Name: 게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 유전 스크리닝을 활용한 세포 표면 수용체-리간드 상호작용 식별 방법을. 이 기법은 편향 없이 다양한 세포 표면 분자의 결합을 탐색하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 보조금 번호 206194에 의해 지원되었다 GJW에 수여. 우리는 세포 분석 코어 시설 감사합니다: 꿀벌 링 Ng, 제니퍼 그레이엄, 샘 톰슨, 그리고 크리스토퍼 홀 FACS에 도움.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

세포 인식에 관여하는 세포 성분을 코딩하는 유전자를 식별하기 위한 CRISPR 기반 스크리닝 전략이 설명되어 있습니다. CRISPR 활성화를 이용한 유사한 접근법은 또한 큰 단백질라이브러리(26)를생성할 필요 없이 재조합 단백질의 직접 상호 작용하는 수용체를 식별하는 유전적 대안을 제공한다. 그러나, 이 접근법의 한 가지 주요 장점은 세포상에 기본적으로 표시되는 표면 분자에 의해 매개되는 상호작용에 적용 가능하고 수용체의 과발현에 의존하지 않으며, 이는 수용체의 결합 열성에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 다른 방법과는 달리, 따라서, 이 기술은 수용체의 생화학적 성질 또는 세포 생물학에 관하여 아무 가정도 하지 않으며 아주 큰 단백질과 같은 생화확적인 접근을 사용하여 공부하기 일반적으로 어려운 단백질에 의해 중재된 상호 작용을 공부하는 기회를 제공합니다, 또는 그 막을 여러 번 통과하거나 그밖 단백질을 가진 복합체를 형성하고, 글리칸, 글리콜리피및 피피등 단백질 이외에 분자. 방법의 게놈 스케일 특성을 감안할 때, 이 접근법은 또한 수용체뿐만 아니라 결합 이벤트에 필요한 추가세포 성분을 식별할 뿐만 아니라, 수용체의 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공한다는 장점이 있다.
고아 단백질의 수용체를 확인하기 위하여 그것을 사용할 때 이 방법의 중요한 한계의 한은 단백질에 묶는 세포줄을 첫째로 확인하기 위하여 처음 필요조건입니다. 이는 항상 쉬운 것은 아니며 유전적 스크린에도 허용되는 결합 표현형을 표시하는 세포주를 식별하는 것은 이러한 분석을 전개하기 위한 시간 제한 단계가 될 수 있다. 몇몇 세포주는 그 외 보다는 더 많은 단백질에 묶는 경향이 있습니다. 이것은 HS를 묶는 단백질을 위해 특히 관련이 있습니다, 이 단백질은 네이티브 결합 문맥에 관계없이 HS 측사슬을 표시하는 어떤 세포주든지에 결합하는 경향이 있기 때문에. 추가적으로, 우리는 세포주에서 신데칸(즉, HS를 포함하는 프로테오글리칸)의 상향 조절이 HS 결합 단백질26의증가된 결합으로 이어진다는 것을 관찰하였다. 이것은 스크리닝을 위한 세포주 선택 시 고려할 요인이 될 수 있다. 그러나, 또한 주목해야 할 점은 HS의 첨가제 결합이 특정 수용체에 대한 결합을 방해하지 않는다는 것입니다. 이는 결합이 관찰되는 경우, 이러한 분석에서 HS에 의해 매개된 결합이 공동의존적(19)이아닌 첨가제이기 때문에 HS에 의해서만 매개될 수 있음을 의미한다. 이러한 시나리오에서, 설명된 헤파린 차단 접근법은 전체 유전자 스크린을 수행할 필요 없이 이러한 동작을 식별할 수 있다.
세포주 선택에 유용한 자원은 ~1,000암 세포주27에대한 유전체학, 전사학 및 배양 상태 정보를 포함하는 세포 모델 패스포트이다. 생물학적 맥락에 따라, 세포는 그들의 발현 단면도에 근거를 둔 선택될 수 있다. 세포주의 선택을 돕기 위해, 우리는 ~1,500 미리 된 인간 세포 표면 당단백질28의 발현에 따라 세포 모델 여권에서 ~ 1,000 세포주를 클러스터화하였다(보충 도 2;성장 조건과 함께 각 세포주에 대한 클러스터 정보는 보충 표 2에제공된다). 알 수없는 기능을 가진 단백질의 결합을 테스트 할 때, 수용체의 넓은 범위를 커버의 기회를 증가시키기 위해 각 클러스터에서 대표 세포주의 패널을 선택하는 것이 유용하다. 선택의 여지가 주어지면 배양하기 쉽고 변환하기 쉬운 세포주를 선택하는 것이 좋습니다. 이들 세포주는 게놈 스케일 스크리닝에 사용될 것이기 때문에, 그들은 다량으로 쉽게 성장될 수 있고 렌티바이러스 전달에 허용되는 것이 바람직하며, 이는 이후 단계에서 CRISPR 기반 유전자 스크리닝을 위한 sgRNA의 전달을 위한 가장 일반적으로 이용가능한 방법이기 때문이다.
