형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

전단 흐름 하에서 단일 바이오 분자의 변형 변화를 정량화하는 것은 단백질과 DNA와 같은 거대 분자의 기능 및 생물 물리학을 이해하는 데 유용합니다. 형광 현미경 검사는 높은 시간적 및 공간 해상도를 가진 생리적인 흐름 환경에서 단일 분자의 실시간 시상 시각화를 허용합니다. 이것은 AFM과 같은 다른 기술에 의해 타의 추종을 불허합니다.

우리의 DNA가 전 세계적인 형태 변화를 가지고 있는 전단력을 특성화함으로써 이러한 생체 물리학적 특성을 모방하는 약물을 더 잘 설계할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 거동 또는 다른 폴리머, 특히 바이오 폴리머를 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있다. 단계의 타이밍은 성공에 매우 중요합니다.

우리는 미세 유체 장치 표면 처리 및 형광 현미경 검사법을 효율적인 방식으로 실행하기 위해 여러 번 단계를 연습하는 것이 좋습니다. 생체 분자의 형성적 변화를 포착하는 것은 영화에서 가장 잘 볼 수 있는 시각적이고 역동적인 현상입니다. 과학자는 이 비디오에 제시된 실시간 단백질 및 DNA 현미경 검사를 본 후에 이 방법을 더 잘 이해할 것입니다.

미세 유체 장치를 준비하려면 무게 보트에 실리콘 엘라스토머 베이스의 5부분을 한 부품 경화제에 추가합니다. 1분 동안 내용을 철저히 저어 미리 경화된 PDMS 솔루션을 만듭니다. 마스터 실리콘 웨이퍼를 플라스틱 페트리 접시에 넣고 웨이퍼 위에 PDMS 용액을 부어 5mm 층을 만듭니다.

접시를 덮고 기포를 제거하기 위해 진공 상태에서 건조기로 1 시간 동안 둡니다. 그런 다음 덮여 페트리 접시를 하룻밤 사이에 섭씨 60도에서 배양하여 PDMS를 유연한 고체로 치료하여 PDMS 웨이퍼 인터페이스에서 미세 유체 채널이 PDMS로 성형됩니다. 다음 날 면도기를 사용하여 PDMS의 각 미세 유체 채널 주위에서 20mm 10mm 직사각형을 자르고 핀셋으로 직사각형 블록을 제거합니다.

선명한 가장자리가 있는 25게이지 블런트 엔드 바늘을 사용하여 채널의 한쪽 끝에 0.5 밀리미터 직경의 구멍을 뚫어 구멍이 PDMS 블록을 완전히 통과하도록 합니다. 얇은 바늘을 사용하여 PDMS를 구멍 밖으로 펀치하고 채널의 다른 쪽 끝에서 프로세스를 반복합니다. 채널 측과 커버슬립을 플라즈마 본딩 기계의 챔버에 올려 놓고 치료를 시작합니다.

치료가 완료되면 채널이 슬립과 접촉할 수 있도록 PDMS 블록을 커버슬립에 신속하게 배치합니다. 블록 의 가장자리에 압력을 가한 다음 커버 슬립 PDMS 어셈블리를 115도의 온수 판에 놓고 영구 결합을 강화합니다. 마지막으로 길이10cm를 삽입합니다.

0.25 밀리미터 내부 직경 튜브가 PDMS 블록 상단의 출구 구멍으로 들어가유체가 채널에서 쉽게 흘러 나올 수 있도록 합니다. 폰 윌란트 인자 또는 VWF 실험의 경우 멸균 1X PBS에 용존되는 밀리리터 BSA-Biotin당 최대 10마이크로리터를 미세유체 장치의 입구에 주입합니다. 주입 후 파이펫 팁에 BSA-비오틴의 몇 마이크로리터를 보류하고 팁이 입구에 내장된 상태로 유지되도록 합니다.

BSA-Biotin이 2시간 동안 장치에 배양되도록 허용하여 BSA가 커버슬립 표면에 특이히 결합되지 않습니다. 그런 다음 파이펫 팁을 제거하고 최대 10 마이크로 리터의 카제인 차단 용액을 채널에 주입합니다. 카제인 용액이 30분 동안 배양하여 무료 부위를 차단하고 표면에 생체 분자의 비특이적 결합을 줄일 수 있도록 하십시오.

