Name: 다음 단계: 쥐의 기능적 회복을 극대화하기 위한 신경 응복 성 직교 힌지 이식 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 학습하세요 쥐의 정위적 후지 중간허벅지 이식 모델을 통해 혈관화 복합 동종이식 및 면역학 반응과 기능적 회복을 동시에 연구하는 방법을. 정교한 미세수술 기법으로 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

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이 작품은 프랑켈 재단과 노스 웨스턴 메모리얼 병원 맥코믹 그랜트 (운영 복원)에 의해 지원되었다. 이 간행물에서 보고된 연구는 상 번호 T32GM008152의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 메디의 과학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 노스 웨스턴 대학 미세 수술 코어와 행동 Phenotyping 코어에 의해 지원되었다.

모든 실험은 국립 보건원 (NIH)의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 노스 웨스턴 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 특정 절차는 프로토콜 IS00001663에 따라 수행되었습니다.
참고 : 쥐의 두 변종을 사용되었다, 루이스 쥐와 8 월 코펜하겐 x 아일랜드어 (ACI) 쥐. 동물은 면역 억제 없이 동종 이식 (루이스에 ACI), 기존의 면역 억제 (루이스에 ACI), 동소 이식 (루이스 루이스 또는 ACI에 ACI)를 결합하는 세 가지 치료 그룹으로 나뉘었다. 루이스는 근친 근친 변형, ACI 쥐 는 아웃 사육 야생 형을 나타내는 동안, 따라서이 조합은 더 나쁜 경우 거부 응답을 모델링하도록 선택되었다. 종래의 면역억제는 수술 후 날(POD)에서 1~POD 28을 뺀 라파마이신 1 mg/kg또는 POD 0에서 POD 14까지 3 mg/kg으로 피하 투여한 후, 그 후 매주 한 번 투여하였다. 남성과 여성 쥐 모두 8 주에서 16 주 까지 자격을 갖춘 수령인이었다, 사이 무게 250 과 400 수술 의 시간에 그램.
1. 기증자 오른쪽 뒷다리 수확
<ol><li>적절한 청소 시스템을 가진 기화기를 통해 순수한 산소로 5% 이소플루란으로 전신 마취를 유도합니다.</li>
	<li>발가락 핀치로 마취의 적절한 깊이를 확인한 다음 헤어 클리퍼를 사용하여 오른쪽 뒷다리와 오른쪽 사타구니 수술 부위의 털을 다듬습니다.</li>
	<li>설치류 코 콘을 통해 이소플루란을 2-2.5%로 하향 돌이세요.</li>
	<li>쥐 의 척추를 스프레드 팔다리가 아래 가열 패드가있는 작동 보드에 측면에 테이프로 놓습니다. 무모 피부를 70%로 소독하고 멸균 거즈로 수술장을 보호합니다.</li>
	<li>적절한 미세 수술 현미경, 미세 수술 기구를 사용하여 양극성 및 단일 극성 전기 코터리에 쉽게 접근 할 수 있으며 해부를 시작합니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 오른쪽 뒷다리 주위에 할례 피부 / 피하 조직 절개를하십시오. 인구인인대와 거의 같은 수준에서 내측으로 인구주름에서 시작하여 둘레 절개를 완료하기 위해 뒤-측면으로 확장합니다.</li>
	<li>절개 바로 아래에 근육 층을 노출한 후 근육층에서 근위가 있는 피부/피하 플랩으로 이어지는 피상적 상복부 혈관을 해부하고 소생시합니다.</li>
	<li>근접 플랩을 인기구 인대와 말단 피부/피하 플랩에 겹침방식으로 무릎에 반영합니다.</li>
	<li>와이어 리트랙터 또는 압연 거즈를 사용하여 필드를 노출하십시오.</li>
	<li>쥐의 식증 해부학은 인간과 유사하다는 것을 관찰하십시오. 측면에서 내측으로 신경, 동맥 및 정맥이 놓여 있습니다.</li>
	<li>대퇴 신경을 해부, 잉게인 인대에 급격하게 분할, 가능하면 양분에 근위. 분열된 신경을 열등하게 철회하고, 촉촉한 거즈 아래에 덮여 있어 안전하게 방해하지 않습니다.</li>
	<li>대퇴동맥과 정맥에 주의를 돌리면 4cm 7-0 실크 넥타이를 사용하여 직접 처리하는 대신 혈관을 외상적으로 철회하십시오.</li>
