Name: 마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 TOF 현미경을 이용한 마이크로 패턴 세포에서 용소체 외세포증의 공간적 정량화 방법을. 이 기술은 암과 면역 반응에서 세포 분비 동역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 크게 VAMP7-pHluorin 플라스미드를 제공하는 티에리 갈리 (정신과 및 신경 과학센터, INSERM)를 인정합니다. 통계 분석과 GOUD 연구소 회원에 대한 조언을 구하여 유익한 토론을 해주신 것에 감사드립니다. 저자는 크게 세포 및 조직 이미징 시설 인정 (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg 및 PICT-IBiSA @Pasteur) 및 니콘 이미징 센터, Institut Curie (파리), 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스 -BioImaging의 회원 프랑스 -BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L.은 협회부어 라 레체쉬 르 암 (ARC)에 의해 지원되었고 P.M.은 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 666003에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원받았습니다. 이 작품은 감염 ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), 라벡스 셀티스피비오 (ANR-10-LBX-0038) 및 이덱스 파리 과학 에 레트레스 (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)뿐만 아니라 센터 국립 디 라 리피티크에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 마이크로 패턴 세포의 준비
<ol><li>세포의 전환<ol>
<li>1일 전, 종자 2.5 x 106 hTERT-RPE1 세포를 12웰 플레이트(2 x 2cm)의 1mL배지로 1개의 우물로 넣습니다.</li>
		<li>경질 당일, VAMP7-pHluorin 플라스미드(완충제 100μL, DNA 0.8 μg, 3 μL 의 트랜스페션 혼합물)로 트랜스페션 혼합물을 준비한다. 10 분 동안 인큐베이션하십시오. 참고: VAMP7은 리소좀 v-SNARE로, 발광 플루오린 태그와 융합되어 있습니다. pHluorin 프로브는 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 엑소시토시스 양성자가 방출되고 pHluorin신호10,,11을방출하기 시작한다.</li>
		<li>배지의 세포에 회입 믹스를 추가합니다.</li>
		<li>세포에 형질 전환 믹스를 추가한 후 중간 체질의 4h를 변경합니다.</li>
		<li>다음 24-48 시간 동안 실험을 위해 세포를 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로 패턴 제제(포토리소그래피 방법)<ol>
<li>에탄올로 커버립립(직경 25mm)을 씻고 5분 동안 건조시키세요.</li>
		<li>딥 UV 에서 5 분 동안 조명으로 커버립을 활성화합니다.</li>
		<li>파라핀 필름이 배치되는 종이 타월을 철저히 가습하여 습한 챔버를 만듭니다. 폴리 L-리신-이식편-폴리에틸렌 글리콜(PLL-g-PEG) 용액(0.1 mg/mL, 10mMM HEPES, pH = 7.4)의 방울(22mm 커버슬립용 30μL)을 추가하고, 그 위에 활성화된 표면이 있는 커버립을 배치한다. 위쪽으로 습한 챔버를 닫고 커버립을 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>세척은 PBS에서 2배, 증류수1배는 건조하게 합니다.</li>
		<li>석영 포토마스크를 증류수로 씻은 다음 에탄올 또는 프로파놀로 씻으시다. 여과된 공기 흐름으로 포토마스크를 말리십시오. 참고 : 석영 포토 마스크는 마이크로 패턴의 형태로 구멍을 포함하는 반사 방지 크롬과 함께 한쪽에 코팅됩니다. 이 프로토콜에는 37 μm의 고리 모양의 미세 패턴을 포함하는 포토마스크가 사용됩니다. 포토마스크에 딥 UV가 비추면 빛은12번홀을 통과할 수 있습니다.</li>
		<li>포토마스크(크롬 코팅 면)를 딥 UV에 5분 간 노출하여 표면을 청소합니다.</li>
		<li>포토마스크의 크롬 코팅 측에 작은 물 방울(20mm 커버슬립용 10μL)을 추가합니다. 커버슬립을 PLL-g-PEG 처리 측으로 드롭에 놓고 여분의 물을 건조시다. 마스크와 커버립 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인합니다. 참고: 물의 모세관 힘이 커버립을 고정합니다.</li>
