 총 RAD50</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>CST 3427, 로트 2</td><td>1:1000 희석 5 % 우유 TBST</td></tr><tr><td>RIPA 완충액</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>R0278-50ML</td><td>세포 용해용. 이것은 예를 들어, 선호하는 공급자</td></tr><tr><td>인 Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>30 초 켜짐 / 30 초 꺼짐, 4 oC에서 3 사이클 동안 사용됩니다. 다른 악기를 사용하는 경우 초음파 처리기에 따라 사이클 수와 강도를 조정하십시오.</td></tr><tr><td>멸균 1.7 mL 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>414004-030</td><td>이것은 예이며, 선호하는 공급자를 사용하십시오</td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫 (5 및 10 mL 용량)</td><td>Costar</td><td>4101, 4051</td><td>이것은 예이며, 선호하는 공급자</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoScientific</td><td>T10282</td>를 사용하십시오 <td>이것은 위에 나열된 자동화 된 세포 계수기를 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>젖은 얼음</td><td></td><td></td><td>혈장 샘플과 용해물을 차갑게 유지하기 위해</td></tr></tbody></table>

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

말초 혈액에 있는 biomarkers의 분석은 처리의 효력을 평가하기 위하여 기계장치의 증명을 확립하기 위하여 임상 시험에서 점점 더 중요해지고 있습니다, 및 치료의 복용량 및 일정 설정을 안내하는 것을 돕습니다. 단일 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포는 단백질 마커를 분석하고 정량화하기 위해 분리 및 처리 될 수 있으며, 혈장 샘플은 순환 종양 DNA, 사이토카인 및 혈장 메타볼로믹스의 분석에 사용될 수 있다. 치료로부터의 경도 샘플은 주어진 단백질 마커의 진화, 환자의 돌연변이 상태 및 면역 학적 풍경에 대한 정보를 제공한다. 이것은 말초 혈액의 처리가 임상 현장에서 효과적으로 수행되고 견본이 침대 옆에서 벤치로 제대로 보존되는 경우에 달성될 수 있습니다. 여기서는 다중 센터 임상 시험에서 PBMC 펠릿 및 플라즈마 샘플을 얻기 위한 임상 현장에서 구현할 수 있는 최적화된 범용 프로토콜을 제시하여 병원 실험실의 임상 전문가가 기술 적 전문 지식 수준에 관계없이 고품질 샘플을 성공적으로 제공할 수 있도록 합니다. 보다 구체적인 다운스트림 분석 방법에 최적화된 대체 프로토콜 변형도 표시됩니다. 우리는 DDR 약물 및 / 또는 방사선 요법이 실행된 종양학 설정에서 접근법의 적합성을 입증하기 위해 X 선 조사 혈액에 DNA 손상 반응 (DDR)에 대한 단백질 바이오 마커를 연구하기위한이 프로토콜을 적용하고 기계적 가설 테스트가 필요한 전임상 단계에서도.