	<li>대퇴함의 모든 가지를 7-0 실크 넥타이로 장식합니다. 나뭇가지를 관계 간에 분할합니다. 매우 작은 가지의 경우 양극성 소우가 관계 대신 사용할 수 있습니다. 참고: 분단이 필요한 동맥 및 정맥 가지에는 피상적인 일류와 근육 혈관이 포함됩니다. 피상적 인 circumflex 상색은 일반적으로 가장 크고 인간에서 profunda 대퇴와 마찬가지로 깊은 다이빙을 하는 것처럼 보이지만, profunda는 쥐15에없습니다. 가장 높은 비낭 및 사페누스 가지와 같은 대퇴 혈관의 더 많은 단지부는 일반적으로 분열을 필요로하지 않습니다.</li>
	<li>체계적으로 남성 쥐 기증자의 음경 정맥을 통해 헤파린의 500 국제 단위를 주입. 기증자 쥐가 여성인 경우 피상상 위 정맥을 사용합니다.</li>
	<li>헤파린이 다음 단계를 진행하기 전에 2 분 동안 체계적으로 순환하도록 허용하십시오.</li>
	<li>대퇴동맥을 7-0 실크 타이로 가능한 한 인대와 근간으로 묶고 동점을 나눕니다.</li>
	<li>동맥과 유사하게 대퇴 정맥을 리게이트하고 나눕니다.</li>
	<li>동맥과 정맥을 열등하게 반영하고, 안전하게 길에서 벗어나, 습한 거즈 아래에 덮여 있으며, 이전에 덮은 대퇴신경과 함께 덮입니다. 복부 근육 그룹을 해부, 발생하는 모든 눈에 보이는 혈관을 소생주의 복용. 여기서 혈청에 주의하면 재관류 후 의자 혈액 손실을 최소화할 수 있습니다.</li>
	<li>복부 근육 그룹에 깊은, 식별 하 고 날카롭게 그것의 가지에 상시 신경 근위를 분할. 세 가지는 일반적으로 볼 수 있습니다: 경정, 간형 및 sural. 세 가지 모두 기증자 사지에 보존되어야 합니다. 네 번째 분리 분기는 일반적으로 이 해부15,,16에서볼 수 없습니다.</li>
	<li>세심한 hemostasis와 중간 허벅지 수준에서 나머지 복부와 등쪽 근육 그룹을 분할 완료. 근육을 나누는 것을 완료하기 위해 사지를 내측으로 철회할 필요가 있을 수 있습니다.</li>
	<li>핸드 헬드 무선 회전 톱을 사용하여 중간 샤프트에서 대퇴골 뼈를 횡단합니다.</li>
	<li>기증자에게서 사지 이식편을 제거한 후, 접목측 대퇴동맥과 정맥 그루터기에서 실크 묶인 끝을 잘라내어 혈관을 다시 열게 한다.</li>
	<li>24게이지 협막이를 이식 동맥 그루터기에 삽입하고 얼음처럼 차가운 정상 식염수의 5mL에 희석된 250개의 국제 유닛으로 이식편을 플러시하여 열린 정맥을 통해 맑게 흘러나오는 것을 관찰합니다.</li>
	<li>천천히, 약 3 분 동안 부드럽게 접목을 플러시. 과도한 강력한 플러싱은 내피를 손상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>이식이 이식될 때까지 얼음 양동이에 중첩된 차가운 식염수 접시에 접목을 놓습니다.</li>
	<li>양자 투라코토미로 기증자 쥐를 안락사시.</li>
	<li>모든 수술 기구를 적절히 청소하십시오.</li>
</ol>2. 받는 사람 네이티브 오른쪽 뒷다리 절단
<ol><li>5%에서 이소플루란으로 마취를 유도하고, 깊이를 확인하고, 모피를 손질하고, 동물을 배치하고, 기증자 쥐에 대해 설명한 대로 알코올로 피부를 소독한다.</li>
	<li>다운-titrate isoflurane 에 2-2.5% 부프레노르핀 1.2 mg/kg피하 전 수술 전 진통제를 주입 하 고, 내형 전 예방 에 로플로록사신 7.5 mg/kg.</li>
	<li>기증자와 마찬가지로, 잉게인 주름에 할례 절개를하고, 피부 플랩을 반사하여 헤모도신경, 동맥 및 정맥을 해부하고, 위와 같은 가지 혈관을 계회합니다.</li>
	<li>대퇴골 신경을 기증자보다 더 disismore하게 나누지만 가능하면 분기에 근접적으로 나눕니다.</li>
	<li>대퇴동맥과 정맥을 독대 인대 의 수준에서 각각 별도로 고정하기에 충분한 공간을 해부하십시오. 미세 수술 불독 클램프와 정맥과 동맥을 고정합니다. 일단 고정되면 각 선박을 가위로 날카롭게 나눕니다.</li>
	<li>허벅지의 복부와 등쪽 근육을 허벅지 중간 수준에서 세심한 헤모스티스로 나누고 필요에 따라 사지를 내측으로 후퇴시킵니다.</li>
	<li>위와 같이 상반신 신경근위를 분기점으로 식별하고 나눕니다.</li>
	<li>톱을 사용하여 중간 샤프트에서 대퇴골을 횡단합니다.</li>
	<li>받는 사람 네이티브 오른쪽 뒷다리를 제거하고 적절하게 폐기하십시오.</li>
	<li>코 콘을 통해 이소플루란을 1-1.5%로 하향 돌이세요.</li>
</ol>3. 받는 사람 사지 이식에 기증자
<ol><li>핸드 헬드 파워 톱을 사용하여 기증자와 수령인 대퇴골 절단 끝에서 부정을 면도하십시오.</li>