		<li>크롬 코팅이 아닌 면을 최대 5분 동안 딥 UV에 포토마스크를 노출합니다(커버립은 아래표면에 부착됨). 참고: 빛은 구멍을 통과하고 포토마스크 아래에 있는 커버립의 PLL-g-PEG 처리 표면을 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>여분의 물을 추가하여 포토마스크에서 커버립을 제거합니다. 참고: 커버립은 빠르게 떠서야 합니다.</li>
		<li>오염을 피하기 위해 하습 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 습한 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 파라핀 필름에 세포 외 매트릭스 단백질 (섬유 네틴의 50 μg /mL, 물에 희석 형광 피브리노겐의 5 μg /mL)의 용액에서 커버립을 배양한다. 참고: 실험은 4°C에서 PBS에 커버립을 저장하여 이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로패턴 표면의 세포 시드<ol>
<li>마이크로패턴 커버립의 크기에 맞는 마그네틱 커버슬립 홀더를 사용하여 커버립을 장착합니다. 획득 당일, 후속 단계 동안 셀에 대한 열 충격을 피하기 위해 커버슬립 홀더를 37°C로 가열합니다.</li>
		<li>20mM HEPES와 페니실린/연쇄 절제술의 2%로 DMEM/F12 배지를 보충하여 패턴 매체를 준비합니다.</li>
		<li>커버슬립이 홀더 베이스에 있는 즉시 마이크로패턴 면을 홀더에 놓고 패턴 매체를 추가합니다. 씰을 추가하고 자기 장치로 고정합니다. 커버슬립 홀더를 패턴 매체로 채우고 유리 뚜껑으로 닫습니다. 참고: 빨리, 커버 슬립건조를 허용하지 않도록. 씰이 PLL-g-PEG와 반응하여 세포 스트레스를 초래할 수 있는 에탄올을 유지할 수 있기 때문에 실험 사이에 에탄올로 커버슬립 홀더를 세척하지 마십시오. 커버슬립 홀더를 비눗물로만 씻으시면 됩니다. 더욱이, 조인트는 잔류 제품을 희석하기 위해 1h에 대해 37°C의 패턴 배지에서 배양될 수 있다.</li>
		<li>트립시화(12웰 플레이트의 경우 0.5mL)에 의해 감염된 hTERT-RPE1 세포를 수집하고 10% FBS DMEM/F12 배지의 1mL을 추가합니다.</li>
		<li>커버슬립 홀더에 0.5 x 106 의 전염성 hTERT-RPE1 셀을 추가하고 다시 닫습니다. 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>커버슬립 홀더5x를 패턴 매체로 세척하여 부착되지 않은 세포와 잔류 FBS를 제거하여 패턴 매체를 하나의 파이펫으로 추가하고 다른 파이펫으로 매체를 흡입하여 세척 흐름을 만듭니다. 항상 커버슬립 홀더에 소량의 패턴 매체를 보관하여 세포 사멸로 이어질 미세 패턴 커버슬립에 있는 세포의 건조를 피하십시오.</li>
		<li>전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 외세포증 데이터 수집
<ol><li>외세포증 사건의 이미징<ol>
<li>TIRM 아래에 커버슬립 홀더를 놓습니다. 최고의 이미징 형식으로 설정된 민감한 카메라로 신호를 감지해야 합니다. 참고: 이 실험에서는 100x 렌즈 목표와 512 x 512 픽셀 감지 영역이 있는 EMCCD 카메라가 사용되어 픽셀 크기가 160nm에 상승했습니다.</li>
		<li>완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 셀을 검색합니다(그림1A). 참고: VAMP7을 발현하는 세포는 녹색 신호를 나타내기 때문에 명확하게 식별할 수 있습니다.</li>
		<li>VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 외세포 속도 및 시간 척도(일반적으로 3Hz, 도 1D)와호환되는 주파수에서 5분 획득을 수행합니다. 참고: hTERT-RPE1 세포는 마이크로패턴에 약 0.3Hz의 리소피 분비율을 갖는다. 리소말 외세포증은 1s의 전형적인 지속 기간을 가지는. 그것은 기하급수적 인 부패 뒤에 피크 강도가 특징입니다. 프로브의 확산은 이 때 명백해야한다(도 1B, C).</li>
		<li>각 세포에 대해, 또한 현미경소프트웨어(도 1A)를사용하여 마이크로패턴의 취득을 수행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>외세포좌 의 취득<ol>
<li>ImageJ/FIJI로 획득한 영화를 엽니다. 파일 사용 | 가져오기 | 이미지 시퀀스. 눈으로 외세포증 이벤트를 찾을 수 있습니다. 외세포증 이벤트는 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 출현을 특징으로한다(도 1).</li>
