Name: 냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 냉동 조직 섹션에서 다중 바이오마커 공동정위화를 위한 신속 염색법. 이 방법은 염색 시간을 단축하고 다양한 실험실에서 수행 가능하며 면역학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

화상 진찰 및 분석 지도는 연구 자원 센터에 의해 제공되었습니다 – 연구 조직학 및 시카고에 있는 일리노이 대학에 있는 조직 화상 진찰 코어는 연구를 위한 부총장의 사무실에서 지원으로 설치했습니다. 이 작품은 NIH/NCI RO1CA11317에 의해 CLP에, NIH/NIAMS (SBDRC 교부금 1P30AR075049-01)에 의해 A. Paller 박사에게, 그리고 노스웨스턴 대학의 면역 요법 평가 코어에 로버트 H. 루리 종합 암 센터의 지원에 의해 지원되었습니다.

마우스 비장 및 HLF16 마우스 종양조직(23)은 당사의 실험실로부터 수득되었다. 인간 편도선 조직은 상용 공급 업체로부터 구입되었습니다. 자세한 내용은 재료 표에제공됩니다.
1. 조직 포함
<ol><li>OCT (최적의 절삭 온도) 용액에 신선한 조직을 포함하고 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 동결을 스냅.</li>
	<li>조직을 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>2. 냉동 부속
<ol><li>-25 °C로 설정된 온도로 저온 극저온에서 8 μm 섹션을 잘라냅니다. 참고: 선호하는 단면 두께를 조정하여 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다.</li>
	<li>충전된 유리 슬라이드에 섹션을 놓습니다.</li>
	<li>10 분 동안 반학 등급 얼음 차가운 아세톤에 고정하기 전에 실온 (RT)에서 1 시간 동안 섹션을 공기 건조. 참고: 아세톤은 수용성 단백질의 응고를 일으키고 지질을 추출하지만 탄수화물 함유 성분에는 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, 포르말린은 대부분의 지질을 보존하고탄수화물24에거의 영향을 미치지 않습니다. 고정물의 선택은 검출되는 마커의 선택에 따라 중요합니다.</li>
	<li>슬라이드를 -20°C에 보관합니다.</li>
</ol>3. 항체 및 형광단의 선택
참고: 조직 염색 전에, 아세톤 고정 조직에서 순차적 섹션 내에서 관심있는 항원을 견고하고 구체적으로 염색하는 항체 클론은 검증되어야합니다. 몇몇 항체는 상이한 고정제를 요구할 수 있고, 패널에 있는 그밖 항체와의 그들의 호환성은 또한 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 목표는 또한 DAPI, FITC, Cy3, 텍사스 레드 및 Cy5에 대한 epifluorescence 필터로 검출될 수 있는 최소한의 중첩으로 형광단을 식별하는 것입니다.
<ol><li>공지된 발현 표적 항원을 가진 조직 단면도에서 종래의 IHC 또는 면역형광(IF) 검출에 의한 염색을 확인한다.</li>
	<li>반자동 이미징 시스템에서 이용 가능한 여기 및 방출 필터 세트를 사용하고 불소-이형 1차 항체의 다양한 조합을 테스트한 후, 최소한의 스펙트럼 중첩을 가지는 플루오로포를 준비한다(예를 들어, 표 1참조).</li>
</ol>4. 염색
참고: 조직 재수화 및 슬라이드 세차를 코플린 항아리에서 수행하였습니다. 차단 및 항체 배양 단계는 가습 슬라이드 박스에서 수행되었다.