	<li>톱을 사용하여 18 게이지 바늘의 허브 끝을 잘라 내어 대퇴골 내막 막대가됩니다.</li>
	<li>뼈를 조작하기 전에, 재막 과정에서 골수 출혈을 줄이기 위해 대퇴골 뼈의 끝을 잘라 받는 사람에 소량의 뼈 왁스를 적용합니다.</li>
	<li>기증자와 수령인 대퇴 뼈를 18 게이지 바늘을 관문 막대로 사용하여 동거하십시오. 어떤 힘은 필요하지만, 피질을 골절까지 어느 뼈중 하나를 ream하지 않습니다.</li>
	<li>필요에 따라 바늘을 제거하고 적절한 길이로 트리밍하여 두 뼈가 바늘 사이에 바늘이 보이지 않고 바늘 위에 부드럽게 맞도록 하십시오.</li>
	<li>거즈 패드 나 작은 바위 또는 기증자 사지 아래에 점토모델링과 같은 작은 지지대를 배치하여 긴장을 피하십시오.</li>
	<li>이식편이 대퇴골 바늘 주위를 회전하지 않도록 8 ~ 10 개의 간단한 중단 5-0 폴리 글락틴 봉합사를 가진 복부 근육 그룹을 다시 상종. 이것은 해부학에 대한 사지 안정성을 제공합니다.</li>
	<li>더 나은 시각화를 위해 얼음 차가운 식염수로 이식 및 외과 분야를 주기적으로 관개하고 따뜻한 허혈성 재퍼퓨전 손상을 줄입니다.</li>
	<li>기증자와 수령인 대퇴 동맥을 정렬하고 단순 중단 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 종단 에 종결방식으로 그들을 해부학, 긴장과 루프를 모두 피하십시오. 동맥은 평균 6 개의 봉합사가 필요합니다.</li>
	<li>동맥과 유사하게 기증자와 수혜자 대퇴정맥을 끝까지 끝까지 해부학합니다. 정맥은 6 ~8 봉합사가 필요합니다. 참고: 넉넉한 차가운 식염수 관개, 외상성 혈관 취급 기술 및 긴 꼬리를 방치하여 선박 회수를 위한 체류 봉합사 역할을 하는 것은 효과적인 미세 수술 해부학을 위한 중요한 도구입니다.</li>
	<li>소량의 혈전성 셀룰로오스 분말을 마취제 주위에 놓고 정맥과 동맥에 근접 미세 수술 불독 클램프를 제거합니다.</li>
	<li>좋은 육아와 흐름을 위해 양상모를 검사합니다. 면 봉면을 사용하여 정맥을 부드럽게 프로딩하고 두 해부학모두의 좋은 지혈을 보장하십시오. 출혈 부위에 압력을 가하고 필요한 경우 더 많은 혈전성 셀룰로오스 분말을 배치하십시오. 또 다른 봉합사는 마지막 수단으로만 바늘을 "백 월링"할 위험에 출혈 구멍을 통해 배치 될 수 있습니다.</li>
	<li>두 해부학 모두 만족스러운 것으로 확인되면 나머지 장기 체류 봉합사 꼬리를 다른 것과 일치하도록 짧게 다듬습니다.</li>
	<li>쥐를 왼쪽 측면 탈큐비투스 위치로 재배치하고, 자유로운 전기 카우테를 사용하여 모든 재관류 근육 출혈의 세심한 hemostasis를 달성하십시오.</li>
	<li>근육 기혈이 보장되면 신경 해부학에주의를 돌립니다. 비정형으로 보이는 신경 절단 끝을 다시 트리밍합니다.</li>
	<li>간단한 중단 5-0 폴리 글락틴 봉합사와 상시 신경 아래 등산 근육 그룹을 다시 상종.</li>
	<li>상술 신경을 다시 상시합니다. 8 -10-0 나일론 신경 간단한 중단 봉합사 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>상기 시키는 등쪽 근육 단을 다시 근사한 다음 4-0 폴리글락틴 연속 봉합사로 등쪽 피부를 닫습니다.</li>
	<li>쥐를 다시 척추 위치로 재배치하고 대퇴 신경을 재평가합니다. 2 ~3 개의 10-0 나일론 신경 간단한 중단 봉합사도 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>4-0 폴리글락틴 연속 봉합사로 복부 피부를 닫습니다. 일단 깨어 나면 쥐에 자극 될 수있는 여분의 봉합꼬리를 피하십시오.</li>
</ol>4. 수술 후 치료
<ol><li>케이지 아래에 난방 패드가 있는 케이지에서 동물을 복구하고 음식과 물에 대한 준비를 통해 첫 주 동안 매일 조기 합병증을 모니터링합니다.</li>
	<li>POD 2를 통해 피하 멜록시캄 1 mg/kg 일일 주사를 통해 수술 후 항간증을 제공합니다. 수술 후 항생제 예방을 제공하여 엔로플로록사신 스프레이를 희석시합니다. POD 7을 통해 이식편에 매일 두 번 분사된 비터 세이프 미스트로 자동 절제술(자가 절단)에 불이익을 제공합니다.</li>
	<li>다른 쥐와 함께 케이지에 이식 된 쥐를 유지, 매일 활동에 반환을 자극 하 고 이식 된 사지를 재활.</li>
</ol>5. 수술 후 감각 테스트