임상 시험에서 PBMC 제제의 품질을 향상시키기 위해 분자 생물학 배경 및 실험실 기술과는 별개로 병원 실험실 전문가가 뒤따를 수 있는 간결하고 명확한 단계를 갖춘 프로토콜을 생성했습니다. 우리는 실행 문제가 확인되거나 다양한 다중 센터 임상 시험에 관련된 임상 사이트에서보고 된 그 단계에 수정을 통합 제조 업체의 프로토콜을 조정했다. 그러나, 프로토콜은 임상 부위또는 다운스트림 분석 유형의 시간 제약조건과 같은 특정 요구 사항을 충족하도록 더욱 최적화될 수 있다(보충 파일참조). 우리는 DDR이 방사선에 의해 생성된 DNA 손상에 대한 특정 바이오마커를 보고 PBMC에서 분석될 수 있다는 것을 보여줍니다.
임상 사이트에서 받은 가장 일반적인 쿼리는 원심 분리 단계와 관련이 있으며, 이는 PBMC를 성공적으로 격리하고 최종 PBMC 펠릿을 얻을 수 있는 것에 직접적인 영향을 미칩니다. 적절한 유형의 스윙 아웃 헤드 로터 원심분리기(도1B,C)를이용하여 프로토콜의 성공의 열쇠이다. 그러나, 임상 현장에서 고정 각도 로터 원심분리기만 사용할 수 있는 경우, 스윙아웃 헤드 로터와 동일한 RCF의 고정 각 로터에서 2.4단계를 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 PBMC 층이 플라즈마에서 분리되도록 합니다(그림 2B, C참조). 밀도 그라데이션 분리 매체에 혈액을 겹쳐서 브레이크 오프 원심분리가 필요하지만, 단일핵 세포 준비 관의 혈액은 밀도가 높은 혈액성분(27,28)으로부터분리된 PBMC 층의 보존을 보장하는 튜브내젤 장벽의 존재로 인해 브레이크로 원심분리될 수 있다.
적어도 4mL이상의 고품질, 비희석 플라즈마는 8mL 튜브 형식에서 혈액의 원심분리로부터 얻어졌으며, 이는 ctDNA 염기서열 분석 또는 메타볼로믹스 연구29,30(선택적 단계 4.1.1-4.4)과 같은 전문 적인 분석에서 의 사용을 더욱 명확히 할 수 있었다. 격리된 PBMC의 양, 펠릿 및 혈류 또는 적혈구 오염의 크기는 임상 현장에서 오는 다른 관심사이며 샘플을 분석하는 경험이었습니다. 8mL 혈액으로부터 얻은 세포의 수는 환자 및 질병 설정에 따라 변변적이었지만, 일반적으로 얻은 펠릿의 크기는 작고 투명/백색 착색(도3A, B). 이러한 특성으로 인해, 세척 단계 (2.5 및 3.3)동안 우발적 인 포부를 피하기 위해 어두운 배경에 대한 펠릿을 시각화하는 것이 중요합니다. 때로는 펠릿이 적혈구오염(도 3C)으로인해 적색을 가질 수 있으며, 이는 제제의 품질에 부정적인 영향을 미친다. 도 3에나타난 것과 같은 작은 펠릿을 잃지 않도록 하기 위해 PBMC 펠릿을 극저온으로 옮기는 것은 PBMC 펠릿이 PBS의 50 μL에서 재주중단되는 3.7단계에 의해 촉진된다.
건강한 개인의 이러한 튜브와 혈액을 사용할 때 일반적인 수율은 8 mL에 대해 7 내지 21 x 106 세포 사이, 그리고 70 과 80% 사이의 세포 회복은 우리의 경험이며 이전에27,28로나타내고 있다. 이는 개별 세포 수와 연산자 모두에 따라 달라지며 밀도 그라데이션(분리 장벽을 가진 튜브를 활용하는 시스템 포함)을 사용하는 다른 방법에 의해 얻어진 세포 수 및 세포 회수 값과 비교할 수 있다15,27,28. 질병 설정에 따라 이 방법으로 분리된 PBMC수의 변이에 대한 예는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자에서 PBMC 마커의 분석이다. 본 프로토콜을 적용할 때 8mL 단핵세포 제제 튜브에서 회수된 세포의 수는 연구 NCT0332827331(표 1)에서7명의 환자로부터 얻은 45개의 샘플에서 1.62 x 104에서 1.99 x109로 다양하였다. 관련 파라미터는 이러한 방법에 의해 얻어진 PBMC 리스의 단백질 농도이며, 이는 분리된 세포의 수와 단백질 추출의 효율성에 달려 있다. 6절에 리세드된 세포 펠릿은 RIPA 버퍼 및 초음파 처리(단계 6.6)로 생성되었다. 용해 완충제의 동일한 부피에서 세포 펠릿의 재현은 일반적으로 3 에서 10 mg/mL까지의 농도범위를 초래하며, 이 특정 예에서는 용해 농도가 각각 0, 0.2 및 7 Gy에 대해 6.8, 8.3 및 8.6 mg/mL이었다. 그러나, 이것은 최적으로 준비되지 않은 임상 부위로부터 샘플을 수신할 때 높은 가변성을 겪게 되고, 환자의 질병, 및 적혈구 오염으로부터 헤모글로빈의 존재. 