Name: 슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 배우세요 토마토 묘목 홍수 분석법으로 슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항성을 고처리량으로 선별하는 방법입니다. 이 기술은 야생 토마토 계통의 유전적 저항성을 신속하게 식별하여 식물 병리학 연구의 효율성을 높입니다.

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우리는 질병 이나 저항 결과에 미디어 볼륨의 효과 테스트 에 대 한 제이미 Calma 감사 합니다. 루이스 연구소의 마엘 보딘 박사와 칼 J. 셰이버 박사에게 원고에 대한 건설적인 의견과 제안을 해주신 것에 감사드립니다. 루이스 실험실에서 식물 면역에 대한 연구는 USDA ARS 2030-21000-046-00D 및 2030-21000-050-00D (JDL) 및 생물 과학 IOS-1557661 (JDL)에 대한 NSF 이사회(JDL)에 의해 지원되었습니다.

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<li>Martin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map-based+cloning+of+a+protein+kinase+gene+conferring+disease+resistance+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato.</a> Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).</li>
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<li>Salmeron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+Prf+is+a+member+of+the+leucine-rich+repeat+class+of+plant+disease+resistance+genes+and+lies+embedded+within+the+Pto+kinase+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster.</a> Cell. 86 (1), 123-133 (1996).</li>
<li>Scofield, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+gene-for-gene+specificity+in+bacterial+speck+disease+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato.</a> Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).</li>
<li>Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+evolutionary+analyses+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+is+genetically+monomorphic+and+under+strong+selection+to+evade+tomato+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity.</a> PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130(2011).</li>
<li>Almeida, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).</li>
<li>Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+AvrPtoB+homologs+from+several+Pseudomonas+syringae+pathovars+elicit+Pto-dependent+resistance+and+have+similar+virulence+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).</li>
<li>Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+Pto+pathogen+resistance+gene+within+species+of+wild+tomato+%28Lycopersicon%29.+I.+Functional+analysis+of+Pto+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles.</a> Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).</li>
<li>Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+QTLs+controlling+resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1+strains+from+the+wild+tomato+Solanum+habrochaites+LA1777%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777.</a> Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).</li>
<li>Bao, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+gene+in+Solanum+habrochaites+for+resistance+to+a+race+1+strain+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Genome%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).</li>
<li>Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+seedling+resistance+assay+identifies+wild+tomato+lines+that+are+resistant+to+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+race+1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).</li>
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<li>Uppalapati, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+on+tomato+seedlings%3A+phenotypic+and+gene+expression+analyses+of+the+virulence+function+of+coronatine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).</li>
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<li>Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+tock%3A+circadian+regulation+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator.</a> Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

토마토 모종에서 이러한 세균 균주에 대한 저항성을 검출하도록 최적화된 PstDC3000 또는 PstT1을 사용하여 홍수 접종을 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 세균 농도 및 계면활성제 농도를 포함하는 모종 저항성 분석에서 최적의 결과를 위한 몇 가지 중요한 파라미터가 있으며, 이는 경험적으로22로결정되었다. PstDC3000의 경우, 광학 밀도는 Pto/Prf 클러스터를 포함하는 내성 품종에서 완전한 생존을 달성하도록 최적화되었으며 Pto/Prf 클러스터(22)가결여된 취약한 품종에서 완전한 죽음을 달성하도록 최적화되었다. 알려진 내성 품종이 없는 PstT1과 같은 변형의 경우, 광학 밀도는 일관되고 완전한 식물사멸(22)에대해 가능한 가장 낮은 것으로 최적화되었다. Uppalapati 외<sup class...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60805">High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay</a>. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

