Name: 전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 배우세요 전체 마운트 면역형광 및 3D 재건을 사용하여 마우스 배아 인두 아치 동맥을 시각화하고 혈관 발달을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 선천성 심장 질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 이 원고를 주의 깊게 읽고 편집해 주신 브리아나 알렉산더, 카올란 오도넬, 마이클 워칼라에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01SA의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 자금 지원; AJR은 NHLBI HL103920-08S1과 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 교육 교부금 T32052283-11에 의해 지원됩니다.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

마우스 배아의 내피를 3D로 시각화하는 기능은 개발3에대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 여기에서 우리는 배아의 고해상도 3D 화상 진찰, 혈관 연결의 가시화 및 PAA 대형의 정량적인 분석을 허용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유전 적 변경 또는 환경 모욕이 PAA 개발에 미치는 영향을 확인하기 위해 사용될 수 있습니다. 여기에서 보고된 절차는 PAA 대형을 구상하고 EC 수를 정량화하기 위하여 VEGFR2 및 ERG에 대하여 항체를 이용합니다; 그러나, 추가 항체는 신경 문장 모집 또는 평활근 세포 분화와 같은 아치 동맥 발달의 그밖 양상을 구상하고 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 절차가 배아 발생의 초기 단계에서 사용되는 경우, 이 프로토콜에서 검출된 일부 항원(예를 들어, ERG)이 아직 발현되지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. DAPI 또는 DRAQ5와 같은 다른 핵 얼룩 또는 핵 태그 추적기로 계보 라벨링을 사용하여 EC 번호를 정량화할 수 ...

마우스 배아 발생 동안, 인두 아치 동맥 (PAA)은 등등 aortae1과심장을 연결하는 대칭, 이중 측면 동맥 쌍으로 발생합니다. 배아가 발달함에 따라, PAA의 제1 및 제2 쌍은 회귀하고,3rd,4th,및 6PAA는 대동맥 아치 동맥을 형성하기 위해 일련의 비대칭 리모델링 이벤트를 겪는다2.
PAA 3, 4 및 6은 혈관 형성을 통해 발전하며, 이는 혈관의 드노보형성인 3. 이러한 아치 동맥의 형성 또는 리모델링의 결함은 DiGeorge 증후군4,5환자에서 볼 수있는 것과 같은 다양한 선천성 심장 결함을 야기합니다. 그러므로, PAA의 발달을 통제하는 기계장치를 이해하는 것은 선천성 심장병 (CHD) 병인학의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
PAA 발달을 시각화하고 분석하기 위한 현재 접근법은 조직 단면도의 면역형광, 혈관 캐스트, 인도 잉크 주입, 고분해능 후피 현미경 검사법 및/또는 전체 마운트 면역조직화학1,,4,,5,,6,,7을포함한다. 본 명세서에서, 우리는 체적 데이터, 혈관 연결성 및 세포 정체성을 수집, 분석 및 정량화하기 위해 전체 마운트 면역형광, 공초점 현미경 및 3D 이미지 렌더링을 결합한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 인두 아치 의 형성과 PAA로의 리모델링을 연구하는 수단으로 각 인두 아치의 EC 수를 구획화하고 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 PAA 개발을 분석하기 위해 설계되었지만 다른 개발 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td></td></tr><tr><td>20x 수침 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>MRD77200</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>Imaris 9.2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마-알드리치</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>8.18701.0100</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(5mg/mL 재고)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브(2.0mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 튜브 (50 mL)</td> <td>코닝</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>패스트 웰</td><td>그레이스 바이오 랩스</td><td>664113</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 VEGFR2</td><td>R & 주식회사 디 시스템즈</td><td>AF644</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 ERG</td><td>Abcam</td><td>ab214341</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(35mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(60mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 금형</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>Scapels</td><td>Exelint International Co.</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X-100</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP 151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3d 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

인두 아치 동맥의 부적절한 형성 또는 리모델링 (PAA) 3, 4, 6은 선천성 심장 질환의 가장 심각한 형태의 일부에 기여합니다. PAA의 형성을 연구하기 위하여는, 우리는 벤질 알콜/벤질 벤조에이트 (BABB) 조직 정리 및 공초점 현미경 검사법과 결합된 전체 마운트 면역 형광을 사용하여 프로토콜을 개발했습니다. 이를 통해 미세한 세포 해상도에서 인두 아치 내피의 시각화뿐만 아니라 혈관 구조의 3D 연결을 가능하게합니다. 소프트웨어를 사용하여 PAA의 내피 세포(EC)의 수와 인두 아치 내의 PA를 둘러싼 혈관 신경총 내의 EC 수를 정량화하는 프로토콜을 확립했습니다 3, 4 및 6. 전체 배아에 적용하면이 방법론은 배아 혈관 구조의 포괄적 인 시각화 및 정량 분석을 제공합니다.