예를 들어, 매우 작은 펠릿은 단백질 농도 측정및 다운스트림 바이오마커 분석을 모두 허용하기 위해 세포 펠릿 부피보다 큰 용액 버퍼의 부피로 재중단되어 더 희석된 시료를 생성합니다. 이러한 경우, 샘플 농도가 1 mg/mL 미만인 경우 이 높은 희석 계수로 인해 서양 블롯과 같은 애무를 수행하는 데 어려움을 초래할 수 있습니다. 대조적으로, 앞서 언급한 CLL 샘플에서, 세포 펠릿을 재보편으로 첨가한 용해 완충제의 부피는 50 에서 500 μL까지 다양하고, 단백질 농도는 1.62 에서 19.77 mg/mL(표1)까지다양하였다.
시료가 적혈구 오염 또는 혈혈(도3C)을제시할 때, PBMC 용액의 단백질 농도는 적혈구로부터 헤모글로빈을 포함시키기 때문에 과대 평가된다. 이것은 프로토콜의 6.7 단계에서 설명된 바와 같이 이러한 샘플의 육안 검사 및 음표화를 수행해야하는 이유입니다. 과량의 로딩 시료는 로딩 제어가 분석에 포함되는 한 바이오마커 분석을 수행할 때 헤모글로빈의 존재를 보상할 수 있다. 414 nm32에서흡수도 측정과 같은 용혈을 측정하는 다른 보다 정량적인 방법이 구현될 수 있다.
DDR은 이러한 임상 프로토콜에 따라 얻은 PBMC에서 분석되었다. 방사선 요법이나 화학요법과 같은 DNA 손상 임상 치료를 모방하는 상황을 설명하기 위해 건강한 지원자로부터 온피가 X선방사선(도 4A)을실시하였다. 엑스레이와 같은 이온화 방사선(IR)은 DNA 이중 가닥 휴식(DSBs)을 포함하여 다양한 유형의 DNA 손상을 유도한다. 이러한 병변의 DNA 손상 감지는 동종 재조합(HR) 또는 비동형 종합(NHEJ)과 같은 DNA 수리 메커니즘을 관여하는 운동실체-텔란지크시아 돌연변이(ATM), ATM 및 Rad3 관련(ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA-PK)와 같은 PIKKs를 활성화합니다. DSB의 존재에 의한 ATM의 활성화는 MRN (MRE11-RAD50-NBS1) 단지에 의한 피해 부위에 대한 모집에 의해 발생하며, Ser1981을 포함한 여러 잔류물에서 ATM 자가 인포스포시오레이션을 유발합니다. 차례로, 활성화된 ATM은 MRN 복합체 및 기타 단백질의 성분을 Ser139(pSer139-H2AX라고도 하는 경우)에 인광하여 다른 DDr 인자333의채용을 용이하게 하는 DSB로부터 의별 한 크로마틴의 구조적 변화를 촉진한다. PBMC는 낮은 증식율과 질량 분석 방법에도 불구하고 이온화 방사선에 반응하여 ATM에 의한 RAD50에 인산화 된 Ser635의 업 규제의 정량화를 허용했습니다. 이러한 인산화는 ATM 억제제및 RAD50 pS635의 존재에서 감소되어 면역화학에 의한 종양내 임상 ATM 억제제 치료를 위한 약력 바이오마커로서 더욱 검증되고있다 8. 방사선에 대한 PBMC의 반응을 평가하기 위해 건강한 지원자로부터의 혈액은 37°C(도4A)에서1h 배양 후 상이한 IR 투여량및 샘플을 수집하였다. 이를 위해, 혈액은 고온(6.2단계)으로 인한 PBMC 절연의 수율을 감소시키는 것을 피하기 위해 플라스틱 튜브로 이송되었다. 우리는 ATM이 이전에 보고된 RAD50 pS635뿐만 아니라 ATM pS1981 및 γH2AX를 보고서 어떻게 활성화되었는지 분석했습니다. 이러한 번역 후 수정의 증가를 조사한 세 가지 경우에서 더 높은 IR 투여량(도4B)에서관찰되었다. 흥미롭게도, ATM과 RAD50의 인산화는 0.2 Gy의 낮은 용량에서 상당했으며, 이는 이러한 번역 후 변형이 종양 샘플뿐만 아니라 말초 혈액에서뿐만 아니라 좋은 동적 범위를 가진 DNA DSB의 생성을 포함하는 치료법을 위한 PD 바이오마커로서 실현 가능하게 심문될 수 있음을 시사한다. 이를 통해 치료 과정을 통해 종방향 샘플을 획득하여 치료에 대한 PD 반응의 모니터링을 가능하게 한다. 시료의 처리에 혈액 무승부에서 타이밍은 처리에 있는 지연이 그 같은 캐스케이드의 운동학에 영향을 미치고 하나 인포마커로 사용된 인산화 사건을 놓칠 수 있기 때문에 이 신호 폭포가 아직도 활성화되어 있는지 확인하기 위하여 중요합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> 도 4: PBMC는 현재 임상 프로토콜에 따른 전 생체 내조사 혈액으로부터 분리된 바이오마커를 표시하여 치료에 의한 DNA 손상의 정도를 알린다. (A)전혈 조사 시 PbMC 의 제제 및 DDR 의 분석을 위한 프로토콜의 회로도 개요. * ctDNA 분석 /메타볼로믹스에 필요한 2 개의 추가 원심 분리 단계. (B)PbMC에서 DDR 인-바이오마커의 투여량 의존성 업레조절을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank"></a> 보여주는 서양 블롯.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>견본</td>