<ol><li>열 감각 프로토콜의 Hargreaves 테스트를 적용, 또한 다른 곳에서 설명17,,18.</li>
	<li>쥐를 테스트 컨테이너에 넣고 20 분 동안 적응할 수 있었습니다. 장치 유리는 깨끗하게 확인되고, 열원은 조사관의 손가락으로 작동하는 것으로 확인되었다.</li>
	<li>테스트하기 전에 쥐가 깨어 있고 테스트된 발이 적외선 모션 검출기 위에 배치되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>강도 수준 90에서 열 에너지를 전송합니다. 열원에서 발을 멀리 이동하는 동물의 시간 지연이 기록됩니다. 20초 이내에 움직임이 발생하지 않으면 부상을 방지하기 위해 시험이 중단됩니다.</li>
	<li>각 동물에 대한 평균 인출 대기 시간을 계산하기 전에 가장 높고 낮은 값을 제외하고 테스트 된 사지 당 5 번의 시험을 얻습니다.</li>
</ol>6. 수술 후 모터 테스트
<ol><li>걸음걸이 분석 러닝머신과 통합 소프트웨어 분석 플랫폼을 사용하여 수술 후 4~6주 동안 러닝머신 테스트 후보자를 선택합니다.</li>
	<li>테스트 하기 전에 모든 쥐 발톱 1 ~ 이틀 을 손질.</li>
	<li>테스트 하기 전에 1 시간 동안 테스트 룸에 동물을 적응 하 고 불안을 진정 하기 위해 사전 테스트 페팅의 1 분 동안 허용.</li>
	<li>러닝머신 내부에 쥐를 배치하고, 10cm/s에서 14cm/s로 속도를 높이는 시험에서 러닝머신을 18cm/s로 실행합니다. 쥐가 망설이고 걷기 위해 동축 될 수없는 경우, 부정적인 컨디셔닝을 피하기 위해 그 날 테스트를 중단하십시오. 높은 공연자가 최대 24cm/s까지 걸을 수 있도록 합니다.</li>
	<li>테스트 된 동물 사이에 70 % 에탄올로 러닝 머신 장치를 헹구십시오.</li>
	<li>걸음걸이 매개 변수는 분석 플랫폼의 독점 소프트웨어에서 출력됩니다.</li>
</ol>

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사지 이식, 혈관 구성 요소 동종 이식의 광범위한 범주에 따라 (VCA), 아직 성취되지 않은 널리 적용 가능한 치료 약속. 주요 장애물은 현재 사용되는 VCA 및 신경 운동 복구 기술에 고유한 해결되지 않은 면역 학적 문제에 있습니다. 새로운 기술의 개발은 유연하고 견고하며 재현 가능한 동물 모델링에 달려 있습니다.
많은 동물 모델은 VCA에 설립되었습니다, 특정 장점4각 . 비인간 영장류 모델은 인간 환자에게 매력적인 번역성을 제공하지만 비용 우려와 면역 억제의 독성 수준에 의해 방해를 받아4가필요했다. 개 모델은 인간뿐만 아니라 경험이 풍부한 면역 체계19,,20뿐만아니라 근육 구조의 특정 유사성에 유리한 것으로 볼 수있다. 돼지 모델은 면역 계통이 점점 더 잘 연구되는 큰 동물 모형의...

혈관 복합 동종 이식 (VCA) 또는 복합 조직 동종 이식 (CTA)의 광범위한 범주에 따라 사지 이식은 아직 치료 약속을 이행하지 못했습니다. 1998년과 1999년 켄터키 주 리옹에서 처음으로 성공한 인간 손 이식 이후, 100개 이상의 상사 이식이 엄선된 환자1에서전 세계적으로 수행되었다. 실질적인 면역 억제와 제한된 기능성 신경 운동 회복에 의해 더 넓은 적용성이 좌절되었습니다. 현재 면역억제 전략은기회감염2의77%의 발생률에 직면하여 급성 거부의 85% 발생률을 초래한다. 한편, 손 이식 후 기능적 회복이 발생한다. 암 어깨와 손 (DASH) 점수의 장애는 71에서 43로 향상되지만, 그 기능 수준은 여전히 장애2로자격이 될 수 있습니다. 사지 이식의 비생명 절약 특성을 감안할 때, 현재 기술은 VCA에서 다음 단계를 취할 동물 모델에서 정제해야합니다.
1978년3년사지 이식의 첫 번째 쥐 모델 이후, 많은 혁신적인 동물 모델이 VCA4의분야를 발전시키기 위해 개발되었으며, 수술 시간을 최소화하기 위해 혈관 커프드,아나도모를 통합하여 수술 시간7,,,5,,6,이성토성 골분비쿠타네이스 이식을 통해 수령인 동물,7,8,9, 10, 11, 및 신규 면역학적 접근법 7,8,9,10,,11,및 신규 면역 접근법 14,121.14 여기에 제시된 직교 우측 뒷다리 중간 허벅지 이식의 쥐 모델은 현재 VCA 제한의 양측면을 동시에 조사하기 위해 강력하고 재현 가능한 모델 플랫폼에 대한 선행 투자로서 손 수놓은 혈관 아나스토모모 및 신경 응식과 같은 세심하고 시간 테스트된 미세 수술 기술을 강조합니다: 면역 억제 전략 및 기능성 신경 운동 회복.