		<li>포인트 도구를 사용하여 외식 이벤트의 중심을 표시합니다. 분석 사용 | X 및 Y 좌표와 측두구 좌표(슬라이스 번호)를 측정합니다. 영화의 모든 외세포증 이벤트에 대해 이러한 측정을 수행합니다.</li>
		<li>결과 저장(결과 | 파일 | Save As저장합니다.). 모든 외세포 이벤트에 대해 슬라이스, X 좌표 및 Y 좌표를 포함하는 "결과(cell_name).txt"라는 각 분석된 셀에 대해 텍스트 파일을 준비합니다. 텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다. ID X Y 페렛의 직경 반경 RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115 RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115 참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오.</li>
		<li>"타원형 도구"를 사용하여 각 셀의 중심과 직경을측정합니다. 완벽한 원을 맞고 (타원형을 사용하지 않음) X 및 Y 좌표와 Feret의 직경을 얻기 위해"측정"을사용합니다. 각 셀의 ID(ID), X 및 Y 좌표, Feret의 지름 및 반지름(직경/2)을 "구형 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일에 저장합니다. 텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다. ID X Y 페렛의 직경 반경 RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115 RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115 참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오.</li>
		<li>직선 공구로 마이크로패턴 링(접착 길이)의 두께를 측정하고 셀 ID, 셀 반경(파일에서 "구형 매개 변수.txt") 및 "패턴 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일의 접착 길이를 저장합니다. 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다. 참고: 모든 쉼표를 포인트별로 교체하십시오. 파일은 다음과 같아야 합니다. ID 셀 반지름 접착 길이 정규화 접착 길이 RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174 RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826</li>
	</ol></li>
</ol>3. 단일 셀 공간 분석
<ol><li>R 패키지 및 설치 참고: 이 분석을 위한 R 패키지는 Spatstat패키지(13)를 활용하여 2차원(2D) 밀도및 리플리의 K 기능을 계산합니다. 코드는 오픈 소스이며 이전에 설명한 텍스트 파일을 사용합니다.<ol>
<li>https://www.r-project.org/ 다운로드 및 설치 R (버전 3.5.2이 분석에 사용되었습니다).</li>
		<li>패키지(및 데모 데이터 집합)를 다운로드 https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper합니다.</li>
		<li>"패키지설치"를 사용하여 R 스튜디오에패키지를 설치합니다. "패키지아카이브 파일(.zip; .tar.gz)" 카테고리"설치:"를 선택하고 패키지 파일을 선택합니다. "설치"를누릅니다.</li>
		<li>""엑소시토시스공간분석")"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를로드합니다.</li>
		<li>함수"ESA()"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를실행합니다. 참고: 사용자 인터페이스가 열립니다.</li>
		<li>데이터 집합(.txt 파일)의 디렉터리와 출력 플롯의 디렉토리를 선택합니다. 참고: 분석의 매개 변수(아래 텍스트 참조)는 사용자 인터페이스를 통해 변경할 수 있습니다.</li>
		<li>이 스크립트는 자동으로 시작되어 분석을 수행합니다. 그것은 숫자 결과를 포함하는 해당 플롯 및 .txt 파일의 .pdf 파일을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li>
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</ol>

