Name: 신장 피 질 추출 물에서 혈관 내 피 성장 인자와 황 호르몬 사이의 선형 관계를 보여주는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 배우세요 소와 돼지 신장 피질 추출물을 이용한 VEGF와 LH의 상관관계 분석 방법을. ELISA와 선형 회귀 분석으로 신장 생리학 및 혈관 신생 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 정량 기법입니다.

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저자는 소와 돼지 신장을 제공 에 대한 Scholl의 도살장 (블리스 필드, MI)에 감사드립니다. 이 연구에는 보조금이 사용되지 않았습니다.

이 연구에는 살아있는 동물이나 실험동물이 사용되지 않았습니다.
1. 조직 취급
<ol><li>아바토이르에서 도살 직후 소와 돼지 전체 신장을 조달하십시오. 실험실에 얼음에 수송.</li>
	<li>실험실에 도착하면 50 mL의 얼음 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 신장을 헹구어 보라고합니다. 혈액을 완전히 제거하기 위해이 단계를 2x 반복하십시오.</li>
	<li>추가 추출이 될 때까지 신장을 얼음(또는 냉장)에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 신장의 해부
<ol><li>멸균 가위, 집게, 칼 및 페트리 접시를 사용하여 신장을 해부하고 필요한 조직 부분을 절제하십시오.</li>
	<li>신장 해부 전에 RIPA lysis 완충제 준비. 5 mM NaCl, 0.5 M EDTA, 1 M 트리스 (pH = 8.0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10 % 나트륨 디옥시콜레이트 및 10 % SDS를 이중 증류수에 녹인 다음 완전히 섞습니다. 사용하지 않을 때는 RIPA 용해 버퍼를 냉장 보관하십시오.</li>
	<li>부드럽게 반 (시상 평면)에서 신장을 잘라 조직의 조각을 잘라 (50-70mm2)신장의 중앙에 피질 영역에서 (젖은 무게에 의해 80-100 mg의 무게).</li>
	<li>조직 블록을 칼로 작은 조각으로 잘라 균질화 과정을 돕습니다.</li>
	<li>조직을 다진 후, 얼음 차가운 1x RIPA 용해 추출 버퍼 1 mL로 마이크로 퍼지 튜브로 옮김을 옮김. 튜브를 얼음에 놓고 추가 추출할 때까지 놓습니다.</li>
</ol>3. 조직 균질화
<ol><li>조직 상급 수집을 위한 특정 샘플 세부 사항으로 마이크로 퍼지 튜브에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>멸균 프로브가있는 휴대용 균질 화기를 사용하여 추운 조건 (얼음 양동이의 샘플)에서 1-2 분 동안 조직을 균질화하여 조직의 덩어리가 보이지 않을 때까지 하십시오.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 9,600 x g에서 냉장 원심분리기에서 원심분리를 위해 조직 추출물을 즉시 추출하였다.</li>
	<li>원심분리기에서 튜브를 제거하고 얼음 양동이에 놓습니다.</li>
	<li>상급체를 새로운 라벨이 붙은 마이크로 퍼지 튜브에 넣고 얼음위에 보관하십시오. 펠릿을 버리십시오.</li>
	<li>동결 해동 주기를 피하기 위해 LH 및 VEGF-A 효소 연결 면역 흡착 분석(ELISA) 및 총 단백질 분석을 위해 초나토트의 별도의 알리쿼트(aliquots)를 각각 준비합니다.</li>
</ol>4. 소와 돼지 LH 엘리사 분석
<ol><li>시판되는 황체 형성 호르몬(LH) ELISA 키트에 포함된 모든 ELISA 분석 성분을 2-8°C에서 보관합니다. 이는 항체, HRP-컨쥬게이트, 분석판(96웰), 캘리브레이터, 세척 완충제(20x 농축), 기판 A, 기판 B, 및 정지 용액을 포함한다. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.</li>
	<li>분석기를 시작하기 전에 모든 시약과 분석판을 실온(RT)으로 가져온다. 분석, 밀봉에 필요한 수의 웰을 사용하고 사용하지 않은 웰을 사용할 때까지 4°C로 유지합니다.</li>
	<li>이중 증류수로 세척 버퍼(20x 농축액 15mL)를 300 mL로 희석</li>
	<li>어떤 솔루션없이 빈 우물을 설정합니다.</li>
	<li>표준 또는 시료 50 μL을 각 웰(n= 2)에 추가한 다음, 고추냉이 과산화아제(hrp)-컨쥬게이트를 각각 잘 에 추가합니다. 즉시 각 우물에 항체 용액의 또 다른 50 μL을 추가하십시오. 플레이트를 밀봉하고 잘 섞은 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>1x 세척 버퍼(200 μL/well)로 우물을 씻고 4회 반복합니다.</li>
	<li>기판 A와 기판 B의 50 μL을 각각 잘 추가하고 측면에 있는 플레이트를 부드럽게 눌러 잘 섞습니다. 접시를 밀봉하고 37 °C에서 15 분 동안 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>각 우물에 50 μL의 스톱 솔루션을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 탭하고, 450 nm 파장에 설정된 분광광도계를 사용하여 플레이트를 읽습니다.</li>
	<li>소와 돼지 LH 수치를 총 단백질로 정상화합니다(섹션 6 참조).</li>
</ol>5. 소와 돼지 VEGF-A 엘리사 분석
<ol><li>시판되는 혈관 내피 성장 인자-A ELISA 키트에 포함된 모든 ELISA 분석 성분을 2-8°C에서 저장합니다. 이는 항체, HRP-컨쥬게이트, 분석판(96웰), 캘리브레이터, 세척 완충제(20x 농축), 기판 A, 기판 B, 및 정지 용액을 포함한다. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.</li>
	<li>분석기를 시작하기 전에 모든 시약 및 분석 판을 RT에 가져오십시오.</li>
	<li>이중 증류수로 세척 버퍼(20x 농축액 15mL)를 300 mL로 희석</li>
	<li>표준 또는 샘플의 100 μL을 각 우물에 추가합니다(n = 2). 플레이트를 밀봉하고 잘 섞은 다음 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 우물에서 액체를 제거하고 각 웰에 검출 시약 A의 100 μL을 추가하고, 플레이트를 밀봉하고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양한다.</li>