슈도모나스 주사기는 광범위한 식물 숙주를 감염시키는 그람 음성 병원성 박테리아입니다. 세균은 구내 또는 물리적 상처를 통해 숙주 식물에 진입하여 apoplast1에서증식합니다. 식물은 세균성 병원체에 의한 감염으로부터 보호하기 위해 2계층 면역 반응을 진화시켰습니다. 첫번째 수준은 식물 세포 막에 패턴 인식 수용체가 PAMP 트리거된 면역 (PTI)에게 불린 프로세스에 있는 높게 보존된 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs)를 인식하는 식물 세포 표면에서 생깁니다2. 이 과정에서 숙주 식물은 세포벽에 칼로오스 증착, 구내 종단 폐쇄, 반응성 산소 종의 생산 및 병인 관련 유전자의 유도를 포함한 방어 반응 경로를 upregulates.
박테리아는 식물 세포3에직접 이펙터라고 불리는 단백질을 전달하기 위해 III 형 분비 시스템을 이용하여 PTI를 극복 할 수 있습니다. 이펙터 단백질은 일반적으로 PTI의 성분을 표적으로 하고 병원체독성을 촉진합니다 4. 식물 면역의 두 번째 단계는 이펙터 단백질을 인식하면 식물 세포 내에서 발생합니다. 이러한 인식은 레지스탕스 유전자에 의존하며, 이는 뉴클레오티드 결합 부위류신-풍부한 수용체(NLRs)를 함유하고 있다. NlR은 이펙터를 직접 인식하거나 독성 대상 또는 미끼5에서자신의 활동을 인식 할 수 있습니다. 그(것)들은 감염의 사이트에 현지화한 세포 죽음의 한 형태인 과민반응 (HR)과 수시로 연관되는 이펙터 트리거된 면역 (ETI)에게 불린 프로세스에 있는 이차 면역 반응을트리거합니다 6. ETI와 관련된 유전자 에 대한 유전자 저항과는 대조적으로, 식물은 다중 유전자7의기여에 의존하는 양적 부분 저항성을 나타낼 수 있다.
P. 주사기 pv. 토마토 (Pst)는토마토에 세균 성 반점의 인과 에이전트이며 지속적인 농업 문제입니다. 필드에 우세한 균주는 일반적으로 중 하나 또는 유형 III 이펙터 AvrPto 및 AvrPtoB의 둘 다를 표현하는 Pst 경주 0 균주되었습니다. DC3000(PstDC3000)은 대표적인 경주 0 균주 및 토마토에 세균 성 반점을 일으킬 수있는 모델 병원체입니다. 세균성 반점 질환에 대처하기 위해, 육종가들은 Pto [P. 주사기 pv. 토마토]/Prf [Pto 저항성 및 펜티온 민감성]유전자 클러스터를 야생 토마토 종솔라눔 포피넬리폴리움에서 현대 품종으로8,9. Pto 유전자는 Prf NLR과 함께, 이펙터 AvrPto 및 AvrPtoB10,11,12,13,14의인식을 통해 PstDC3000에 저항성을 부여하는 세린-트레오닌 단백질 키나아제인을 인코딩한다. 그러나, 이 저항은 신흥 인종에 대한 효과가 1 균주, 최근 몇 년 동안 자신의 신속하고 공격적인 확산을 허용15,16. 레이스 1 균주는 AvrPto가 이러한 균주에서 분실되거나 돌연변이되기 때문에 Pto / Prf 클러스터에 의한 인식을 회피하고 AvrPtoB는 최소15,17,18을축적하는 것으로 보입니다.
야생 토마토 개체군은 Pst 저항에 대한 자연변화의 중요한 저수지이며, 이전에는 잠재적 저항성 로시19,20,21을식별하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 병원체 저항에 대한 현재의 스크린은 4-5 주 령 성인 식물20,21를이용합니다. 따라서, 이들은 성장 시간, 성장 챔버 공간 및 상대적으로 작은 샘플 크기에 의해 제한된다. 종래의 접근법의 한계를 해결하기 위해 10일 된 토마토 묘목22를사용하여 고처리량 토마토 P. 주사기 저항 분석법을 개발했습니다. 이 접근 방식은 성인 용 식물을 사용하는 데 비해 몇 가지 이점을 제공합니다: 즉, 성장 시간 단축, 공간 요구 사항 감소 및 더 높은 처리량. 더욱이, 우리는 이 접근법이 성인 식물22에서관찰된 질병 저항 표현형을 충실하게 재현한다는 것을 입증했다.
본 프로토콜에 기재된 모종 홍수 분석에서, 토마토 모종은 10일 동안 멸균무라시게 및 스쿠그(MS) 매체의 페트리 접시상에서 재배된 후 관심 있는 박테리아및 계면활성제를 함유하는 접종제로 범람한다. 홍수 후, 모종은 세균 성장 분석을 통해 질병 저항성을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 또한, 모종 생존 또는 사망은 홍수 후 7-14일 후에 이산 저항성 또는 질병 표현형으로 작용할 수 있다. 이 접근법은 Pst 균주T1(PstT1)과 같은 Pst 경주 1 균주에 대한 저항성을 위해 많은 수의 야생 토마토 수탁을 스크리닝하기 위한 높은 처리량 대안을 제공하며, 관심 있는 다른 세균 균주에 쉽게 적응할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>3M 테이프 Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m)</td><td>VWR International</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>3mm 붕규산 유리 구슬</td><td>Friedrich & Dimmock</td><td>GB3000B</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>생물 광도계 플러스</td><td>Eppendorf</td><td>E952000006</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety 캐비닛, 클래스 II 유형 A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>브랜드 일회용 플라스틱 큐벳, 폴리스티렌</td><td>VWR International</td><td>47744-642</td><td></td></tr><tr><td>셔닐 실 Kraft 편평한 나무 이쑤시개</td><td>VWR International</td><td>500029-808</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>Research Products International</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산칼륨 무수, ACS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>디메틸포름아미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경(최소 10배 확대)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 - 190 Proof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 폴리스티렌 96 웰 마이크로 플레이트, 평평한 바닥</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-3</td><td></td></tr><tr><td>유리 알코올 버너 심지</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41898A / No. W-125</td><td></td></tr><tr><td>유리 알코올 버너</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41898 / No. BO125</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 ACS 시약</td><td>VWR International</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark&trade; Kimtech 과학 및 무역; 킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘, ACS 등급</td><td>VWR International</td><td>97061-356</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 헵타하이드레이트, ACS 등급</td><td>VWR International</td><td>97062-130</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 1.5mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 2.2mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater-96, 115 볼트</td><td>바이오 스펙 제품 Inc.</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>무라시게 & Skoog, 기초 염</td><td>Caisson Laboratories, Inc.</td><td>MSP01-50LT</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL</td><td>Rainin</td><td>L8-20XLS</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 100mm x 25mm 멸균 페트리 접시</td><td>VWR International</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 150mm x 15mm 멸균 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 150x15mm 멸균 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (100% bleach로 정의)</td><td>스테이플</td><td>1013131</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77 (비이온 유기실리콘 계면활성제 공중합체 C13H34O4 Si3 계면활성제)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NCO138454</td><td></td></tr><tr><td>팁 LTS 20 &mu; L 960/10 GPS-L10</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>팁 LTS 250 &mu; L 960/10 GPS-L250</td><td>Rainin</td><td>17005093</td><td></td></tr><tr><td>VWR 해부 겸자 미세 팁, 4.5"</td><td>VWR International</td><td>82027-386</td><td></td></tr></tbody></table>

