게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

현재 사용 가능한 생화학적 접근법을 사용하여 세포 표면 상호 작용의 검출은 여전히 기술적 인 과제를 제기합니다. 이 프로토콜은 세포 표면에서 수용체 리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 스케일 세포 스크리닝 접근법을 사용하여 유전적 대안을 제공한다. 대부분의 다른 기존 방법과는 달리,이 방법은 수용체의 생물학에 관한 가정을하지 않습니다.

그것은 세포 표면 분자의 넓은 범위에 의해 중재된 상호 작용을 확인하는 기회를 제공합니다. 세포 표면 분자는 단일 클론 항체와 같은 약물에 직접 접근 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 분자에 의해 중재 상호 작용의 식별 중요 한 치료 의미를 가질 수 있습니다.

이 방법은 일반적으로 세포 신호 및 인식 프로세스를 탐구에 관심이 있는 연구원에 적용, 신경 및 면역 상호 작용을 포함 하 여 생물학적 컨텍스트의 넓은 범위에 호스트 병원 체 상호 작용. 이 프로토콜에는 높은 처리량 셀 정렬 기계와 차세대 시퀀싱 기계가 필요합니다. 프로토콜을 시작하기 전에 이러한 시설을 사용할 수 있는지 확인합니다.

96웰 플레이트에서 바이오티니화 단백질 샘플의 8개의 직렬 희석제를 만들어 각 희석의 최종 부피가 적어도 200마이크로리터이고 태그 전용 제어가 포함되어 있는지 확인합니다. 각 우물에서 100 마이크로리터를 제거하고 새로운 96웰 플레이트로 전송하여 샘플의 중복 플레이트를 만듭니다. 모든 결합 에세이에서 제어 프로브로 사용되는 태그 전용 단백질 제어를 포함합니다.

밀리리터 스트렙타비딘-PE당 0.1 마이크로리터 100마이크로리터를 플레이트 의 우물에 넣고, 다른 플레이트의 우물에 희석 완충제 100마이크로리터를 넣습니다. 상온에서 20분 동안 접시를 배양합니다. 한편, 15분 동안 희석 버퍼로 스트렙타비딘 인코딩 플레이트의 우물을 차단한다.

접시를 씻은 후, 건조했는지 확인하십시오. 그런 다음 두 플레이트에서 streptavidin 코딩 플레이트의 개별 우물로 샘플의 총 부피를 전송하고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 워시 버퍼 200 마이크로리터로 접시를 세 번 씻으시다.

마우스 안티 래트 Cd4d3 +4 IgG의 100 마이크로 리터를 추가하고 다른 시간 동안 접시를 배양. 세서히를 반복합니다. 항 마우스 알칼리인인스파타제 컨쥬게이트 100마이크로리터를 넣고 1시간 동안 실온에서 플레이트를 둡니다.

그런 다음 세척 버퍼로 우물을 세 번 씻고 희석 버퍼로 한 번 씻습니다. 염료 에탄올라민 버퍼에서 밀리리터당 1밀리그램으로 p-니트로페닐 인산염을 준비하고 각 웰에 100 마이크로리터를 추가합니다. 15분 배양 후, 흡광도가 각각 405 나노미터로 잘 가지고 있는 것을 측정합니다.

테트라머를 만들기 위해 적절한 희석 계수로서 플레이트에 신호가 없는 최소 희석을 사용합니다. 배양 스테레타비딘-PE 및 실온에서 30분 동안 적절한 바이오티니드 단백질 희석. 그런 다음 추가 사용이 끝날 때까지 4도의 가벼운 보호 튜브에 컨쥬게이징된 단백질을 보관합니다.

처리된 원식 튜브를 회전시키고 5분 동안 200배 G에서 시료를 제어합니다. 상체를 제거하고 나중에 사용하기 위해 영하 20도에서 튜브 중 하나를 동결하십시오. 1%BSA로 PBS의 10 밀리리터에서 다른 튜브에 펠릿을 다시 중단하고 96웰 플레이트에 대한 음의 대조군으로 세포의 100 마이크로리터를 따로 둡니다.

그런 다음 원뿔관 내의 세포 현탁액과 96웰 플레이트에 미리 결합된 재조합 단백질을 첨가한다. 부드러운 회전을 가진 벤치탑 로터에서 섭씨 4도에서 적어도 1 시간 동안 세포 염색을 수행하십시오. 그런 다음 5 분 동안 200 배 G에서 세포를 펠릿하고 상체를 제거합니다.