일반적으로 표현형 선택은 단일 방식으로 수행됩니다. 그러나, 이것은 대조군과 비교하여 염색된 세포 집단의 밝기에 의해 결정된다. 선택의 반복적인 라운드는 원하는 표현형의 신호 대 잡음 비율이 낮은 시나리오에 채택될 수 있고, 또는 스크린의 목적은 강한 표현형이 있는 돌연변이를 확인하는 것입니다. FACS 기반 스크린에 대한 반복선택 접근법을 사용하는 경우, 선별기의 순수한 힘으로 인해 선별 과정이 세포 사멸을 유발할 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 수집된 모든 셀이 다음 정렬 라운드에서 나타나지는 않습니다.
라이브러리 복잡성은 성공적인 유전 스크린을 수행하는 데 매우 중요한 요소이며, 특히 부정적인 선택 스크린의 경우 이러한 고갈 의 정도는 시작 라이브러리에 있는 것과 결과를 비교하여 결정될 수 있기 때문입니다. 네거티브 선택 화면의 경우 500-1,000 x 복잡성의 라이브러리를 유지하는 것이 일반적입니다. 긍정적 인 선택 화면은, 그러나, 라이브러리 크기에 더 강력한, 이러한 화면에서 돌연변이의 작은 수는 특정 표현형에 대해 선택 될 것으로 예상되기 때문에. 따라서 여기에 설명된 양수 선택 화면에서 라이브러리 크기는 화면 품질을 손상시키지 않으면서 50-100배 복잡성으로 감소할 수 있습니다. 또한, 이들 스크린에서 주어진 세포주들에 대해 당일 에 정렬된 모든 샘플에 대해 "일반 대조군"으로서 주어진 세포주들에 대한 제어 라이브러리를 사용할 수도 있다. 이렇게 하면 생성 및 순서를 설정해야 하는 컨트롤 라이브러리의 수가 줄어듭니다.
이 접근을 사용하기 위한 또 다른 중요한 고려 사항은 시험관 내 세포 성장에 필수적인 유전자를 확인하는 기능 상실 스크린의 한계입니다. 스크린의 타이밍은 이 점에서 결정적입니다, 돌연변이 세포가 배양에서 더 이상 유지되기 때문에, 필수 유전자에 있는 돌연변이를 가진 세포가 불가능하게 되고 돌연변이 도서관에서 더 이상 표현되지 않는 확률이 높습니다. 300개 이상의 세포주에서 프로젝트 스코어 이니셔티브의 일환으로 수행된 최근 유전자 스크린은 KEGG 에이버레이션된 단백질 분비 및 N-글리코실화 경로내의 여러 유전자가 종종 다수의 세포주(보충도 3)에 필수적인 것으로 확인됨을보여준다(보충도 3)29. 이는 세포 인식 과정의 맥락에서 증식 및 생존에 필요한 유전자의 효과를 조사할 경우 스크린을 설계할 때 고려될 수 있다. 이 경우 초기 시점(예: 9일째 후 환전)에서 화면을 수행하는 것이 일반적으로 적절합니다. 그러나, 접근이 일반적인 세포 통로 보다는 오히려 강한 크기 효력을 가진 몇몇 표적을 확인하기 위하여 이용되는 경우에, 나중에 시점 (예를 들면, 15-16 사후 변환)에 스크린을 능력을 발휘하는 것이 적절할 지도 모릅니다.
스크리닝의 결과는 매우 강력합니다. 과거에 수행된 8개의 재조합 단백질 결합 스크린에서, 세포 표면 수용체는 모든 경우에19에서최고 히트였다. 상호 작용 파트너를 확인하기 위하여 이 접근을 사용하는 경우에, 사람은 그러므로 수용체 및 표면에 그것의 프리젠테이션에 기여하는 요인이 높은 통계적인 신뢰로 확인될 것을 기대해야 한다. 스크린이 수행되고 히트가 단일 gRNA 녹아웃을 사용하여 검증되면, 추가 후속은 표면 플라스몬 공명을 사용하여 정제 된 단백질의 직접 포화 결합과 같은 AVEXIS4와 같은 기존의 생화학 적 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 여기서 기재된 접근법은 수용성 재조합 결합 프로브를 생성할 수 있는 모든 단백질에 적용가능하다.
요약하면, 이것은 세포 표면 단백질에 의해 매개되는 상호 작용을 확인하기 위한 게놈 규모 CRISPR 녹아웃 접근법입니다. 이 방법은 일반적으로 유기체의 자신의 세포 (예를 들어, 신경 및 면역 학적 인식) 뿐만 아니라 숙주 세포와 병원체 단백질 사이를 포함하여 다양한 생물학적 맥락에서 세포 표면 인식에 필요한 세포 경로를 식별하기 위해 적용 가능하다. 이 방법은 수용체 식별을 위해 설계된 생화학적 접근법에 대한 유전적 대안을 제공하며, 수용체의 생화학적 성질 또는 세포 생물학에 관한 어떠한 사전 가정을 필요로 하지 않기 때문에 완전히 예상치 못한 발견을 할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있다.