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

토마토는 그람 음성 박테리아인 슈도모나스 주사기에감염되어 세균성 반점 질환을 초래할 수 있는 농업학적으로 중요한 작물입니다. 토마토-P. 주사기 pv. 토마토 병리 시스템은 널리 식물 타고난 반응과 질병 저항의 유전 기초를 해부하는 데 사용됩니다. 질병은 성공적으로 재배 토마토에 Solanum pimpinellium에서 Pto/Prf 유전자 클러스터의 도입을 통해 수십 년 동안 관리되었지만, P. 주사기의 경주 1 균주는 Pto/Prf 유전자 클러스터에 의해 수여된 저항을 극복하기 위하여 발전하고 전 세계적으로 발생합니다.
야생 토마토 종은 병원체 인식에서 자연 다양성의 중요한 저수지입니다, 그들은 다른 병원균 압력을 가진 다양한 환경에서 진화하기 때문에. 야생 토마토의 질병 저항에 대한 일반적인 화면에서 성인 식물이 사용되며, 이는 성장 시간이 길어지고 성장 공간 요구 사항이 커지므로 선별 할 수있는 식물의 수를 제한 할 수 있습니다. 우리는 식물의 성장 시간과 성장 챔버 공간을 최소화하고 식물의 빠른 회전율을 허용하며 큰 샘플 크기를 테스트 할 수있는 저항을위해 10 일 된 토마토 묘목을 선별하는 방법을 개발했습니다. 생존 또는 죽음의 묘목 결과는 홍수 후 살아남은 묘목의 새로운 성장양에 의해 정의된 이산 표현형 또는 저항 척도로 취급될 수 있습니다. 이 방법은 두 개의 P. 주사기 균주에 대한 저항성을 위해 10 일 된 토마토 묘목을 스크리크로 최적화되었으며 다른 P. 주사기 균주에 쉽게 적응 할 수 있습니다.