<table><tbody><tr><td>마취 기계</td><td>Vet 장비</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>0.5cc 주사기</td><td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1cc 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>22 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24 게이지 혈관 카테터</td><td>Sur-Vet</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>25- 게이지 바늘</td><td>Exel</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>3cc 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>5cc 주사기</td><td>Exel</td><td>26230</td><td></td></tr><tr><td>알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-600-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>마취 유도 챔버</td><td>Vet 장비</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>마취 가스 제거제 시스템</td><td>Vet 장비</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>양극성 electrocautery</td><td>Aura</td><td>26-500</td><td></td></tr><tr><td>쓴 스프레이 미스트</td><td>Henry Schein</td><td>5553</td><td></td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>CP 의료</td><td>CPB31A</td><td></td></tr><tr><td>호흡 회로</td><td>Vet 장비</td><td>921413</td><td></td></tr><tr><td>Buprenophine</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejos 니들 드라이버</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>무선 로터리 톱</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>면봉 스틱</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>지혈용</td></tr><tr><td>DigiGait Appparatus 및 소프트웨어</td><td>마우스 사양</td><td>MSI-DIG, DIG-SOFT</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게</td> <td>2Roboz</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게</td> <td>Roboz</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Norbrook</td><td>ANADA 200-495</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>Astellas</td><td>301601</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Kendall</td><td>1903</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>Microflex</td><td>DGP-350-M</td><td></td></tr><tr><td>이발기</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 단극 전기 소작</td><td>Bovie</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>Hargreaves Apparatus</td><td>Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Walgreens</td><td>126987</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>42592K</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Corning</td><td>PC-351</td><td>온난화 소생액</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>젖 링거</td><td>Baxter</td><td>2B2074</td><td></td></tr><tr><td>대형 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>식염수</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein</td><td>49755</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 Collin Hartmann 견인기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td></td></tr><tr><td>Microfibrillar 콜라겐 분말</td><td>BD</td><td>1010590</td><td>지혈</td></tr>용 <tr><td>미세혈관 클립</td><td>Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>일반 식염수</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>안과 윤활제</td><td>Dechra</td><td>IS4398</td><td></td></tr><tr><td>Rapmycin</td><td>MedChem Express</td><td>HY-10219</td><td></td></tr><tr><td>소형 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>데운 소생액용</td></tr><tr><td>멸균 드레이프</td><td>ProAdvantage</td><td>N207100</td><td></td></tr><tr><td>수술 가운</td><td>Cardinal Health</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>수술 마스크</td><td>3M</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>수술 현미경, 광학 모델 OPMIMD</td><td>Zeiss</td><td>169756</td><td></td></tr><tr><td>수술 현미경, 범용 S3</td><td>Zeiss</td><td>243188</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 10-0 나일론</td><td>Covidien</td><td>N2512</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 5-0 vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J213H</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 7-0 실크 넥타이</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>초음파 기기 클리너</td><td>Roboz</td><td>RS-9911</td><td></td></tr><tr><td>혈관 확장 겸자</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr></tbody></table>

다음 단계: 쥐의 기능적 회복을 극대화하기 위한 신경 응복 성 직교 힌지 이식 모델

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

사지 이식은 특히 혈관화 복합 동종 이식 (VCA)은 일반적으로 면역 억제 및 기능성 신경 운동 회복의 현재 한계에 의해 좌절 된 광범위한 치료 약속을 가지고 있습니다. 많은 동물 모델은 VCA의 독특한 특징을 연구하기 위해 개발되었지만, 여기에서 우리는 현재 VCA 제한의 두 측면을 동시에 조사하기 위해 설계된 쥐에서 직교 뒷다리 이식의 강력한 재현 가능한 모델을 제시합니다: 면역 억제 전략 및 기능성 신경 운동 회복. 모델의 핵심은 손 바느질 혈관 해부학과 대퇴 신경과 상골 신경의 신경 응착과 같은 세심한, 시간 테스트 미세 수술 기술에 대한 헌신을 달려있다. 이 접근법은 재활, 일상 활동 재개 및 기능 적 테스트를 할 수있는 더 오래 살아있는 동물을 허용하는 튼튼한 사지 재건을 제공합니다. 종래의 면역억제제의 단기 치료로, 이식후 70일까지 생존한 동종동물은 수술 후 200일을 초과하는 장기간의 대조군을 제공한다. 신경 기능 회복의 증거는 수술 후 30 일 동안 존재합니다. 이 모델은 VCA 및 신경 재생에 고유한 면역 학적 질문을 심문하는 데 유용한 플랫폼을 제공 할뿐만 아니라 VCA에 맞게 특별히 조정 된 새로운 치료 전략의 생체 테스트를 허용합니다.

생존과 회복은 세심한 수술 기술에 달려 있습니다. 혈관 해부학과 신경 해부학뿐만 아니라 위에서 설명한 바와 같은 뼈 응고에 대한 관심은이 모델의 성공을 극대화하는 데 중요합니다. 수술 설계 및 대표적인 아나스토모틱 결과는 도 1에도시된다.