여기에 제시된 전체 마운트 면역형광 프로토콜은 도 1A에서볼 수 있듯이 인두 아치 내피의 3D 재건을 허용하는 명확하고 깨끗한 결과를 생성한다. 각 항체 용액에서 충분한 시간 동안 배아를 배양하여 시료를 통한 완전한 침투를 보장하고, 배아를 철저히 세척하는 것은 항체 배양 후이다. 도 1B에서,크고 밝은 점은 항체 또는 차단 완충액 중 하나에서 미립자의 결과로 나타난다. 우리는 각 항체 배양 후에 PBST의 사용 의 앞에 각 해결책을 원심분리하고 PBST의 더 긴 기간은 이 문제를 해결한다는 것을 것을을 발견했습니다.
도 2는 프로토콜의 섹션 7...

여기서, 우리는 전체 마운트 면역 형광, 조직 정리, 공초점 현미경 및 3D 재건을 사용하여 마우스 배아의 인두 아치 동맥 3, 4 및 6을 시각화하고 분석하는 프로토콜을 설명합니다.

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

이 방법을 사용하면 각 인두 아치를 구획화할 수 있습니다. 내피 세포 수는 인두 아치 동맥 발달을 연구하는 수단으로 각 아치에서 정량화 될 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 다른 혈관 구조 간의 관계를 시각화하는 능력과 구조가 돌연변이에 어떻게 영향을 미쳤는지 정량적으로 결정하는 능력입니다.대동맥아치동맥은 선천성 심장질환으로 일반적으로 변류됩니다. 우리의 방법은 돌연변이가 혈관 형성 및 리모델링의 생리적 과정을 어떻게 변화시키는지에 대한 연구를 허용합니다. 우리는 선천성 심장병의 기계장치에 통찰력을 얻기 위하여 이 방법을 이용하더라도, 특히 광시트 현미경 검사법의 출현과 함께 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다.유리 파이펫을 사용하여 각 마우스 배아일 9.5 또는 10.5 배아를 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 개별 2개의 밀리리터 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. 고정 후, 미세 한 집게를 사용하여 뒷다리 바로 위에 배아를 조심스럽게 꼬집어 배아의 후방 절반을 제거하기 위해 횡선을 절단하십시오. 배아를 과립시키기 위해 PBS를 PBST로 대체하고 배아를 섭씨 4도에 배치하여 밤새 부드러운 동요로 놓습니다.다음 날, PBST를 600 마이크로리터의 블로킹 버퍼로 교체하여 16~18시간 배양을 위한 배아를 4°C에서 부드러운 교반으로 만지지 않고 다이징을 만지지 않습니다. 다음 날 아침, 블로킹 버퍼를 튜브당 1차 관심사 항체의 600 마이크로리터로 교체하여 4~5일 간 분비식을 완만하게 교반한다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 부드러운 동요로 4~5시간 동안 PBST1밀리리터로 배아를 세척하고, 다음 날 4~5시간 세척시 신선한 PBST에서 하룻밤 을 배양합니다.마지막 세척 후, 4~5일 잠복식을 위해 각 튜브의 PBST를 적절한 이차 항체 용액의 600 마이크로리터로 교체하십시오. 인큐베이션이 끝나면, 배아를 세척당 신선한 PBST 1밀리리터로 씻고 유리 파이펫을 사용하여 각 배아를 개별 플라스틱 파라핀 몰드로 부드럽게 옮겨냅니다. 각 배아 주위에서 PBST를 조심스럽게 제거하고 각 배아를 경각선 자세로 지향합니다.그런 다음 각 배아가 막 덮을 때까지 각 금형에 약 500 마이크로리터를 넣고 아가로즈가 고화될 때까지 알루미늄 호일로 덮인 얼음에 금형을 놓습니다. 배아 샘플의 탈수의 경우 깨끗한 메스를 사용하여 각 배아 주위에 아가로즈 블록을 자르고 집게를 사용하여 아가로즈를 파악하여 25%의 메탄올 1밀리리터를 함유한 라벨이 부착된 2밀리리터 튜브로 이송합니다. 어둠 속에서 부드러운 동요와 1 시간 배양 후, 어둠 속에서 추가 1 시간 배양에 대한 튜브 당 50 %의 메탄올의 1 밀리리터로 25 %의 메탄올을 교체합니다.탈수가 끝난 후 100% 메탄올을 50%BABB의 1밀리리터로 바흑에서 부드러운 교반으로 1시간 동안 바꿔보겠습니다. 인큐베이션이 끝나면 50%BABB를 튜브당 1밀리리터1밀리리터로 1시간 동안 튜브당 1밀리리터로 바흑에서 부드러운 교반으로 교체하고, 두 번째 인큐베이션은 100%BABB로 바릅니다. 이미징용 배아를 장착하려면 빠른 웰 범퍼에서 접착제를 제거하고 범퍼를 24x6 밀리리터 번호 1.5 유리 커버슬립에 놓습니다.접착제에 부드러운 압력을 가하여 커버슬립과 범퍼 사이의 기포를 제거하고 각 튜브에서 100% BABB를 조심스럽게 폐기하십시오. 