묘목 저항 성 분석기를 사용하여 품종 및 등화 선에서 PtoR-매개 면역 검출 그림 5는 PstDC3000으로 홍수 후 머니메이커-PtoR 및 머니메이커-PtoS 품종 7-10일 의 대표적인 결과를 보여줍니다. 감염 되기 전에, 10 일 된 묘목 표시 완전히 등장 하 고 확장 된 자엽 과 신흥 첫 번째 진정한 잎. 모종은 0.005 + 0.015% 계면활성제의 광학 밀도에서 음의 대조군(데이터 미도시) 및 PstDC3000으로서 10 mM MgCl2 + 0.015% 계면활성제로 침수되었다. 모종은 홍수 후 7-10일 후에 표현형을하였다(도 5). Genono에서 개별 모종일반적으로 균일 한 라인, 머니 메이커-PtoR 및 머니 메이커-PtoS 는 모종 홍수 ...

모종 홍수 분석은 슈도모나스 주사기 박테리아에 대한 저항성을 위한 야생 토마토 접근물의 신속한 스크리닝을 용이하게 한다. 이 분석법은, 모종 세균 성장 분석과 함께, 박테리아에 대한 근본적인 저항성을 더욱 특성화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 저항의 유전적 기초를 결정하기 위해 매핑 인구를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

이 높은 처리량 프로토콜은 야생 접근에서 세균성 병원체 슈도모나스 시링가에 토마토 묘목을 신속하게 선별할 수 있게 합니다. 모종 홍수 분석법은 식물 의 성장 시간과 성장 챔버 요구를 최소화하고 식물의 빠른 회전율을 허용하며 큰 샘플 크기를 테스트 할 수 있습니다. 이 분석은 야생 접근 및 복잡한 유전 적 배경을 가진 다른 라인에서 저항을 선별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다.이 프로토콜은 두 개의 슈도모나스 주사기 균주의 홍수 접종에 대한 구체적인 방향을 제공합니다. 그러나, 그것은 다재다능하고 다른 세균성 병원체에 호스트 저항을 검출하기 위하여 수정될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 인 야나 하산 (Yana Hasan)이 될 것입니다.토마토 묘목을 성장시켜 시작하십시오. 토마토 씨앗을 2.2 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 50 % 표백제 용액의 2 밀리리터를 추가하십시오. 튜브를 25분 간 흔들어 서 파이펫으로 표백제 용액을 제거합니다.초순수 2밀리리터를 넣고 튜브를 5번 반전시켜 씨앗을 씻습니다. 튜브에서 액체를 흡입하고 4 번 더 씻어 내십시오. 마지막 세척 후, 초순수 한양의 밀리리터 2개를 넣고 씨앗을 멸균 페트리 접시에 붓습니다.에탄올에서 그들을 불타는 하여 집게를 살균한 다음 0.5 XMS 플러스 0.8 %의 천가 매체와 100 x 25 밀리리터 플레이트에 5 ~7 개의 씨앗을 전송하는 데 사용합니다. 수술 용 테이프로 접시의 가장자리를 밀봉하십시오. 플레이트가 평평하게 쌓여 있고 얼굴을 위로 향하게 합니다.발아를 동기화하기 위해 적어도 3 일 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 멸균 된 씨앗을 계층화하십시오. 3 일 후, 수직으로 뿌리가 접시의 표면을 따라 아래로 성장하고 씨앗의 라인이 수평으로 지향되도록 기울어진다. 씨앗을 섭씨 22도로 설정하고 16시간 의 빛, 8시간 암울한 주기로 옮기세요.챔버에서 10 일 동안 묘목을 성장, 어느 시점에서 그들은 일반적으로 완전히 등장 하고 확장 된 cotyledons 및 신흥 첫 번째 진정한 잎을 표시합니다. 평평한 멸균 이쑤시개를 사용하여 적절한 KB 한고에 신선한 박테리아를 줄입니다. PstT1의 경우, 홍수 실험에서 박테리아를 사용하기 전에 48시간 동안 섭씨 28도에서 플레이트를 배양한다.접종을 준비하기 위해, 무균으로 박테리아를 무균으로, 10 밀리머 마그네슘염화는 0.1의 광학 밀도로 재보종한다. 그런 다음 0075의 OD600을 사용하여 작업 농도를 얻기 위해 두 개의 직렬 희석을 합니다. 또한 10 밀리알 마그네슘 염화 마그네슘에 비이온 유기 실리콘 계면활성제 중합체의 1~10희석을 준비한다.그것을 소용돌이와 혼합 튜브를 소용돌이, 박테리아에 추가. 성장 챔버에서 생물 안전 캐비닛에 10 일 된 묘목으로 접시를 전송하고 수술 테이프를 제거합니다. 그런 다음 각 플레이트에 6 밀리리터의 접종을 옮김합니다.피펫 끝으로 모종을 무접종으로 부드럽게 밀어 넣고 3분간 타이머를 시작합니다. 각 손에 한 접시를 잡고 접시 의 전면을 기울여 모종의 코틸레톤과 잎을 잠급합니다. 접종을 5~7번 나란히 휘저은 다음 플레이트를 다시 팁하여 뿌리를 부추기는 무분비로 덮습니다.접시를 다시 기울여 총 3분 동안 주기를 반복합니다. 플레이트에서 접종을 붓고 평평한 표면에 내려 놓고 잔류 접종을 두 번째로 부어 냅니다. 판을 다시 감싸고 성장 챔버에 다시 놓습니다.머니메이커-프토르와 머니메이커-PtoS 품종은 PSTDC3000으로 넘쳐났고 홍수 후 7~10일 후에 표현되었습니다. 머니메이커-PtoR 모종은 PtoPRF 유전자 클러스터를 운반하고 PSTDC3000에 저항했다. PSTDC3000 이펙터 AVRPto 또는 AVRPto-B를 인식할 수 없는 거의 동종 머니메이커-PtoS 묘목이 홍수 후 7일 이내에 빠르게 사망했다.10일 된 묘목은 PstT1로 넘쳐났고 홍수 후 적어도 10일 후에 표현되었다. 취약한 접근은 죽었고, 갈색 의기질의 메리줄기를 가지고 있으며, 새로운 성장이 부족했습니다. 대조적으로, 저항하는 모종은 새로운 녹색 성장의 높은 수준을 표시하고 PstT1로 감염을 살아남았다.세균성장 분석법은 PstT1 저항성 및 솔라눔 네오리치 LA1329를 정량적으로 확인하기 위해 수행되었다. 저항성과 취약한 LA1329 사이의 세균 성장에 1.7 로그 차이가 있었고, 내성 LA1329와 머니메이커-PtoS 사이의 1.6 로그 차이가 있었는데, 이는 현상결과와 상관관계가 있었다. 이 분석법을 수행 할 때, 기억해야 할 가장 중요한 것은 프로토콜 전반에 걸쳐 무균 기술에주의를 기울이고 접시의 모든 묘목이 철저히 침수되도록하는 것입니다.감염된 식물 조직과 박테리아를 자동화하고 적절한 규정에 따라 물질을 폐기하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Nicotiana benthamiana 공장에서 PTI에 대한 세포 죽음 기반 분석을 설명합니다.