팁을 제거하고 BSA-Biotin의 비오틴 그룹에 결합됩니다 채널에 멸균 PBS에 스트렙타비딘의 10 마이크로 리터를 주입합니다. 다음으로, 최대 10마이크로리터의 세제 용액을 주입하여 과도한 스트렙타비딘을 씻어냅니다. 팁을 제거하고 카제인 용액 또는 람다 DNA에 VWF를 주입합니다.

VWF를 3분 동안 배양하거나 람다 DNA를 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 5 밀리풀프리 비오틴을 주입하여 과도한 스트렙타비딘 결합 부위를 차단합니다. 카제인 블로킹 용액 1밀리리터를 주사기에 적재하고 주사기 펌프에 고정합니다.

그런 다음 튜브의 한쪽 끝을 주사기 바늘에 부착하고 용액의 흐름을 사용하여 기포를 제거합니다. 무료 비오틴 주입 후 약 3 분 마이크로 유체 장치의 입구에 튜브의 다른 끝을 부착한다. TIRF 또는 공초점 형광 현미경의 가장 높은 배율 목표를 선택합니다.

필요한 경우 목표에 침수 오일 한 방울을 추가합니다. 현미경 단계에 미세 유체 장치를 배치하여 커버슬립이 목표와 플러시되도록 합니다. 밝은 필드 현미경 검사를 시작하고 파편과 거품과 같은 기능이 보이면 초점을 조정하십시오.

그런 다음 미세 유체 채널의 가장자리가 표시되고 프레임을 양분할 때까지 X 및 Y 방향으로 스테이지를 조정합니다. FITC 채널로 전환하고 개별 녹색 구형 분자를 구별할 수 있을 때까지 필요에 따라 Z 레벨 및 TIRF 각도를 조정합니다. 레이저 강도와 노출 시간을 조정하여 너무 빨리 광표백하지 않고 형광 분자를 시각화합니다.

그런 다음 분자를 더 잘 시각화하기 위해 대비를 조정합니다. 무료 비오틴 주입 개시 후 정확히 5 분 및 주사기 펌프에서 흐름을 중지시간 당 5000 과 30, 000 마이크로 리터 사이의 유량을 사용하여 분자 형성의 변화를 관찰한다. VWF를 사용하면 무료 비오틴 주입 후 정확히 5분 후에 시간당 30초 10, 000 마이크로리터 흐름과 같은 소량의 흐름을 적용하는 것이 중요합니다.

미세 유체 장치의 다양한 영역에 걸쳐 이 것을 반복하고 흐름을 시작하고 중지하는 여러 주기에 연장하고 완화 할 수있는 분자를 찾습니다. 분자가 최대 연장에 도달하고 완전한 이완에 도달하는 데 걸리는 시간을 기록하고 전단 흐름 하에서 분자의 지속적인 행동의 비디오를 녹화하십시오. 확인을 변경하는 분자의 유연성은 종종 증가 흐름으로 인해 더 높은 전단 속도가 적용으로 길어질 수있는 능력에 의해 입증된다.

폰 윌란트 인자 분자의 전단 속도 곡선 대 확장은 단백질의 생체 역학적 특성을 특성화하는 데 유용하다. 람다 DNA의 형광 현미경 이미지는 유사하게 30 초에 더 높은 전단 비율에 증가한 확장을 보여주고 흐름이 중단된 후에 2 분 동안 점진적인 이완. VWF와 함께 작업할 때는 흐름을 시작하기 전에 3분 동안만 배양하고 5분 동안 무료 비오틴을 무료로 배양해야 합니다.

이는 가역적 해명에 필요한 최적의 수 또는 비오틴 스트렙타비딘 연결을 형성하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 다중 생체 분자 간의 실시간 상호 작용을 시각화하고 기능을 특성화하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법으로 혈소판 접착 분자 GPIb-alpha와 함께 높은 전단및 결합하에 해명하는 VWF를 시각화하여 혈소판 플러그 형성을 더 잘 이해할 수 있었다.