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우리는 반지 모양의 마이크로패턴 정규화 된 세포에서 VAMP7-pHluorin의 TIRFM 라이브 셀 이미징에 의해 리소소말 구획에서 외세포증 이벤트를 모니터링하고 외세포증 이벤트의 공간 매개 변수에 대한 엄격한 통계 분석을 수행했습니다. 변형된 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리에 따른 통계 시험을 통해 리소좀으로부터의 분비가 무작위 공정8,,9가아니라는 것을 확인했습니다. 두 통계 분석 모두 외세포증 이벤트가 클러스터링(그림2D 및 2G)을나타낸다는 것을 설득력 있게 보여주었다. 미동 세포 영역에 유사한 도구를 적용하면 외세포증 이벤트가 미동부위(그림 2E 및 2I)에도클러스터되어 있음을 발견했습니다. 따라서, 이전에 클러스터링6을 허용하도록 보고된 접...

외세포증은 소포가 플라즈마 멤브레인과 융합되어 그 함량을 방출하는 보편적 인 세포 과정입니다. 소포는 플라즈마 멤브레인 (전체 융합)과 완전히 융합하거나 제한된 시간 동안 열려있는 융합 모공을 만들 수 있습니다 (키스 앤 런)1. 예를 들면, 새로 합성된 단백질은 골지 복합체에서 온 소포에서 세포외 배지로 풀어 놓입니다. 이 생합성, 전방 급료 경로는 원시, 특히 다세포 유기체에서 신호 펩티드 (예를 들어, 호르몬, 신경 전달 물질) 및 세포 외 매트릭스 구성 요소 (예를 들어, 콜라겐)를 분비뿐만 아니라 플라즈마 막에 대막 단백질을 트래픽. 추가적으로, 분비물은 다른 내분모에서 생길 수 있습니다: 1) 막 단백질을 재사용하기 위하여 내모를 재활용; 2) 다중 혈관 몸 (MVBs) 엑소좀을 방출; 및 3) 프로테오리틱 효소의 방출을 위한 리소좀. 내뇌 분비는 중성염 아웃성장, 의사포디아 형성, 혈장 막 수리 및 ATP 의존신호2에중요한 것으로 나타났다.
단일 세포 수준에서 외세포증을 연구하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었습니다. 패치 클램프는 다양한 살아있는 세포3에서높은 시간적 해상도로 단일 외세포증 이벤트를 검출할 수 있게 한다. 그러나 이 방법은 외세포증 이벤트의 국소화에 대한 정보도, 어떤 구획이 발생하는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전자 현미경 검사는 높은 공간 해상도를 가진 외세포 사건의 직접 시각화를 허용하고, 면역 라벨링과 함께 관련된 구획 및 분자의 특이성에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 단점은 프로세스의 역학에 대한 정보의 부족뿐만 아니라 높은 처리량 연구를 수행 할 수 없다는 것입니다. 커버슬립(100nm) 부근에서 형광을 비추기 위해 에반에센드 필드를 이도하는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRFM)과 같은 경현미경접근법은 외세포증 사건을 연구하기 위한 좋은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공한다. 그러나 이 방법은 부착 된 세포와만 호환되며 세포의 복부 / 열등한 부분에만 적용 할 수 있습니다.
참고로, 플라즈마 멤브레인은 제한된 영역에만 존재하는 접착제 복합체를 기반으로 상당한 이질성을 드러냅니다. 이 이질성은 예를 들어, 다른 리간드4의섭취를 제한합니다. 유사하게, 최근에는 골기 복합체로부터의 분비가 혈장 막5의"핫스팟"에 집중되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 특정 화물은 초점 접착 관련 엑소시토시스6을통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 외세포증 이벤트가 공간에 무작위로 분포되는지, 아니면 혈장 막의 특정 부위에 집중되는지 여부에 대한 질문에 특별한 주의를 기울여야 한다. Ripley의 K 함수를 기반으로 한 여러 통계 도구는 이러한 질문을 탐구하기 위해 제안되었습니다7,,8,,9. 우리의 접근은 세포 모양 및 플라즈마 막 이질성을 통제하기 위하여 마이크로패터닝과 이 공구를 결합합니다. 접착제와 미적 영역을 구별하는 수단을 제공하는 것 외에도 이 기술은 다른 세포및 조건에 걸쳐 비교할 수 있으며 통계 분석의 힘을 증가시킵니다.
여기서는 TIRFM 라이브 셀 이미징이 모니터링하는 리소냐구획으로부터의 외세포증 이벤트의 공간 분포를 링 모양의 마이크로패턴-정규화 hTert-RPE1 세포에서 연구하기 위해 다양한 통계 도구를 사용합니다. 리소좀으로부터의 분비액은 무작위 과정이아님을확인하였고,,외세포증 이벤트는 클러스터링을 나타낸다. 참고로, 우리는 외세포증 사건이 또한 미각 부위에 클러스터되어 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력은 클러스터링을 향상시켰습니다. 일관되게, 우리의 분석은 접착제와 nonadhesive 지역 사이 국경에 있는 외세포증의 풍부한 지역을 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td>Chamlide 마그네틱 챔버</td><td>Chamlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td><td>분자 프로브, Invitrogen</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴 소 플라즈마</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>hTert RPE1 세포주</td><td>https://www.atcc.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td> <td>n/a</td><td>W. Rasband 저, NIH/NIMH</td></tr><tr><td>JetPRIME 형질주입 시약</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>포토마스크</td><td>델타 마스크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG 용액</td><td>표면 솔루션</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>R Software</td><td>https://www.r-project.org/</td> <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (TrypLE Express 1X)</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>UV 오존 오븐</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342-220</td><td></td></tr><tr><td>VAMP7-pHFluorin plasmid</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>논문 참고문헌 :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008년 12월 5일; 283(49):34365-73. 도: 10.1074/JBC. M804587200. 클라트린 의존성 세포내이입에서 HRB의 역할. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td></tr></tbody></table>