전반적인 사망률은 면역 억제 전략에 의존했으며, 이소 이식 된 동물의 대부분은 도 2에서 볼 수 있듯이 수술 후 100-200 일의 연구 종점을 달성했다. 일단 급성 수술 후 창 밖으로, 치료 된 항종 이식 동물최대 생존을 경험할 수 58 수술 후 일. 동종 이식 된 쥐는 라파마이신과 FK506에서 가변 적인 필멸의 가변을 했다 동안 연구 과정을 통해 무기한 살았다. FK506은 가장 긴 생존력을 촉진(57일)했고, 라파마이신은 치료되지 않은 대조군(10일)을 제치고 2위(20일)를 기록했다.
<p class="jove_conten...

이 프로토콜은 면역학 및 기능 적 회복의 동시 연구를 향해 기어드 혈관 복합 동종 이식 (VCA)의 견고하고 재현 가능한 모델을 제시한다. 손 바느질 혈관 아나토모와 신경 응착오른쪽 중간 허벅지 뒷다리 직교 이식에 세심한 기술에 투자 된 시간은 기능적 회복을 연구 할 수있는 능력을 산출한다.

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

이 비디오는 상세 설명, 직교 오른쪽 뒷다리, 중간 허벅지 이식 쥐를 수행하는 방법을 제공합니다. 기증자 쥐 오른쪽 뒷사지는 허벅지 중간 수준에서 절단 된 다음 얼음에 저장됩니다. 수신자 쥐 오른쪽 뒷사지는 또한 허벅지 중간 수준에서 절단됩니다.기증자 쥐 사지는 수신자 쥐에 부착됩니다. 우리는 뼈, 동맥, 정맥, 신경, 근육 및 피부 시스템을 다시 부착하는 방법을 설명합니다. 사지 이식, 더 구체적으로, 혈관 복합 동종 이식, VCA, 광범위한 치료 약속을 가지고있다.그러나 현재 기술, 면역 억제 및 기능성 신경 운동 회복에 의해 제한됩니다. 우리의 모델은 손으로 바느질 한 혈관 해부학 및 신경 응착과 같은 세심한 시간 테스트 미세 수술 기술을 강조합니다. 우리는 1 년 이상에 있는 이 수술의 200 이상 을 수행했습니다.초기 마이크로 외과 의사에 초기 학습 곡선이 있지만,이 비디오를 사용하여 우리의 방법과 헌신적 인 연습에 대한 헌신을 배우면 모든 마이크로 외과 의사가이 모델을 마스터 할 수 있습니다. 모든 실험은 국립 보건원, NIH의 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 노스 웨스턴 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 특정 절차는 프로토콜 IS 00001663에서 수행되었습니다.수술 시 8~16주 된 쥐를 선택하십시오. 쥐의 뒷다리 털을 다듬기 전에 기화기를 통해 5%의 이소플루란으로 전신 마취를 유도합니다. 코 콘을 사용하여 마취를 2~ 2.5% 아래에 히터로 작동 보드에 쥐를 배치합니다.무모 피부를 70%의 마찰 알코올로 소독하고 멸균 거즈로 수술장을 보호합니다. 적절한 미세 수술 현미경과 여기에 표시된 미세 수술 기구를 사용하여 접근하기 쉬운 양극성 및 단일 극성 전기 코스터리와 함께 해부를 시작할 준비가됩니다. 가위를 사용하여 오른쪽 뒷다리 주위에 할례와 피부 절개를 하십시오.인게날 인대와 거의 동일한 수준에서 즉시 잉게날 주름에서 시작하고 둘레 절개를 완료하기 위해 측면으로 등갈을 확장하십시오. 그리고 바로 절개 아래에 근육 층을 노출, 해부및 방금 만든 근위 피부 플랩에 근육 층에서 리드 피상 적 상복부 혈관을 소생. 근접 플랩을 잉게인 인대와 말단 피부 플랩에 초월적으로 반영하여 무릎에 열렬하게 반사합니다.와이어 리트랙터 또는 압연 거즈를 사용하여 필드를 노출하십시오. 쥐의 음항제는 인간과 유사하다는 것을 관찰했습니다; 측면에서 내측에 신경, 동맥 및 정맥이 놓여 있습니다. 대퇴 신경을 해부하고, 가능하면 양면에 인대 근동을 급격히 나눕니다.분열된 신경을 열등하게 철회하고, 촉촉한 거즈 아래에 덮여 있어 안전하게 방해하지 않습니다. 대퇴동맥과 정맥에 주의를 돌리면 4센티미터 길이의 7-0 실크 넥타이를 사용하여 직접 처리하는 대신 혈관을 외상적으로 철회합니다. 이제 세심한 주의를 기울이면 최종 해부학 적 결과가 향상됩니다.7-0 실크 넥타이로 대퇴함의 모든 가지를 리게이트합니다. 나뭇가지를 관계 간에 나눕니다. 분열을 필요로 하는 동맥 및 정맥 가지에는 피상적인 일류 와 근육 혈관이 포함됩니다.피상적 인 곡실 비강은 일반적으로 가장 크고 인간에서 profunda 대퇴와 마찬가지로 깊은 다이빙을 하는 것처럼 보이지만, profunda는 쥐에 없습니다. 