그런 다음 미세 한 집게를 사용하여 배아를 건드리지 않고 배아를 빠르게 빠르게 옮기고 범퍼에 두 번째 커버 슬립을 놓습니다. 전체 세 번째 인두 아치에서 내신을 표면화하려면 소프트웨어에 대한 관심 이미지를 열고 새 표면을 추가클릭합니다.표면 을 두 번 클릭하고 새 표면의 이름을 세 번째 인두 아치로 바꿉니다. 자동 생성건너뛰기를 선택하고 수동으로 편집하고 표면 방향을 YZ 평면으로 설정합니다. 슬라이스 위치를 사용하여 세 번째 인두 아치 표면 평면을 세 번째 PAA 및 등갈 대자가 연결하는 위치에 배치합니다.세 번째 인두 아치 표면 평면이 보기에 있고 장교 슬라이서를 끌 도록 이미지를 회전합니다. 그리기 윤곽 모드에서 거리 그리기 모드 함수를 선택하고 필요에 따라 매개 변수 설정을 조정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 이스케이프 키를 누르고 그리기를 클릭하여 마우스 커서로 세 번째 인두 아치의 둘레를 추적합니다.그런 다음 슬라이스 위치를 사용하여 10~25개의 슬라이스를 이동하고 인두 아치의 둘레를 추적합니다. 전체 아치를 추적한 경우 서피스를 클릭하여 추적된 영역의 표면을 생성합니다. 표면 구조의 마스킹을 위해 편집 메뉴에서 세 번째 PAA 및 DAPI에 대한 마스크 선택을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 새 채널의 이름을 PAA DAPI로 바꿉니다.나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 내피 신경총을 PAA와 별도로 시각화하려면 세 번째 PAA에 대한 마스크 선택을 선택하고 DAPI를 선택합니다. 표면 외부의 복셀 선택 여부를 확인하고 표면 내부의 선택 복셀을 확인합니다.표면 내부의 선택 복셀을 0으로 설정하고 확인을 클릭합니다. 새 채널의 이름을 PAA 가 아닌 DAPI로 바꿉니다. 나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 세 번째 PA에 대한 마스크 선택을 선택하고 PAA DAPI가 아닌 것을 선택하고 확인을 클릭합니다. 새 채널의 이름을 신경총 DAPI로 변경합니다.나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 관심있는 각 구조 내에서 개별 내피 세포를 정량화하려면, 디스플레이 조정 패널에서, PAA ERG 채널을 제외한 모든 채널을 끕니다. 속성 메뉴에서 새 반점을 추가하고 클릭하여 PAA 총 내피 셀 수의 이름을 변경합니다.파란색 화살표를 클릭하고 소스 채널의 PAA ERG 채널을 선택합니다. 예상 XY 직경을 4 마이크로미터로 조정하고 파란색 화살표를 클릭하여 다음 패널로 진행합니다. 슬라이딩 스케일을 사용하여 각 ERG 양성 내피 세포 핵이 한 자리로 표현되도록 반점 수를 조정합니다.다음으로 녹색 이중 화살표를 클릭하고 디스플레이 조정 패널에서 PAA ERG 채널을 끕니다. PAA VEGFR2 채널을 켜서 PAA 내분비함을 시각화하고 편집 및 추가/삭제를 클릭하여 개체 표면을 선택합니다. 그런 다음 이스케이프를 누르고 시프트를 눌러 VEGFR2 가 아닌 모든 반점을 삭제하고 통계 탭을 클릭하여 내피 세포의 총 수를 결정합니다.전체 마운트 면역 형광은 인두 아치 내피의 3D 재건을 허용하는 명확하고 깨끗한 결과를 생성합니다. 이 이미지에서, 큰 밝은 점의 존재는 항체 또는 차단 완충액 중 하나에서 미립자의 결과입니다. 인두 아치와 PAA 표면 염색 후, 마스크 기능을 사용하면 표면 영역을 시각적으로 분리하고 독립적으로 분석할 수 있습니다.마스킹은 또한 각 구조 내에서 내피 세포 수의 개별 분석 및 정량화를 허용한다. 예를 들어, 여기서 스팟 피쳐는 ERG를 발현하는 각 핵에 대해 단일 지점을 할당하여 PAA와 신경총 모두에서 내피 세포의 총 수를 정량화하는 데 사용되었다. 이 이미지에서, 스팟 함수에 의해 생성된 ERG 양성 VEGFR2 음수 점을 관찰할 수 있다.따라서 소프트웨어에서 인식하는 각 점이 실제로 단일 내피 셀을 나타내는지 확인하는 것이 필수적입니다. 깨끗하고 선명한 이미지를 얻으려면 모든 솔루션을 회전시키고 항체 배양 후 각 배아를 적절하고 철저하게 세척해야합니다. BABB는 부식성이 있고 독성이 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.용매를 제대로 처리하고 폐기하고 BABB 누출을 방지하기 위해 용융 된 배아를 완전히 밀봉해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