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

pHluorin 태그 용불성 N-ethylmalimide-민감한 인자 부착 단백질 REceptor (v-SNARE) 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)에 의해 소포 관련 멤브레인 단백질 7 (VAMP7)의 라이브 이미징은 리소말 구획에서 분비를 탐구하는 간단한 방법입니다. 마이크로패턴 표면에서 세포 배양을 활용하여 세포 형상을 정상화하기 위해 다양한 통계 도구를 사용하여 분비 패턴의 공간 분석을 수행했습니다. 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리(NND)를 기반으로 한 통계 테스트를 사용하여 리소좀의 분비가 무작위 과정이 아니라 상당한 클러스터링을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 참고로, 우리의 분석은 외세포증 사건이 또한 미적혈 부위에 클러스터된다는 것을 밝혔습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력이 클러스터링을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 정확하게 정의된 접착제 및 미적 영역 외에도 이러한 미세 패턴의 원형 형상을 사용하면 극좌표를 사용하여 해석을 단순화할 수 있습니다. 엑소세포증 의 극성 좌표에 커널 밀도 추정(KDE)과 누적 분포 기능을 사용하여 외세포증의 농축 영역을 식별했습니다. 링 모양의 마이크로패턴 세포에서 접착제와 무나정 영역 사이의 경계에서 클러스터링이 발생했습니다. 우리의 분석은 다양한 생물학적 과정의 공간 분포를 조사하기 위해 통계 도구를 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

외세포증 이벤트의 현면 특성은 hTert-RPE1 세포에서 VAMP7-pHluorin10,,11에 의해 시각화된 리소좀으로부터 분석되었다. hTert-RPE1 세포는 마이크로패터닝에 잘 채택되고 이전 마이크로패턴 기반 연구에서 광범위하게 사용된 비변형세포4,,14이다. VAMP7은 리소솜 v-SNARE15로, N-terminus에서 슈퍼 이클립틱 pHluorin과 태그되어 리소좀의 루멘에 위치하고 있습니다. 세포 내부, pHluorin 프로브는 리소좀의 낮은 pHH에 의해 담금질되었다, 그러나 외세포 피루오린 동안 양성자 방출에 의한 pHH가 증가하기 때문에 신호를 방출하기 시작했다. VAMP7-pHluorin은 TIRFM 라이브 세포 이미징에 의해 고리 모양의 마이크로패턴(도<...