	<li>1x 세척 버퍼(400 μL/well)로 우물을 씻고 4x를 반복합니다.</li>
	<li>검출 시약 B의 100 μL을 각 우물에 추가하고 부드럽게 측면에 있는 플레이트를 눌러 잘 섞습니다. 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.</li>
	<li>1x 세척 버퍼(400 μL/well)로 우물을 씻고 4x를 반복합니다.</li>
	<li>각 우물에 90 μL의 기판 용액을 추가하고, 플레이트를 부드럽게 두드리고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>각 우물에 50 μL의 스톱 솔루션을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 탭하고, 450 nm 파장에 설정된 분광광도계를 사용하여 플레이트를 읽습니다.</li>
	<li>소와 돼지 VEGF-A 수준을 총 단백질로 정상화하십시오 (섹션 6).</li>
</ol>6. 총 단백질 추정
<ol><li>표준 소 혈청 알부민 (BSA) 분석법으로 소 및 돼지 신장 추출물의 총 단백질을 견적 상업용 키트를 사용하여 (재료 표참조) 제조업체의 권고에 따라.</li>
</ol>7. 통계분석
<ol><li>각 매말단의 평균, 중앙값 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>Kolmogorov-Smirnov 테스트를 활용하여 일반 샘플 분포의 차이를 테스트하여 사용 시 파라메트릭 과파라메트릭 간에 결정합니다. 비파라메트릭 통계 테스트. 데이터가 일반적으로 분산된 경우 파라메트릭 테스트를 통해 통계 테스트를 수행합니다.</li>
	<li>적절한 상황(예: 정규 데이터 분포)에서는 회귀 모델을 사용하여 LH와 VEGF-A 간의 선형 관계를 검사합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+Levels+of+Luteinizing+Hormone+and+VEGF+are+Strongly+Correlated+in+Healthy+Mammalian+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes.</a> Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).</li>
<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
<li>Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+Primate+Ovulatory+Follicle+Is+Stimulated+by+Luteinizing+Hormone+via+Prostaglandin+E2%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2.</a> Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).</li>
<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
<li>Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+%28LH%2FCG%29+receptor+precursor+in+a+human+kidney+cell+line+stably+transfected+with+the+rat+luteal+LH%2FCG+receptor+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA.</a> Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).</li>
<li>Lei, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+luteinizing+hormone%2Fhuman+chorionic+gonadotropin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene.</a> Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).</li>
<li>Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+in+renal+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology.</a> Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).</li>
<li>Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mature+luteinizing+hormone+receptor+in+rodent+urogenital+and+adrenal+tissues+is+developmentally+regulated+at+a+posttranslational+level%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level.</a> Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).</li>
<li>Ondruschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-mortem+in+situ+stability+of+serum+markers+of+cerebral+damage+and+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response.</a> International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).</li>
<li>Swain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+post-mortem+interval%3A+A+comparison+between+cerebrospinal+fluid+and+vitreous+humour+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+and+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry.</a> Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).</li>
<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
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<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