대퇴혈관의 더 많은 단부, 예컨대 가장 높은 비낭 및 사페누스 가지는 일반적으로 분열을 필요로하지 않는다. 이제 대퇴동맥을 7-0 실크 타이로 가능한 한 인대와 동면으로 리게이트하고 동점을 나눕니다.동맥과 유사하게 대퇴 정맥을 리게이트하고 나눕니다. 동맥과 정맥을 열등하게 반영하고, 안전하게 길에서 벗어나, 습한 거즈 아래에 덮여 있으며, 이전에 덮은 대퇴신경과 함께 덮입니다. 복부 근육 그룹을 해부, 발생하는 모든 눈에 보이는 혈관을 소생주의 복용.hemostasis에 주의지금 나중에 재현 하는 동안 받는 사람 혈액 손실을 최소화 할 것 이다. 복부 근육 그룹에 깊은, 식별 하 고 날카롭게 그것의 가지에 상시 신경 근접성을 분할. 세 가지 는 모두 일반적으로 볼 수, 정경, 간내 및 sural.세 가지 모두 기증자 사지에 보존되어야 합니다. 네 번째 분리 분기는 일반적으로 이 해부에서 볼 수 없습니다. 세심한 hemostasis와 중간 허벅지 수준에서 나머지 복부와 등쪽 근육 그룹을 분할 완료.근육을 나누는 것을 완료하기 위해 사지를 내측으로 철회할 필요가 있을 수 있습니다. 핸드헬드 무선 회전 톱을 사용하여 중간 샤프트에서 대퇴골 뼈를 분리합니다. 사지는 이제 기증자로부터 자유롭습니다.기증자에게서 사지 이식편을 제거한 후, 접목측 대퇴동맥과 정맥 그루터기에서 실크 묶인 끝을 잘라내어 혈관을 다시 열게 한다. 24 게이지 협착기를 이식 동맥 그루터기에 삽입하고 얼음처럼 차가운 정상 식염수 5 밀리리터에 희석 된 250 개의 국제 단위로 접목을 플러시하여 열린 정맥에서 흘러 나오는 것을 주의하십시오. 천천히, 약 3 분 동안 부드럽게 접목을 플러시.과도한 강력한 플러싱은 내피를 손상시킬 수 있습니다. 이식이 이식될 때까지 얼음 양동이에 중첩된 차가운 식염수 접시에 접목을 놓습니다. 양자 투라코토미로 기증자 쥐를 안락사시.수령인 수술은 기증자 수술과 유사하게 시작되며, 쥐를 마취하고, 모피를 다듬고, 피부 플랩을 반사하고, 대퇴 신경, 동맥 및 정맥을 해부합니다. 그리고 이전에 설명한 것과 동일한 분기 혈관을 계칭한다. 그러나, 이 작업 도중, 기증자를 위한 보다는 더 dismoreid를 대퇴신경을 분할합니다, 그러나 가능하면 양면에 근교로.대퇴동맥과 정맥을 나누고 미세 수술 불독 클램프로 인게인의 수준에서 각각 클램프를 누비한다. 이전에 설명한 대로 수술을 계속, 세심한 hemostasis와 허벅지의 복부 지지 근육을 분할, 필요에 따라 내측 사지를 철회하면서. 좌골 신경 근위를 분기점으로 식별하고 나누고 회전톱을 사용하여 중간 축에서 대퇴골을 분리한다.수령인의 오른쪽 뒷다리를 제거하고 지역 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 적절하게 폐기하십시오. 이 단계에서 는 코 콘을 통해 1 ~1.5 %로 이소플루란을 거절하는 것이 매우 중요합니다. 절차의 이 덜 고통스러운 부분 도중 너무 많은 마취는 쥐의 죽음으로 이끌어 낼 것입니다.뼈를 함께 뭉울 때입니다. 핸드헬드 로터리 톱을 사용하여 기증자와 수령인 대퇴골 절단 단골 모두에서 부정행위를 제거하십시오. 18 게이지 바늘의 허브 끝을 잘라, 이는 대퇴골 내트럼질 막대가 될 것입니다.뼈를 조작하기 전에, 재갈 과정에서 골수 출혈을 줄이기 위해 대퇴골 뼈의 끝을 절단 받는 사람에 소량의 뼈 왁스를 적용합니다. 기증자와 수령인 대퇴 뼈를 18 게이지 바늘을 관문 막대로 사용하여 동거하십시오. 어떤 힘은 필요하지만, 피질을 골절까지 어느 뼈중 하나를 ream하지 않습니다.필요에 따라 바늘을 제거하고 두 뼈가 뼈 사이에 바늘이 보이지 않고 바늘 위에 부드럽게 맞도록 부적절한 길이로 다듬습니다. 거즈 패드 나 작은 바위 또는 기증자 사지 아래에 점토모델링과 같은 작은 지지대를 배치하여 긴장을 피하십시오. 8~10개의 단순 중단된 5-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복부 근육 그룹을 재약화하여 이식편이 대퇴골 바늘 주위를 회전시키지 않도록 합니다.이것은 해부학에 대한 사지 안정성을 제공합니다. 이제 해부학을 시작합니다. 더 나은 시각화를 위해 얼음 차가운 식염수로 이식 및 외과 분야를 주기적으로 관개하고 허혈성 재관류 손상을 줄입니다.