세포 표면 수용체 단백질에 의한 세포 외 상호 작용은 조직 조직, 호스트 병원체 인식 및 면역 조절과 같은 중요한 생물학적 과정을 지시합니다. 막 수용체가 단클론 항체와 같은 체계적으로 전달된 치료제의 실행 가능한 표적이기 때문에 이러한 상호 작용을 조사하는 것은 더 넓은 생물 의학 사회에 흥미를 가지고 있습니다. 그들의 중요성에도 불구 하 고, 이러한 상호 작용을 공부 하는 것은 기술적으로 도전 남아. 이는 주로 막 내장 수용체가 양과병성이기 때문에 생화학적 조작을 위해 생물학적 막으로부터 분리하기 어렵고, 이들의 상호작용은 약한 상호작용 친화도(μM-mM 범위의KDs)에의해 대표되기 때문이다1. 따라서, 많은 일반적으로 사용되는 방법은 단백질 상호작용의이클래스를 검출하기에 적합하지 않습니다1,2.
다양한 방법이 특별히 그들의 독특한 생화학적 특성을 고려한 세포외 수용체-리간드 상호작용을 조사하기 위해 개발되었다3. 이러한 접근법의 숫자는 이러한 단백질이 글리칸 및 이황화 결합과 같은 구조적으로 중요한 번역 후 변형을 포함하도록 포유류 또는 곤충 세포 기반 시스템에서 수용성 재조합 단백질로서 수용체의 전체 ectodomain을 발현하는 것을 포함한다. 낮은 친화성 결합을 극복하기 위해, ectodomains는 종종 그들의 결합 열력을 증가시키기 위해 올리고머화된다. 열렬한 단백질 ectodomains는 성공적으로 직접 재조합 단백질 상호 작용 스크린4,,5,,6,,7에서상호 작용 파트너를 확인하기 위해 결합 프로브로 사용되었습니다. 광범위하게 성공하는 동안, 재조합 단백질 기반 방법은 막 수용체의 ectodomain가 수용성 단백질로서 생산될 것을 요구한다. 따라서, 인접 한 세포 외 영역 (예를 들어, 단일 패스 유형 I, 유형 II, 또는 GPI-고정)을 포함 하는 단백질에만 일반적으로 적용 가능 하 고 일반적으로 수용 체 복합체 복합체 및 막 여러 번 에 걸쳐 막 단백질에 적합 하지 않습니다.
상보성 DNA(cDNO)의 라이브러리가 세포내로 형질 전환되고 결합의 이득 표현형을 시험하는 발현 복제 기술은 또한 세포외 단백질 상호작용을 식별하기 위해 사용되어왔다 8. 최근 몇 년 동안 복제 되고 서열화된 cDNA 발현 플라스미드의 큰 컬렉션의 가용성은 cDNAs 인코딩 세포 표면 수용체를 과발현하는 세포주들이 상호작용을 확인하기 위해 재조합 단백질의 결합을 위해 스크리닝되는 방법을 용이하게 한다9,,10. cDNA 과발현 기반 접근법은 재조합 단백질 기반 방법과 달리 혈장 막의 맥락에서 상호 작용을 식별할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 cDNA 발현 구성을 사용하는 성공은 올바르게 접힌 형태로 단백질을 과발현하는 세포의 능력에 달려 있지만, 이것은 종종 수송기, 샤페론 및 올바른 올리고머 어셈블리와 같은 세포 액세서리 요인이 필요합니다. 단 하나 cDNA를 transfecting는 그러므로 세포 표면 표현을 달성하기 위하여 충분하지 않을 지도 모릅니다.
cDNA 구성또는 재조합 단백질 프로브를 이용한 스크리닝 기술은 자원 집약적이며 cDNA 또는 재조합 단백질 라이브러리의 대규모 수집이 필요합니다. 특별히 설계된 질량 분석 기반 방법은 최근에 큰 라이브러리의 조립을 필요로하지 않는 세포외 상호 작용을 식별하기 위해 활용되었습니다. 그러나, 이들 기술은 세포 표면의 화학적 조작을 필요로 하며, 이는 세포의 표면에 존재하는 분자의 생화학적 성질을 변화시킬 수 있으며 현재 는 당화 단백질11,,12에의해 매개된 상호작용에만 적용가능하다. 현재 유효한 방법의 대다수는 또한 크게 글리칸 지질 및 콜레스테롤과 같은 분자를 포함하여 막 미세 환경에서 기여를 무시하는 동안 단백질 사이 상호 작용에 집중합니다.