지츠치크 연구소(ZRI)는 민간(비영리) 연구 기관이며, 타미 모브사스 박사(ZRI의 설립자이자 이사)는 안구 질환 치료에 생식샘자극호르몬 길항제를 사용하기 위한 특허 출원 및 검증된 특허를 보유하고 있습니다. 당뇨병. ZRI의 직원(생화학자)이 되는 것 이외에, A. Muthusamy 박사는 보고할 다른 재정적 갈등이 없습니다. A. Arivalagan (ZRI에서 여름 인턴, 미시간 대학의 학부 학생) 보고 할 다른 재정적 충돌이 없습니다.

동물 사망 직후 abattoir에서 신장을 조달하는 것이이 방법론에서 성공의 열쇠입니다. 이것은 인간의 시체 대신 소와 돼지에서 장기를 활용의 주요 장점입니다. 인간 시체 기관이 조달 될 때까지 일반적으로 죽음의 시간에서 적어도 12-24 시간 지연이 있다. 신체 기관의 화학적 조성이 2시간 이내에 크게 변화하기 때문에15,16,인간 시체 신장에서의 VEGF-연구는 실제 상황을 반영하지 않을 수 있다. 이 프로토콜은 추출 후 동물 장기를 얼음에 즉시 조달하고 배치하는 것의 중요성을 크게 강조하지만 다른 연구자도이 단계를 우선 순위를 지정하는지 알 수 없습니다. 예를 들어, 최근 연구의 방법론 섹션(항생제 잔류물의 검출을 위해 소 및 돼지 신장 활용)은 동물 사망과 장기의 조달/냉장 사이의 시간 지연을 지정하지 않았다17.
이 연구는 ...

혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)는 신장 및 다른 장기의 혈관 신생 및 혈관 투과성을 조절하는 데 도움을 주며1,2 (이하, VEGF-A는 VEGF로 지칭될 것이다). 신장에 있는 VEGF 수준은 단단한 적시성 통제의 밑에 있습니다. 신장 VEGF 수준이 상승하거나 우울할 때, 신장은 오작동할 수 있습니다. 예를 들어, 출생 후 3주 이내에, VEGF에 대한 포도극세포 특이적 이종이성 마우스는 내피증및 무혈 사구체(즉, 인간 자간전증에서 보인 신장 병변)를 개발하고, 말기 신부전은 3개월까지 이 헤테로고트에서 발생한다. Podocyte 특정 동형 접합 녹아웃은 출생의 1 일 안에 수소화 및 신부전으로정지합니다3,4.
한편, 신장 VEGF의 과발현은 단백뇨 및 사구체비대3,4를유발한다. 예를 들어, VEGF를 과발현하는 형질전환 토끼는 신병증의 초기 단계에서 증가된 사구체 여과 속도를 가진 진보적인 단백뇨를 나타내고, 그 다음에 는 후기3단계에서사구체 여과 속도 감소하였다. 당뇨병 성 신증, 당뇨병 성인에서 말기 신장 질환의 주요 원인, VEGF dysregulation와 강하게 관련2,5. 병리학적 조건 하에서 VEGF 발현을 유도하는 저산소증의 역할에 많은 주의를 기울였다5. 그러나, 생리적 조건 하에서 VEGF를 지배하는 요인은 (신장및 그밖 기관 둘 다) 잘 이해되지 않습니다2,6. 생리학적 및 병리학적 VEGF 조절에 관여하는 이러한 인자(산소 제외)를 식별하는 것은 중요한 사업이다.
황체 형성 호르몬 (LH), 프로 혈관 신생 호르몬, 난소와 고환 등 생식 기관에서 생리 VEGF 발현을 조절 하는 데 도움이7,8. 이전 연구는 LH가 또한 눈6,9,10과같은 비 생식 기관에서 VEGF를 조절하는 데 도움이 된다는 증거를 제공했다. LH 수용체는신장11,12의수질및 피질에서 발견된다. 참고로, 신장 관상피 세포뿐만 아니라 LH 수용체, VEGF11,12,13,14를발현한다. 이 두 가지 관찰을 함께 복용, 우리는 LH는 또한 신장에서 VEGF 발현을 조절하는 데 도움이 가설13,14. 이 LH/VEGF 관계의 증거를 제공하기 위하여, 제시된 프로토콜은 LH 수준이 신장에 있는 VEGF 수준을 예측할 수 있다는 것을 보여주기 위하여. 신장과 관련된 많은 이전 VEGF 관련 조사는 낮은 순서의 포유동물 모델 (즉, 설치류 및토끼)를 사용했습니다 2. 이 작업을 인체로 번역하기 위해, 연구는 높은 순서의 포유동물 (여기, 소 및 돼지 모델)에서 VEGF와 LH 사이의 관계를 검사합니다. 이 목적을 수행하기 위하여는, 총 단백질 lysate는 소 및 돼지 신장의 피질 지역으로부터 제조되었다.

<table><tbody><tr><td>소 LH ELISA 키트</td><td>MyBiosource, 샌디에이고, 캘리포니아.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS700951 소 VEGF-A ELISA 키트</td><td>MyBiosource, 샌디에이고, 캘리포니아.</td><td></td><td></td>MBS2887434</tr><tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, 오하이오주 콜럼버스.</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>돼지 LH ELISA 키트</td><td>MyBiosource, 샌디에이고, CA.</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>돼지 VEGF-A ELISA</td><td>Ray Biotech, 조지아주 노크로스.</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>89901</td><td></td></tr></tbody></table>

신장 피 질 추출 물에서 혈관 내 피 성장 인자와 황 호르몬 사이의 선형 관계를 보여주는

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 신장에서 혈관 신생 및 혈관 투과성을 제어하는 데 도움이됩니다. 당뇨병 신증과 같은 신장 장애는 신장의 VEGF dysregulation와 관련이 있습니다. 신장에 있는 생리적인 조건의 밑에 VEGF를 통제하는 요인은 잘 이해되지 않습니다. 황체 형성 호르몬 (LH), 프로 혈관 신생 호르몬, 생식 기관에서 생리 VEGF 발현을 조절 하는 데 도움이. LH 수용체가 신장에서 발견된다는 것을 감안할 때, 우리는 Zietchick 연구소에서 LH가 또한 신장에 있는 VEGF 발현을 통제하는 것을 돕다는 가설을 세워주었습니다. 증거를 제공하기 위해, 우리는 LH 수준이 포유류 신장에서 VEGF 수준을 예측 할 수 있음을 보여주기 위해 목표로. 신장을 관련시키는 대부분의 VEGF 관련 조사는 모형으로 더 낮은 순서 포유동물을 이용했습니다 (즉, 설치류 및 토끼). 이 작업을 인체로 번역하기 위해, VEGF와 LH 사이의 관계를 고차 포유류(즉, 소 및 돼지 모델)에서 조사하기로 결정했다. 이 프로토콜은 신장 피질에서 총 단백질 용해를 사용합니다. 이 방법의 성공의 열쇠는 총 단백질에 의하여 분석물 수준 (신장 추출물에서)의 정상화 뿐만 아니라 죽음 직후에 도축장 동물에게서 신장의 조달을 포함합니다. 이 연구는 소와 돼지 신장 모두에서 LH와 VEGF 사이의 유의한 선형 관계를 성공적으로 보여줍니다. 결과는 두 가지 다른 종에서 재현 할 수 있습니다. 이 연구는 소와 돼지의 신장 추출물 사용이 특히 VEGF와 다른 세포체 간의 상관 관계를 검사하기 위해 신장 생리학 연구를 위한 우수하고 경제적이며 풍부한 자원이라는 증거를 제공합니다.