<ol><li>슬라이드를 RT로 5-10분 동안 데워두십시오.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(PBS)에서 5분 동안 수화합니다.</li>
	<li>항체로 조직을 염색하기 전에 차단 단계를 수행하십시오. 마우스 섹션의경우 RT에서 10분 동안 특수 차단 솔루션(재료 표 참조)을 사용합니다. 인간 섹션의 경우, RT에서 15분 동안 PBS에서 희석한 10% 정상 풀린 인간 혈청(NHS)을 사용하십시오. 참고: 사용할 후속 절차에 따라 섹션의 특정 속성을 보존하기 위해 필요에 따라 다른 차단 버퍼를 테스트할 수 있습니다.</li>
	<li>차단 후 PBS에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	<li>멀티플렉스 염색의 경우, 미리 결정된 최적의 희석에서 호환형 형광소와 항체의 칵테일을 준비하십시오.</li>
	<li>슬라이드에 불소 응고 항체의 칵테일을 추가합니다. 단일 마커 염색의 경우, 슬라이드에 1차 공액 항체만 추가합니다.</li>
	<li>임의의 원발성 컨쥬게이트 항체를 첨가하지 않고 동일한 염색 절차를 거치는 제어 무스테인드 슬라이드를 포함한다.</li>
	<li>어두운 RT에서 1 시간 동안 슬라이드를 인큐베이션 한 다음 슬라이드를 PBS로 2 x 로 각각 5 분 동안 씻습니다. 여기에서, 결과 슬라이드는 멀티플렉스 스테인드라고합니다.</li>
	<li>역점으로, 멀티플렉스 스테인드 슬라이드에 DAPI를 추가하고 RT에서 어둠 속에서 7 분 동안 배양하고 슬라이드를 5 분 동안 PBS로 2 x 씻어. 염색이 적고 얼룩지지 않은 슬라이드에 대항하지 마십시오.</li>
	<li>덮개를 덮려면 마운팅 매체를 한 방울 떨어뜨리고 유리 커버슬립을 티슈 위에 부드럽게 놓습니다.</li>
</ol>5. 스펙트럼 라이브러리 준비
<ol><li>
이미지 수집
	<ol>
<li>램프 전원을 100%로 설정합니다. 일반적으로 FFPE 조직에 대한 형광 검출은 신호 증폭 단계를 포함하기 때문에 전력은 10%로 설정됩니다.</li>
		<li>현미경 작동 소프트웨어를 열어 시작합니다(재료 표참조).</li>
		<li>프로토콜 편집을 선택한 다음 새 프로토콜을선택합니다.</li>
		<li>"프로토콜 이름"을 제공하고 이미징 모드에서 형광을 선택하고 "연구 이름"을 제공합니다.</li>
		<li>단일 스테인드 슬라이드를 스테이지에 놓고 해당 형광 채널의 각 마커를 검사하여 얼룩이 있는지 확인합니다. 마커에 대한 가장 강한 신호를 발현하는 조직 상에서 영역을 선택합니다.</li>
		<li>자동 초점 및 자동 노출 옵션을 사용하여 노출 시간을 조정합니다.</li>
		<li>스테인드 및 스테인되지 않은 단일 슬라이드에 대한 스냅샷을 수집하여 프로토콜을 저장합니다. 참고: 다음 단계는 기계 학습 소프트웨어(재료 표참조)에서 수행되며, 단일 스테인드 및 스테인드되지 않은 슬라이드를 사용하여 특정 염색을 확인하고 항체 교차 토크를 결정합니다.</li>
		<li>소프트웨어의 라이브러리 빌드 탭에서 스테인드된 각 슬라이드 이미지를 로드하고 적절한 플루어를 선택한 다음 추출을클릭합니다. 소프트웨어는 형광에서 선택한 형광 신호를 자동으로 추출합니다.</li>
		<li>추출된 색상을 저장하려면 저장하기 저장을 클릭합니다. "새 그룹"을 만들거나 추출된 색상을 기존 그룹에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스펙트럼 라이브러리 확인
	<ol>
<li>각 필터 세트에 대해 추출된 이미지의 오른쪽에 있는 방출 스펙트럼 곡선 창을 확인합니다. 참고: 추출된 신호는 불소가 검출되는 필터 세트에서만 스펙트럼 곡선이 관찰되는 경우 정확합니다. 잘못된 필터 세트에서 스펙트럼 곡선이 관찰되면 필터 세트에서 예상되는 기본 신호가 충분히 강하지 않거나 소프트웨어가 스펙트럼 중복으로 인해 너무 높은 다른 신호를 감지하고 있음을 의미할 수 있습니다. 이 경우 먼저 처리 영역 그리기 도구를 사용하여 이미지에서 형광 마커 및 자동 형광을 표현하는 영역 주변 영역을 그립니다. 이것은 실제 신호를 감지하고 간섭 신호를 제거하는 소프트웨어를 훈련시요. 이것이 작동하지 않는 경우에, 다른 항체 적정을 시험하기 위하여 단 하나 염색한 미끄럼을 위한 염색 과정을 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 다중 스펙트럼 이미징
참고: 스펙트럼 라이브러리가 생성되고 확인되면 다중 스테인드 슬라이드에 대해 다음 단계를 수행합니다.