			<td>PBMC 수/8mL 혈액</td>
			<td>보충 RIPA 버퍼 볼륨 (μL)</td>
			<td>최종 농도(mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">7명의 환자에 대응하는 세로 PBMC 견본</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 만성 림프구성 백혈병 환자(CLL)로부터 PBMC 펠릿의 세포 수 및 단백질 농도. 이 표에 제시된 데이터는 단핵세포 준비관에서 채취한 연구 NCT03328273에 참여하는 7명의 CLL 환자로부터 45개의 PBMC 샘플에 해당한다. 이들은 인용된연구(31)의샘플을 사용하여 생성된 원본 데이터이다.
보충 파일: 대체 프로토콜 옵션입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC 및 플라즈마 샘플은 초기 임상 개발에서 획득하기 간단하고 매우 유익합니다. 이 강력한 프로토콜은 임상 현장에서 도입된 사전 분석 가변성을 최소화합니다. 이 프로토콜은 빠르고 쉽기 때문에 혈액을 PbMC 및 플라즈마로 처리하기 위해 기본 실험실 장비와 최소한의 작업자 전문 지식이 필요합니다.그것은 병원에서 바쁜 실험실 일과 호환됩니다. 이 프로토콜에서 유래 된 혈액 성분의 다운스트림 분석은 약물 역학 및 약동적 관계, 약물 투여 량 스케줄링 및 표적 참여 증명을 알리고 약물 행동 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하여 실시간 및 내성 분석을 모두 지원할 수 있습니다. 우리는 특히 DNA 손상 반응 메커니즘을 분석하기 위해 종양학 연구를 위해이 프로토콜을 사용합니다.그러나, 이 프로토콜에 의해 수집된 물질은 많은 질병 지역 및 다중 치료 양식에 걸쳐 관련될 수 있습니다. 샘플 당 기증자 혈액의 8 밀리리터를 받은 후, 혈액이 그려진 시간을 기록하고 방사선에 표지된 각 튜브로 항응고제 처리 혈액 샘플을 전송하기 전에 각 튜브를 8~10회 부드럽게 반전시한다. 임상 샘플의 경우, 튜브를 반전한 직후원심분리합니다.0.2 회색 튜브를 미리 데운 엑스레이 캐비닛에 놓고 문을 닫고 튜브에 0.2 회색 복용량을 적용합니다. 저용량 조사 튜브를 7개의 회색 튜브로 대체하고 복용량을 조정하여 고용량 조사 샘플에 7개의 회색 방사선 량을 적용합니다. 두 샘플을 조사 한 후, 한 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브의 세 가지 모두를 배양.고속 원심분리로 세포를 분리하기 전에 샘플을 셀 준비 튜브로 옮기고, 단위를 x g 또는 동등한 RCF로 설정해야 합니다. 원심 분리 후, 어두운 배경에 대한 튜브를 보고 플라즈마, 적혈구 및 버피 코트 층을 식별합니다. 혈청 피펫을 사용하여 플라즈마의 약 절반을 15 밀리리터 원심 분리기로 옮기고 버피 코트 층을 방해하지 않고 젖은 얼음에 플라즈마 튜브를 저장합니다.그런 다음, 목초지 파이펫을 사용하여 버피 코트 층을 포함하는 전체 PBMC를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 실온 PBS를 PBMC에 샘플 당 15 밀리리터의 최종 부피로 추가합니다. 부드럽게 반전에 의해 세포를 혼합 하고 낮은 속도로 원심 분리에 의해 세포를 수집, 원심 분리 단위를 확인 하 고 있는지 확인. 펠릿을 방해하지 않고 마지막 500 마이크로 리터를 제외한 모든 흡인.신선한 PBS를 각 튜브에 10 밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 부드럽게 반전시켜 다시 중단합니다. 계산을 위해 세포의 40 마이크로 리터 알리쿼트를 사용합니다. 