CRISPR 기반 접근법을 사용하여 고효율 이중 알레온 표적화의 최근 개발은 다른 맥락에서 관련된 세포 구성 요소를 식별하기 위해 체계적이고 편견없는 방법으로 선별 할 수있는 단일 풀에서 정의 된 유전자가 부족한 세포의 게놈 스케일 라이브러리를 가능하게했습니다. 세포 신호 처리 과정 해부, 약물, 독소 및 병원균에 대한 내성을 부여하는 교란의 식별, 항체의 특이성 결정13,,14,,15,,16을포함한다. 여기에서, 우리는 세포외 수용체-리간드 상호작용을 확인하기 위하여 현재 생화확적인 접근에 대안을 제공하는 게놈 규모 CRISPR 기지를 둔 녹아웃 세포 검열 분석법을 기술합니다. 유전 스크린에 의해 막 수용체에 의해 중재된 상호 작용을 확인하는 이 접근은 cDNAs 또는 재조합 단백질의 큰 라이브러리를 컴파일할 필요를 피하기 때문에 개별 리간드에 초점을 맞춘 관심사를 가진 연구원을 위해 특히 적당합니다.
이 분석법은 세 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다: 1) 관심 있는 수용체의 세포외 영역으로 구성된 고도로 열렬한 재조합 단백질 결합 프로브가 형광계 유세포계 계 결합 분석에서 생산및 사용; 2) 결합 세포는 재조합 단백질 프로브의 상호작용 파트너를 발현하는 세포수를 식별하는데 사용된다; 3) 관심 있는 단백질과 상호작용하는 세포주의 Cas9 발현 버전이 생성되고 게놈 스케일 CRISPR/Cas9 기반 녹아웃 스크린이 수행된다(도1). 이러한 유전자 화면에서, 재조합 단백질을 세포주로 결합하는 것은 프로브를 결합하는 능력을 상실한 녹아웃 라이브러리 내의 세포가 형광 계활성 세포 선별(FACS) 및 시퀀싱에 의해 확인된 결합 표현형의 손실을 야기한 유전자를 사용하여 분류되는 측정 가능한 표현형으로서 사용된다. 원칙적으로, 열렬한 프로브와 그 세포 표면 디스플레이에 필요한 결합을 담당하는 수용체를 코딩하는 유전자가 확인된다.
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 막 결합 수용체의 ectodomain을 나타내는 열렬한 재조합 단백질 프로브의 생산을 포함한다. 이들 수용체는 그들의 ectodomains가 재조합 수용성 단백질1로발현될 때 그들의 세포외 결합 기능을 자주 유지하는 것으로 알려져 있다. 관심 있는 단백질을 위해, 수용성 재조합 단백질은 결합 열력을 증가시키기 위해 올리고머화될 수 있고, 형광계 세포측정 기반 결합 분석(예를 들어, FLAG-tag, 비오틴 태그)에 사용될 수 있는 태그를 함유하는 임의의 형식에서 임의의 적합한 진핵 단백질 발현 시스템에서 제조될 수 있다. HEK293 단백질 발현 시스템을 이용한 막 수용체의 수용성 외피 도메인의 생산을 위한 상세한 프로토콜은 다양한 다중화 기술뿐만 아니라 펜타머 성 단백질 및 단일성 단백질의 생산을 위한 단백질 발현 구문들모두의양체단백질 및 단일성 단백질의 생산을 위한 컨셉티클 생성을 위해 이전에 설명된1,17. 여기서 프로토콜은 불소화(예를 들어, 피코에리트린, 또는 PE)에 공액화된 스트렙타비딘을 공액화함으로써 단조로운 생체면역 단백질로부터 형광 열렬한 프로브를 생성하는 단계를 설명할 것이며, 이는 세포 기반 결합 분석에서 직접 사용될 수 있고 검출을 위한 이차 항체를 필요로 하지 않는다는 장점이 있다. 게놈 스케일 스크린을 수행하기 위한 일반적인 프로토콜은 이미20,,21,따라서 프로토콜은 주로 인간 V1("Yusa")라이브러리를사용하는 CRISPR/Cas9 녹아웃 스크리닝 시스템을 사용하여 유세포분석 기반 재조합 단백질 결합 스크린을 수행하는 특이성에 초점을 맞추고 있다.