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

이 프로토콜은 TOF 현미경검사법에 의한 라이브 이미징을 사용하여 세포 분비를 조사하는 방법을 보여 주며 군집 이벤트 또는 높은 활성 영역을 검출하는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 세포 분열을 정상화하고 따라서 분비 이벤트의 특별한 범위를 용이하게 마이크로 패턴 표면에 세포 배양을 생성 할 수 있습니다. 세포는 면역 조절에서 중요한 역할을 하는 다양한 거대 분자를 분비합니다.암에서, 규제 된 분비 침략을 촉진 하는 단백질 분해 효소의 방출에 영향을 미칩니다. 분비의 정량화는 우리가 암및 항원 프리젠 테이션이 있는 그밖 동적 프로세스에 있는 저하된 분비를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 우리의 화상 진찰 및 분석 프로토콜은 간단하더라도, 마이크로 패턴의 조각에 잘 퍼지는 단 하나 세포의 생성을 요구합니다.이 비디오에서는 마이크로패턴 커버립에서 세포를 배양하는 방법과 간격 통계 도구를 사용하여 비밀 이벤트를 시각화하고 분석하는 방법을 시연합니다. 마이크로패터닝을 위해 커버립을 준비하려면 에탄올을 살균하여 25mm 직경의 유리 커버립을 깊은 자외선 아래에서 5분간 활성화하십시오. 커버립이 활성화되는 동안 커버슬립당 폴리에틸렌 글리콜30 마이크로리터 드롭을 습한 챔버 내파라핀 필름에 넣습니다.활성화가 끝나면 커버립활성화 표면면을 낙하에 내려놓고 습한 챔버를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 커버립을 증류수로 두 번 씻으실 수 있습니다. 커버립이 건조되는 동안 석영 포토 마스크를 증류수로 한 번, 술로 한 번 씻으십시오.여과 된 공기 흐름으로 포토 마스크를 건조하고 5 분 동안 깊은 자외선에 깊은 자외선에 크롬 코팅 사진 마스크 크롬을 노출. 조명의 끝에서, 각 사진 마스크의 크롬 코팅 측에 물 10 마이크로 리터 드롭을 추가하고 각 커버 슬립의 폴리에틸렌 글리콜 측면을 물 방울에 배치합니다. 여분의 물을 제거 한 후, 탈수를 방지하기 위해 슬라이드 위에 필름 커버를 배치합니다.사진 마스크의 비크롬 코팅 측면을 깊은 자외선에 노출시키고 5분 간 추가로 포토 마스크에 여분의 물을 추가하여 커버립을 제거합니다. 이 단계는 표면에 마이크로 패턴 인쇄물을 생성합니다. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에서 1시간 동안 습한 챔버에서 파라핀 필름에 세포외 매트릭스 단백질 용액으로 커버립을 배양한다.준비된 마이크로패턴 표면에 셀 파종의 경우, 인큐베이션의 끝에 커버립을 자기 커버슬립 홀더 마이크로패턴 측에 넣고 즉시 패턴 매체를 커버립에 추가합니다. 씰을 추가한 후 커버슬립 홀더를 추가 패턴 매체로 채우기 전에 자기 장치로 커버립을 고정합니다. 그런 다음 유리 뚜껑으로 홀더를 닫습니다.세포가 준비되면, 감염된 불멸의 망막 색소 상피 세포의 5분의 5에 5회 10번을 추가하고 세포 배양인에서 10분 동안 홀더내의 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 두 번째 파이펫을 사용하여 세척당 신선한 배지로 세포를 5회 세척하는 동안 오래된 배지를 흡인하기 위해 파이펫 을 사용하여 부착되지 않은 세포와 잔류 태아 소 혈청을 제거하십시오. 마지막 세척 후, 전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 홀더를 반환합니다.외세포증 이벤트를 이미지하기 위해, 커버슬립 홀더를 총 내부 반사 형광 현미경 아래에 놓고 완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 세포를 검색한다. VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경하고 외세포 속도 및 시간대와 호환되는 주파수에서 5분 간의 수집을 수행한다. 외세포증 좌표를 얻으려면 피지에서 획득된 엑소시토시스 이벤트 영화를 열고 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 모양으로 엑소시토시스 이벤트를 수동으로 식별합니다.포인트 도구를 사용하여 외세포증 이벤트의 중심을 표시하고 분석 및 측정을 사용하여 x 및 y 좌표뿐만 아니라 측두측 좌표를 측정합니다. 한 텍스트 파일에 한 셀의 측정값을 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 슬라이스 x 및 y 좌표 열을 제외한 모든 부분을 제거합니다.