세포를 두 번 세척한 후 PBS의 5밀리리터에서 다시 중단하십시오. 세포 클러스터를 제거하기 위해 30 마이크로미터 여과기를 통해 세포를 변형시보세요. 그런 다음 흐름 소도르로 분석합니다.

음의 제어 샘플을 사용하여 BFP 양수 및 PE 음수 셀을 게이트합니다. 그런 다음 샘플을 정렬하고 500, 000 ~ 1백만 BFP 양성 및 PE 음성 세포를 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 아픈 케이지는 단백질에 세포의 결합에 따라 달라집니다, 하지만 일반적으로 PE 음성 샘플의 1 ~ 5 %가 수집된다.

이제 정렬 된 세포를 5 분 동안 500 회 G에 원심 분리하여 조심스럽게 슈퍼 나탄을 제거하십시오. 펠릿은 최대 6개월 동안 영하 20도까지 보관할 수 있습니다. 매직의 개수 함수를 사용하여 정렬되지 않은 정렬되지 않은 모집단에서 원시 카운트 파일을 산출하는 참조 라이브러리에 시퀀스를 매핑합니다.

정렬되지 않은 제어 샘플의 원시 카운트를 사용하여 마법의 테스트 기능을 제어하고 정렬된 샘플의 카운트를 처리로 실행합니다. 생성된 유전자 요약 파일을 열고 일시 중지 순위 열을 오름차순으로 순위를 지정합니다. 그런 다음 0.05 점 미만의 잘못된 검색 률로 안타를 식별합니다.

수용체는 일반적으로 첫 번째 위치에서 매우 자주 순위가 매겨지습니다. 마지막으로 R 또는 동등한 소프트웨어를 사용하여 강력한 순위 알고리즘 점수를 플롯하여 양수 선택을 합니다. 인간 TNFSF9 및 P 팔시파룸 또는 인간 TNFSF9 및 P falciparum Rh5의 H5의 결합 파트너의 식별을 위한 게놈 스케일 녹다운 스크린은 각각 NCI-SNU-1 및 HEC-293 세포에서 수행되었다.

Rh5의 결합 행동은 헤파란 황산염 모두에 의해 영향을 받았으며 TN-FRSF-9는 알려진 수용체 TN-FSF-9에 결합을 잃지 않은 반면 알려진 수용체 BSG입니다. 수용성 헤파린을 곁들인 사전 잠복시. 제어 돌연변이 라이브러리의 GNA 분포는 실험 과정에서 라이브러리 복잡성이 유지되었다고 밝혔다.

스크린의 기술적 품질은 필수 유전자의 참조 세트에 대한 분포에 비해 G-RNA의 비 필수 유전자의 기준 세트를 대상으로 관찰 된 접이식 변화의 분포를 검사하여 평가되었다. 또한, 통로 수준 농축은 예상되는 필수 통로가 확인되고 중퇴 인구에서 현저하게 풍부했다는 것을 밝혔습니다. 컨트롤 샘플을 원래 플라스미드 라이브러리와 비교할 때.

견고한 랭크 알고리즘 또는 RRA 점수는 G-RNA가 지속적으로 예상보다 높은 순위를 차지하는 척도를 제공합니다. TNFRSF9의 화면에서 탑 히트는 알려진 바인딩 파트너인 TNFSF9였습니다. 또한, TP53 경로와 관련된 다수의 유전자도 확인되었다.

RH5의 경우, 공지된 수용체 이외에, 황산 개그의 생산에 필요한 유전자, SLC16A1 유전자도 확인되었다. 선별 접근법은 일반적으로 매우 견고하며 직접 상호 작용하는 수용체는 인구의이 순서로 농축 된 유전자 목록에 높이 평가되어야합니다. 화면에서 얻은 조회수를 확인하는 것이 중요합니다.

상호 작용이 단백질에 의해 중재되는 경우에, 이진 단백질 단백질 상호 작용을 공부하도록 디자인된 생화학적인 접근은, 예를 들면, 추가 검증 연구 결과를 위해 이용될 수 있었습니다. 이 접근법의 편견 없는 게놈 규모 특성 때문에, 우리는 지질, 다중 패스 막 단백질 및 글리칸과 같은 세포 분자를 연구하기 어려운 에 의해 중재된 상호 작용을 탐구하는 데 도움이 될 것으로 예상합니다. 그것은 또한 수용 체 인신 매매 및 생물학에 필요한 새로운 통로를 공개 할 수 있습니다.