<table><tbody><tr><td>안티 마우스 알칼리성 인산 가수분해 효소</td><td>시그마</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>블라스티시딘</td><td>켐크루즈</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>혈액 & 세포 배양 DNA 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>디 에탄올 아민</td><td>시그마</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 혈액 및 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 측면 자석</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 포장 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX with PLUS 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>XDP 세포 분류기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA 아가로스 비드</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 항체</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-니트로페닐 포스페이</td>트 <td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레인</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 튜브, 5mL 베드 용량</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR 등급</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 핫 스타트 고화질 2&times; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SCFA 필터</td><td>, Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr>, <tr><td>Sony Cell sorter</td>, <td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr>, <tr><td>Streptavidin-coated microtitre plates</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘-PE</td><td>바이오레전</td>드 <td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

게놈 규모 crispr/cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

막 내장 된 세포 표면 수용체 사이의 직접적인 상호 작용에 의해 매개 된 세포 간 통신은 다세포 유기체의 정상적인 발달및 기능에 매우 중요합니다. 그러나 이러한 상호 작용을 감지하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 이 원고는 특정 세포 표면 인식 사건에 필요한 세포 경로를 밝히는 체계적인 게놈 규모 CRISPR/Cas9 녹아웃 유전자 스크리닝 접근법을 설명합니다. 이 분석법은 포유류 단백질 발현 시스템에서 생성된 재조합 단백질을 열렬한 결합 프로브로서 세포 기반 유전자 화면에서 상호작용 파트너를 식별합니다. 이 방법은 막-임베디드 수용체의 ectodomains에 대응하는 재조합 결합 프로브에 의해 검출된 세포 표면 상호작용에 필요한 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다. 중요한 것은, 이 접근법의 게놈 스케일 특성을 감안할 때, 또한 직접 수용체뿐만 아니라 세포 표면에서 수용체의 프리젠테이션에 필요한 세포 성분을 식별할 뿐만 아니라, 수용체의 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공한다는 장점이 있다.