여기에서는 심장 및 근육 전구 세포와 그 미세환경의 생물학을 연구하기 위해 인두궁을 배양하는 프로토콜을 제시합니다.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

죽상 동맥 경화증의 뮤린 모형은 분자 수준에 병원성 통로를 조사하기 위하여 유용한 공구입니다, 그러나 병변 발달의 표준화한 정량화가 요구됩니다. 이 프로토콜은 대동맥 근, 대동맥 아치 및 brachiocephalic 동맥을 포함하여 주요 동맥 혈관에 있는 병변 크기를 결정하기 위하여 최적화된 방법을 기술합니다.

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

이 프로토콜은 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 인간의 심장에서 얻은 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 제공합니다.

인간 심장의 다차원 3차원 해부학 연구를 위한 파이프라인

여기에서는 쥐 대동맥을 3차원(3D)으로 이미지화하기 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜을 제시합니다. 우리는 면역 염색, 광학 제거 및 이미징에 대한 최첨단 절차를 설명하며, 죽상 경화성 플라크가 있는 말초 신경계의 해부학적 근접성과 죽상 경화증의 외막을 정의하기 위해 설명합니다.

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

이 프로토콜은 광시트 형광 현미경을 사용하여 정량적 전체 마운트 3차원 혈관 이미징을 위한 신속한 방법을 소개합니다. 이 방법의 효능은 전산 유체 역학을 통해 정량화된 혈역학적 힘과 함께 병아리 배아 모델의 인두 궁 동맥 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

여기에서는 분자 또는 조직병리학적 분석을 위해 절편하기 전에 조직 안정화 젤을 혈관 내강에 주입하여 인간 동맥 구조를 보존하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

체외 내강내 젤 주입: 인간 저항 동맥의 현미경 분석을 위한 고급 접근 방식

배우세요 전체 마운트 면역형광 및 3D 재건을 사용하여 마우스 배아 인두 아치 동맥을 시각화하고 혈관 발달을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 선천성 심장 질환 연구에 활용됩니다.

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

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