기증자와 수령인 대퇴 동맥과 해부학을 단순 중단 된 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 엔드 투 엔드 방식으로 정렬하여 긴장과 반복을 모두 피하십시오. 동맥은 6 봉합사의 평균을 필요로한다. 동맥과 마찬가지로 기증자와 받는 사람 대퇴정맥을 종단 간 방식으로 해부학합니다.정맥은 6 ~8 봉합사가 필요합니다. 넉넉한 차가운 식염수 관개, 외상성 혈관 취급 기술, 긴 꼬리를 방치하여 선박 회수를 위한 체류 봉합사 역할을 하는 것은 효과적인 미세 수술 해부학을 위한 중요한 도구입니다. 중간 정도의 혈전셀룰로오스 분말을 양상모에 놓고 정맥과 동맥에 근접 미세 수술 불독 클램프를 제거합니다.좋은 육아와 흐름을 위해 양상모를 검사합니다. 면 봉면을 사용하여 정맥을 부드럽게 프로딩하고 두 해부학 모두에 좋은 혈안이 검사하십시오. 두 해부학모두 만족스러운 것으로 확인되면 남은 장기 봉합사 꼬리를 다른 것과 일치하도록 다듬습니다.왼쪽 측면 탈큐비투스 위치로 쥐를 재배치, 어떤 재관류 근육 출혈의 세심한 hemostasis을 달성하기 위해 자유로운 전기 카운테리를 사용합니다. 주의는 근육 hemostasis가 보장되면 신경 해부학으로 바뀌습니다. 간단한 중단 5-0 폴리 글락틴 봉합사와 상시 신경 아래에 바로 거짓말 등산 근육 그룹을 다시 상종.비정형으로 보이는 신경 절단 끝을 다시 트리밍합니다. 상추 신경을 10-0 나일론 봉합사로 상생시화하여 진신경성 바이트를 위해 노력합니다. 8 ~10 간단한 중단 봉합사는 일반적으로 충분합니다.5-0 폴리글락틴 봉합사를 가진 나머지 등산 근육 단을 재평가합니다. 그런 다음 4-0 폴리글락틴 연속 실행 봉합사로 등쪽 피부를 닫습니다. 쥐를 척추 위치로 재배치하고, 대퇴 신경을 10-0 나일론 봉합사로 다시 상생시키고, 주신경성 물린 것을 위해 노력한다.2 ~3 개의 간단한 중단 봉합사일반적으로 충분합니다. 등갈 피부와 같은 방식으로 나머지 복부 피부를 닫습니다. 일단 깨어 나면 쥐에 자극 될 수있는 여분의 봉합꼬리를 피하십시오.동물이 수술 후 즉시 창 밖으로 일단, 그들은 신경 운동 복구에 대 한 테스트될 수 있습니다. Hargreaves 테스트는 열 감각을 테스트하는 데 사용됩니다. 쥐를 테스트 컨테이너에 넣고 20 분 동안 적응할 수 있었습니다.장치 유리는 깨끗하게 확인되고, 열원은 조사관의 손가락으로 작동하는 것으로 확인된다. 테스트하기 전에 쥐가 깨어 있는지 확인하고 테스트 된 발이 적외선 모션 검출기 위에 배치됩니다. 강도 수준 90에서 열 에너지를 전송합니다.열원에서 발을 멀리 이동하는 동물의 시간 지연이 기록됩니다. 20초 이내에 움직임이 발생하지 않으면 부상을 방지하기 위해 시험이 중단됩니다. 각 동물에 대한 평균 인출 대기 시간을 계산하기 전에 가장 높고 낮은 값을 제외하고 테스트 된 사지 당 5 번의 시험을 얻습니다.여기에 만화 형식으로 묘사 된 수술 디자인입니다. 기증자와 수령쥐의 오른쪽 뒷사지는 상반절로 허벅지 중간 수준에서 절단됩니다. 대퇴동맥, 정맥 및 신경뿐만 아니라 상골 신경및 대퇴골 뼈는 수령인 수술에서 다시 연결되어야합니다.이 모델은 면역 억제 및 이식 전략의 차동 생존 효과를 보여주기 위해 사용될 수 있습니다. 이 기술로 장기적인 생존은 달성 할 수 있습니다. 이 모델은 감각 신경 회복을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 수술 후 4주 동안 분명하게 드러날 수 있습니다.또한 걸음걸이 분석 플랫폼을 사용하여 모터 기능을 심문할 수도 있습니다. 여기서, 우리는 유리한 생존 특성을 가진 쥐 모형 플랫폼을 제시했습니다, 우리는 진행 수치에서 보인 것과 같이 감각및 모터 복구를 탐구하기 위하여 이용합니다. VCA의 광범위한 범주에 따라 사지 이식, 혈관 구성 요소 동종 이식은 널리 적용 가능한 치료 약속은 아직 성취되지 않았습니다.주요 장애물은 현재 면역 억제 및 신경 운동 복구 기술을 라인. 새로운 기술의 개발은 유연하고 견고하며 재현 가능한 동물 모델링에 달려 있습니다. 이 플랫폼을 사용하여, 조사관이 사지 이식의 여러 면을 발전시킬 수 있기를 바랍니다.다음 단계에서 시청하고 행운을 빌어 주셔서 감사합니다.

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