병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

출처: Hassan, JA, et al. Pseudomonas syringae pv에 대한 내성의 고처리량 식별.  묘목 홍수 분석을 사용한 토마토의 토마토. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 박테리아 현탁액을 접종한 10일 된 묘목을 사용하여 다양한 토마토 균주에서 박테리아 내성을 스크리닝하는 방법을 보여줍니다. 박테리아가 기공을 통해 침입하고, 식물 면역을 억제하기 위해 이펙터 단백질을 전달하는 방법, 감수성 균주와 내성 균주 간에 식물 반응이 어떻게 다른지 설명합니다. 결과는 눈에 보이는 성장 차이를 관찰하여 평가되며, 저항성 식물은 건강하게 유지되고 취약한 식물은 조직 손상을 보입니다.

토마토의 박테리아 내성 스크리닝을 위한 묘목 홍수 분석

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

여기에서, 우리는 세균성 wilt 질병의 연구 연구를 위한 간단한 유전 분석을 능력을 발휘하기 위하여 랄스토니아 solanacearum를 가진 접종에 선행된 토마토 뿌리 변환을 위한 다재다능한 방법을 제시합니다.

세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

본 프로토콜은 식물 아포플라스트 내에서 성장한 슈도모나스 시린지와 집단에 대한 단일 세포 유전자 발현 분석을 허용하는 방법을 설명합니다.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

배우세요 토마토 묘목 홍수 분석법으로 슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항성을 고처리량으로 선별하는 방법입니다. 이 기술은 야생 토마토 계통의 유전적 저항성을 신속하게 식별하여 식물 병리학 연구의 효율성을 높입니다.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

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