계산 후, 다른 원심 분리와 세포를 수집하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상퍼를 제거합니다.나중에 처리를 위해 PBMC를 저장하려면 부드러운 파이펫팅으로 샘플당 50 마이크로리터의 신선한 PBS로 펠릿을 다시 중단하고 각 셀 서스펜션을 젖은 얼음에 1.5 밀리리터 극저온으로 옮기습니다. 그런 다음 바람직한 방법으로 셀을 얼리고 영하 80도의 동결 상자에 놓습니다. 셀이 동결된 시간을 기록합니다.대안적으로, 샘플 당 1 밀리리터 또는 동결 혼합물에서 펠릿을 다시 중단하고 개별 표지된 극저온으로 세포 현탁액을 전송한다. 그런 다음 튜브와 미리 차가운 냉동 상자를 영하 80도 저장합니다. 플라즈마를 동결하려면 잔류 펠릿을 방해하지 않고 최대 5개의 2밀리리터 마이크로튜브까지 플라즈마를 1밀리리터 알리쿼트까지 추가하고 각 튜브의 플라즈마 총 량을 기록합니다.그런 다음, 즉시 영하 80도 냉동고에서 직립 방향으로 플라즈마 알리쿼트를 동결. 시료의 서양 얼룩 분석을 위해, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 적절한 양의 용액 버퍼로 각 튜브의 펠릿을 부드럽게 파이펫팅으로 보충하고 얼음에서 10 분 동안 세포 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30초 동안 30초로 초음파 처리합니다.원심분리로 샘플을 수집하고 슈퍼네티츠를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 그런 다음 시료당 40 마이크로그램을 적재 버퍼와 혼합하고 샘플을 5분 동안 끓입니다. 4-12%의 비스-트리스 단백질 젤에 차선당 각 샘플 20마이크로그램을 복제하여 SDS-PAGE를 실행합니다.혈액의 8 밀리리터에서 얻은 세포의 수는 환자 및 질병 설정에 따라 다릅니다. 일반적으로, 세포 펠릿은 크기가 작고 투명한 흰색입니다. 때때로 펠릿은 준비의 질에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 적혈구 오염이 있을 수 있습니다.이 프로토콜을 사용하는 만성 림프구성 백혈병 환자의 전형적인 수율은 밀리리터당 1.62 내지 19.77 밀리그램 에 이르는 최종 단백질 농도를 가진 8밀리리터 단일핵 세포 제제당 1.62배에서 1.99배 내지 1.99배 10내지 9번째 세포까지 다양하다. 3명의 환자 견본의 이 대표적인 분석에서는, 번역 후 수정에 있는 증가가 더 높은 이온화 방사선 량에서 관찰되었습니다. 흥미롭게도, 실조-텔란지크시아 돌연변이 및 RAD50의 인산화는 0.2 그레이의 낮은 용량에서 상당했으며, 이는 이러한 번역 후 변형이 종양의 좋은 동적 범위와 함께 DNA 이중 가닥 의 생성을 포함하는 치료법을 위한 약력 동적 바이오 마커로 구현될 수 있음을 시사합니다.최적의 시료 준비를 위해 실온에서 수집한 지 1시간 이내에 혈액을 처리하고, 샘플을 원심분리하고, 어두운 배경에 대해 튜브를 보고 버피 코트를 구별할 수 있습니다.

preparation-peripheral-blood-mononuclear-cell-pellets-plasma-from

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

이 동영상은 혈소판 수 스크리닝, 혈액 채취 및 원심분리, 혈소판 분리를 통한 고품질 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 준비를 보여줍니다. 이 PRP는 조직 재생 및 치유를 위한 치료 응용 분야에 사용됩니다.

Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood(인간 말초 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장)의 제조

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

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추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

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