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

현재 사용 가능한 생화학적 접근법을 사용하여 세포 표면 상호 작용의 검출은 여전히 기술적 인 과제를 제기합니다. 이 프로토콜은 세포 표면에서 수용체 리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 스케일 세포 스크리닝 접근법을 사용하여 유전적 대안을 제공한다. 대부분의 다른 기존 방법과는 달리,이 방법은 수용체의 생물학에 관한 가정을하지 않습니다.그것은 세포 표면 분자의 넓은 범위에 의해 중재된 상호 작용을 확인하는 기회를 제공합니다. 세포 표면 분자는 단일 클론 항체와 같은 약물에 직접 접근 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 분자에 의해 중재 상호 작용의 식별 중요 한 치료 의미를 가질 수 있습니다.이 방법은 일반적으로 세포 신호 및 인식 프로세스를 탐구에 관심이 있는 연구원에 적용, 신경 및 면역 상호 작용을 포함 하 여 생물학적 컨텍스트의 넓은 범위에 호스트 병원 체 상호 작용. 이 프로토콜에는 높은 처리량 셀 정렬 기계와 차세대 시퀀싱 기계가 필요합니다. 프로토콜을 시작하기 전에 이러한 시설을 사용할 수 있는지 확인합니다.96웰 플레이트에서 바이오티니화 단백질 샘플의 8개의 직렬 희석제를 만들어 각 희석의 최종 부피가 적어도 200마이크로리터이고 태그 전용 제어가 포함되어 있는지 확인합니다. 각 우물에서 100 마이크로리터를 제거하고 새로운 96웰 플레이트로 전송하여 샘플의 중복 플레이트를 만듭니다. 모든 결합 에세이에서 제어 프로브로 사용되는 태그 전용 단백질 제어를 포함합니다.밀리리터 스트렙타비딘-PE당 0.1 마이크로리터 100마이크로리터를 플레이트 의 우물에 넣고, 다른 플레이트의 우물에 희석 완충제 100마이크로리터를 넣습니다. 상온에서 20분 동안 접시를 배양합니다. 한편, 15분 동안 희석 버퍼로 스트렙타비딘 인코딩 플레이트의 우물을 차단한다.접시를 씻은 후, 건조했는지 확인하십시오. 그런 다음 두 플레이트에서 streptavidin 코딩 플레이트의 개별 우물로 샘플의 총 부피를 전송하고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 워시 버퍼 200 마이크로리터로 접시를 세 번 씻으시다.마우스 안티 래트 Cd4d3 +4 IgG의 100 마이크로 리터를 추가하고 다른 시간 동안 접시를 배양. 세서히를 반복합니다. 항 마우스 알칼리인인스파타제 컨쥬게이트 100마이크로리터를 넣고 1시간 동안 실온에서 플레이트를 둡니다.그런 다음 세척 버퍼로 우물을 세 번 씻고 희석 버퍼로 한 번 씻습니다. 염료 에탄올라민 버퍼에서 밀리리터당 1밀리그램으로 p-니트로페닐 인산염을 준비하고 각 웰에 100 마이크로리터를 추가합니다. 15분 배양 후, 흡광도가 각각 405 나노미터로 잘 가지고 있는 것을 측정합니다.테트라머를 만들기 위해 적절한 희석 계수로서 플레이트에 신호가 없는 최소 희석을 사용합니다. 배양 스테레타비딘-PE 및 실온에서 30분 동안 적절한 바이오티니드 단백질 희석. 그런 다음 추가 사용이 끝날 때까지 4도의 가벼운 보호 튜브에 컨쥬게이징된 단백질을 보관합니다.처리된 원식 튜브를 회전시키고 5분 동안 200배 G에서 시료를 제어합니다. 상체를 제거하고 나중에 사용하기 위해 영하 20도에서 튜브 중 하나를 동결하십시오. 1%BSA로 PBS의 10 밀리리터에서 다른 튜브에 펠릿을 다시 중단하고 96웰 플레이트에 대한 음의 대조군으로 세포의 100 마이크로리터를 따로 둡니다.그런 다음 원뿔관 내의 세포 현탁액과 96웰 플레이트에 미리 결합된 재조합 단백질을 첨가한다. 부드러운 회전을 가진 벤치탑 로터에서 섭씨 4도에서 적어도 1 시간 동안 세포 염색을 수행하십시오. 