동물 유형 및 성별에 따라 LH 및 VEGF의 평균 및 중간 수준은 표 1에나타내고 있습니다. Kolmogorov-Smirnov 의 정상성 테스트에 의한 데이터의 정상성을 확인한 후, 선형 회귀 모델을 활용하여 LH와 VEGF 간의 관계를 조사했습니다. LH는 소 및 돼지 신장 모두에서 VEGF의 강력하고 유의한 예측인자(소 신장 모델: n=7,R2 = 0.86, p=0.002; 돼지 신장 모델: n=7; R2 = 0.66, p = 0.025).
LH/VEGF 선형 관계는 도 1(소 회귀 모델) 및 도 2(돼지 회귀 모델)에 도시되어 있습니다. 소 선형 방정식은 다음과 같습니다: VEGF ...

여기에 제시된 것은 포유류 신장에서 혈관 내피 성장 인자와 황체 형성 호르몬 사이의 상관관계를 입증하기 위해 피질 신장 추출물 제제 및 총 단백질 정규화를 활용하기 위한 프로토콜이다.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

우리의 프로토콜은 소와 돼지에서 신장 추출물의 사용이 신장 생리학의 연구를 위한 우수하고 경제적인 자원이다는 것을 관찰합니다, 특히 혈관 내피 성장 인자와 그밖 분석물 사이 상관관계를 검토합니다. 그것은 항상 VEGF를 상관 관계 하는 도전 되었습니다., 장기 혈관 신생에 필수적인 성장 인자, 다른 단백질과. 이 기술은 우리가 VEGF와 호르몬과 같은 문무호르몬 사이 협회를 검토하는 것을 허용합니다.이것은 확실히이 중요한 성장 요인에 대한 지식의 우리의 기초를 발전시킬 것입니다. 이 방법은 이 비디오에 언급된 것 외에 신장 피질 추출물의 다른 분석물을 상호 연관시키는 데 유용할 수 있다. 시각적 데모는 다른 사람들이 샘플링 오류 없이 재현 가능한 결과를 얻는 데 도움이 됩니다.신선한 조직의 사용은이 기술의 성공에 필수적이다. 동물에서 도축 직후 신선한 전체 신장을 얻는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 실험실에 조직을 전송합니다.멸균 가위, 집게, 칼 및 페트리 접시를 사용하여 신장을 해부하고 필요한 조직 부분을 소비하십시오. 신장을 시상 평면을 따라 반으로 부드럽게 자르고 신장 의 중심에있는 피질 부위에서 조직 조각을 자릅니다. 칼을 가진 작은 조각으로 조직을 다진 얼음 차가운 1X RIPA 리시스 추출 버퍼의 1 밀리리터와 마이크로 퍼지 튜브로 전송합니다.특정 샘플 세부 사항으로 튜브에 라벨을 부착하고 얼음 위에 놓습니다. 멸균 프로브가 있는 핸드헬드 균질화제를 사용하여 덩어리가 보이지 않게 될 때까지 조직을 1~2분 동안 균질화한 다음, 4도에서 5분간 9, 600배 g에서 튜브를 즉시 원심분리합니다. 원심 분리 후, 여러 동결/해동 주기를 피하기 위해 ELISA 및 총 단백질 분석을 위해 샘플의 별도의 알리쿼트를 준비합니다.분석을 시작하기 전에 모든 시약과 분석 판을 실온으로 가져와 여분의 우물을 제거하고 추가 사용까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 20X 세척 버퍼를 이중 증류수로 300 밀리리터로 희석하고 용액 없이 빈 우물을 설정합니다. 표준 또는 시료 50마이크로리터와 고추냉이 과로시다제 공주물 50마이크로리터를 각 우물에 즉시 추가한 다음, 각 우물에 50마이크로리터의 항체 용액을 즉시 추가하고 플레이트를 밀봉합니다.접시를 섞고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 세척 버퍼로 각 우물을 씻으라. 각 우물에 기판 A와 기판 B의 50 마이크로 리터를 추가, 측면에 눌러 부드럽게 접시를 혼합, 다음 밀봉하고 37섭씨에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양.각 웰에 50 마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 접시를 누르고 분광계와 450 나노미터에서 흡광도를 읽습니다. 시약을 준비하고 버퍼를 미리 정한 다음, 각 웰에 표준 또는 샘플 100 마이크로리터를 추가하고, 접시를 밀봉하고, 잘 섞고, 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.