다음으로 타원형 도구를 사용하여 측정하여 중심과 직경을 측정하고 각 셀의 x 및 y 좌표 및 Feret의 직경을 얻습니다. 모든 셀의 측정값을 한 텍스트 파일에 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 x 및 y 좌표 및 Feret의 지름 열을 제외한 모든 것을 제거합니다.그런 다음 각 셀에 대한 반지름 측정을 추가한 다음 각 셀에 대한 Feret 직경에서 반경을 가져옵니다. 직선 도구를 사용하여 각 셀의 마이크로패턴 링의 두께를 측정합니다. 한 텍스트 파일의 모든 셀에 대해 이 측정값을 저장한 다음 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다.단일 셀 공간 분석을 위해 먼저 RStudio 패키지를 설치하고 RStudio에 패키지를 로드합니다. ESA 함수로 패키지를 실행합니다. 사용자 인터페이스가 열리고 데이터 집합 TXT 파일의 디렉터리와 출력 플롯에 대한 디렉토리를 선택합니다.스크립트는 자동으로 분석을 시작하고 수행하여 해당 플롯및 숫자 결과가 포함된 TXT 파일의 PDF 파일을 제공합니다. 세포 내부, 프로브의 바닥은 리소좀의 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 외세포증 동안, pHluorin은 양성자 방출로 인해 pH가 증가함에 따라 신호를 방출하기 시작한다. pHluorin 신호는 리소소말 양성자의 빠른 방출을 나타내는 외세포증 동안 피크를 나타내고, 플라즈마 멤브레인에서 프로브의 2D 확산을 나타내는 지수 신호 붕괴가 뒤따릅니다.전형적으로, 임신 불멸의 인간 망막 색소 상피 세포는 0.28 Hertz의 평균 외세포율을 가진 중요한 리소말 분비 활성을 보여줍니다. 커널 밀도 추정에 의해 외세포증의 2D 분포를 시각화하여 로컬 밀도의 차이를 나타낼 수 있다. 클러스터링, 분산 또는 클러스터링 및 분산의 혼합물과 같은 완전한 공간 임의성에서 세 가지 가능한 편차가 있습니다.리플리의 K 함수를 사용하여 이러한 편차를 평가할 수 있습니다. 참고로, 비접착영역에서의 외세포증 이벤트는 또한 접착 분자가 혈장 막에서 분비 핫스팟을 유도하는 유일한 구조가 아니라는 것을 나타내는 클러스터링된다. 대표적인 셀에 대한 계수에 따라 외세포증 사건의 히스토그램을 플로팅하면 접착제와 비 접착 영역 사이의 경계 주변의 피크가 드러난다.쌍분석결과, 비유착 영역보다 접착 영역에서 표면 밀도가 낮으며, 잠재적으로 세포 주변의 외세포증의 강한 감소로 인한 것으로 나타났습니다. 마이크로패턴에 대한 세포 접착력과 통계 분석을 결합하면 분비와 같은 복잡한 세포 프로세스가 공간에서 어떻게 조절되는지 파악할 수 있습니다. 분비 활동의 클러스터링의 기초가 되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해서는 더 많은 미래의 작업이 필요합니다.

quantifying-spatiotemporal-parameters-cellular-exocytosis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 성장의 미세유체 패터닝 및 형광 기반 추적

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요​​하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

이 프로토콜에서, 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법을 기반으로 하는 세포 퍼지는 분석의 실험 절차를 제시합니다. 당사는 형광으로 표지된 세포의 편견없는 세분화와 세포 확산 중 라멜리포디아 역학의 정량적 분석을 위한 오픈 소스 계산 도구를 제공합니다.

셀 확산 시 셀 엣지 역학의 정량적 분석

pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.

시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

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배우세요 TOF 현미경을 이용한 마이크로 패턴 세포에서 용소체 외세포증의 공간적 정량화 방법을. 이 기술은 암과 면역 반응에서 세포 분비 동역학 연구에 활용됩니다.

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

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