그런 다음 5 분 동안 200 배 G에서 세포를 펠릿하고 상체를 제거합니다.세포를 두 번 세척한 후 PBS의 5밀리리터에서 다시 중단하십시오. 세포 클러스터를 제거하기 위해 30 마이크로미터 여과기를 통해 세포를 변형시보세요. 그런 다음 흐름 소도르로 분석합니다.음의 제어 샘플을 사용하여 BFP 양수 및 PE 음수 셀을 게이트합니다. 그런 다음 샘플을 정렬하고 500, 000 ~ 1백만 BFP 양성 및 PE 음성 세포를 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 아픈 케이지는 단백질에 세포의 결합에 따라 달라집니다, 하지만 일반적으로 PE 음성 샘플의 1 ~ 5 %가 수집된다.이제 정렬 된 세포를 5 분 동안 500 회 G에 원심 분리하여 조심스럽게 슈퍼 나탄을 제거하십시오. 펠릿은 최대 6개월 동안 영하 20도까지 보관할 수 있습니다. 매직의 개수 함수를 사용하여 정렬되지 않은 정렬되지 않은 모집단에서 원시 카운트 파일을 산출하는 참조 라이브러리에 시퀀스를 매핑합니다.정렬되지 않은 제어 샘플의 원시 카운트를 사용하여 마법의 테스트 기능을 제어하고 정렬된 샘플의 카운트를 처리로 실행합니다. 생성된 유전자 요약 파일을 열고 일시 중지 순위 열을 오름차순으로 순위를 지정합니다. 그런 다음 0.05 점 미만의 잘못된 검색 률로 안타를 식별합니다.수용체는 일반적으로 첫 번째 위치에서 매우 자주 순위가 매겨지습니다. 마지막으로 R 또는 동등한 소프트웨어를 사용하여 강력한 순위 알고리즘 점수를 플롯하여 양수 선택을 합니다. 인간 TNFSF9 및 P 팔시파룸 또는 인간 TNFSF9 및 P falciparum Rh5의 H5의 결합 파트너의 식별을 위한 게놈 스케일 녹다운 스크린은 각각 NCI-SNU-1 및 HEC-293 세포에서 수행되었다.Rh5의 결합 행동은 헤파란 황산염 모두에 의해 영향을 받았으며 TN-FRSF-9는 알려진 수용체 TN-FSF-9에 결합을 잃지 않은 반면 알려진 수용체 BSG입니다. 수용성 헤파린을 곁들인 사전 잠복시. 제어 돌연변이 라이브러리의 GNA 분포는 실험 과정에서 라이브러리 복잡성이 유지되었다고 밝혔다.스크린의 기술적 품질은 필수 유전자의 참조 세트에 대한 분포에 비해 G-RNA의 비 필수 유전자의 기준 세트를 대상으로 관찰 된 접이식 변화의 분포를 검사하여 평가되었다. 또한, 통로 수준 농축은 예상되는 필수 통로가 확인되고 중퇴 인구에서 현저하게 풍부했다는 것을 밝혔습니다. 컨트롤 샘플을 원래 플라스미드 라이브러리와 비교할 때.견고한 랭크 알고리즘 또는 RRA 점수는 G-RNA가 지속적으로 예상보다 높은 순위를 차지하는 척도를 제공합니다. TNFRSF9의 화면에서 탑 히트는 알려진 바인딩 파트너인 TNFSF9였습니다. 또한, TP53 경로와 관련된 다수의 유전자도 확인되었다.RH5의 경우, 공지된 수용체 이외에, 황산 개그의 생산에 필요한 유전자, SLC16A1 유전자도 확인되었다. 선별 접근법은 일반적으로 매우 견고하며 직접 상호 작용하는 수용체는 인구의이 순서로 농축 된 유전자 목록에 높이 평가되어야합니다. 화면에서 얻은 조회수를 확인하는 것이 중요합니다.상호 작용이 단백질에 의해 중재되는 경우에, 이진 단백질 단백질 상호 작용을 공부하도록 디자인된 생화학적인 접근은, 예를 들면, 추가 검증 연구 결과를 위해 이용될 수 있었습니다. 이 접근법의 편견 없는 게놈 규모 특성 때문에, 우리는 지질, 다중 패스 막 단백질 및 글리칸과 같은 세포 분자를 연구하기 어려운 에 의해 중재된 상호 작용을 탐구하는 데 도움이 될 것으로 예상합니다. 그것은 또한 수용 체 인신 매매 및 생물학에 필요한 새로운 통로를 공개 할 수 있습니다.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