각 우물의 액체를 제거하고 100 마이크로리터의 검출 시약 A.Seal 플레이트를 밀봉하고 한 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 400 마이크로리터의 세척 버퍼로 각각 잘 씻은 다음 각 우물에 90 마이크로리터의 기판 용액을 넣고 부드럽게 접시를 탭하고 섭씨 37도에서 다시 한 시간 동안 배양합니다. 마지막 인큐베이션 후, 각 우물에 50 마이크로리터의 스톱 용액을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 누르고, 분광계로 450 나노미터에서 흡광도를 읽습니다.표준 BSA 분석으로 소와 돼지 신장 추출물의 총 단백질을 추정하고 LH 및 VEGF-A-ELISA 결과를 정상화하기 위해 이 추정치를 사용합니다. LH와 VEGF의 평균 및 중간 수준은 동물과 남녀 모두에 대해 계산되었다. 데이터의 정상성을 확인한 후 선형 회귀 모델을 활용하여 LH와 VEGF 간의 관계를 검사했습니다.LH는 소와 돼지 신장 모두에서 VEGF의 강력하고 중요한 예측변수로 밝혀졌다. 이 절차를 시도할 때, 각 조직에서 동일한 영역을 샘플링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 유사한 절차는 조직의 모든 유형을 추출하는 데 사용할 수 있습니다.사용 하는 어떤 조직의 총 단백질 추출 물으로 aalytes를 정상화 하는 것을 기억 하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

신장 기능의 회복을위한 약물의 투여는 현지화 및 치료 화합물의 분포 컨트롤이 필요합니다. 여기, 우리는 구체적으로 쥐에 약물의 신장 내 전달을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 쉽고없이 사망률과 높은 재현성으로 수행 될 수있다.

쥐의 신장에 생물의 혈관 배달

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

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타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주

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Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model (생쥐 모델에서 모낭 자극 호르몬의 생체 내 독립 효과 탐색)

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

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도설 Forebrain의 Explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

성장 요인과 단백질의 다양한 세포가 개발하는 동안 다른 세포 운명을 맡을 유도하는 상호 작용. 여기 E2.5 여자의 배아에 구슬을 배치하여 개발에 서로 다른 단백질 간의 상호 작용 가능성을 해결하기 위해 비켜 준비의 사용을 보여줍니다.

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

우리는 항원에 특정한 T 림프구 쥐 라인의 체외 확장에 사용되는 T 세포 성장 인자의 준비를 설명합니다.

랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

배우세요 소와 돼지 신장 피질 추출물을 이용한 VEGF와 LH의 상관관계 분석 방법을. ELISA와 선형 회귀 분석으로 신장 생리학 및 혈관 신생 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 정량 기법입니다.

신장 피 질 추출 물에서 혈관 내 피 성장 인자와 황 호르몬 사이의 선형 관계를 보여주는

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