여기, 우리 CRISPR-Cas9-대상 활동의 손실 없이 더 높은 특이성을 달성 하기 위해 최적화 하는 프로토콜을 제시. 우리는 원하는 특성을 가진 돌연변이 Cas9를 찾을 수 라고 스나이퍼-화면 감독된 진화 접근을 사용 합니다. 스나이퍼-Cas9와 잘린된 단일 가이드 RNAs는 ribonucleoprotein 형태로 배달 높은 특이성을 달성 하기 위한 잘 알려진 전략 이다.

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

이 논문은 건강한 기증자 키메라 항원 수용체 T 세포에서 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하기 위해 고갈에 대한 체외 모델을 적용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

키메라 항원 수용체 T 세포에서 체외 게놈 와이드 CRISPR 녹아웃 스크리닝 수행

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

게놈 차원의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을 적용하여 방사선의 저항성 및 민감성 유전자를 선택하기 위한 세심하고 구조화된 접근 방식이 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 임상적으로 투여되는 화학 약물에 대한 내성 메커니즘을 조사하는 다른 연구 노력을 위한 다재다능한 프레임워크 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

우리는 원발성 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 개발했습니다. 효소 소화와 sgRNA 카세트 풀다운을 통한 gDNA 운반을 줄임으로써 PCR 인공물을 최소화하고 정확한 sgRNA 검출과 기능성 유전자 표적의 견고한 식별을 보장합니다.

CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

배우세요 CRISPR/Cas9 유전 스크리닝을 활용한 세포 표면 수용체-리간드 상호작용 식별 방법을. 이 기법은 편향 없이 다양한 세포 표면 분자의 결합을 탐색하여 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

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