<ol><li>
전체 슬라이드 스캔
	<ol>
<li>섹션 5.1에서 언급한 대로 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 초점 및 노출 시간을조정합니다.
</li>
		<li>슬라이드 스캔에서 새 작업을 만들고 위에 저장된 프로토콜을 선택합니다.</li>
		<li>멀티플렉스 스테인드 슬라이드에서 전체 슬라이드 스캔을 수행합니다.</li>
		<li>전체 슬라이드 스캔 소프트웨어를 사용하여 전체 슬라이드 스캔 이미지를 엽니다. 이 이미지는 스펙트럼적으로 혼합되지 않았습니다.</li>
		<li>스탬프 또는 ROI 도구를 사용하여 전체 슬라이드 스캔 이미지에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다. ROI 이러한 ROI는 6.1.1에 설정된 노출 시간을 사용하여 스캔하여 스펙트럼 언혼합 및 분석에 사용됩니다.</li>
		<li>프로세스 슬라이드를 클릭하여 20배 배율로 ROI를 획득합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스펙트럼 혼합 해제
	<ol>
<li>ROI가 획득되면 기계 학습 소프트웨어에서 수동 분석 탭에서 파일아래에서 열기를 클릭하여 멀티플렉스 스테인드 이미지를 로드합니다.</li>
		<li>스펙트럼 라이브러리 소스 드롭다운 메뉴에서 플루오르 선택을 클릭합니다.</li>
		<li>새 창이 열립니다. 여기서 위에 작성된 스펙트럼 라이브러리 또는 그룹을 선택합니다.</li>
		<li>스테인드되지 않은 슬라이드 이미지를 로드합니다. 선택한 스펙트럼 라이브러리 위에 있는 AF 잉크 마커 아이콘을 클릭하고 스테인되지 않은 슬라이드에 선 또는 영역을 그려 조직에서 자가형광을 식별합니다.</li>
		<li>마커 및 색상 편집 탭에서 각 마커에 이름을 지정합니다. 이 단계에서 의사 색상을 지정할 수 있습니다. 참고: 자동 형광 이미지의 색상은 기본적으로 DarkSlateGray로 설정됩니다. 검은색으로 변경합니다.</li>
		<li>모두 준비를 클릭합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스펙트럼적으로 혼합되지 않은 이미지 확인 참고: 스펙트럼 언혼합 단계가 완료되면 모든 색상으로 구성된 합성 이미지가 만들어집니다.<ol>
<li>눈 보기 편집 아이콘을 클릭합니다. 여기서, "구성 요소 디스플레이"의 각 색상을 끄거나 켜서 각 개별 마커의 얼룩을 볼 수 있습니다.</li>
		<li>생물학적으로 관련이 없는 한 세포의 염색과 형태를 시각적으로 검사하여 마커가 겹치지 않도록 합니다. 병리학자는 염색을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 참고: 다중슬라이드의 염색은 한 번에 하나의 형광포를 남기고 염색 패턴을 검토하여 검증되어야 합니다. 또한, 검증은 또한 항체 크로스 토크 또는 블리드스루로 인접 스펙트럼에 나타나는 강한 형광을 식별하는 데 도움이 될 것이다.</li>
		<li>각 형광 마커에 대해 밝은 필드 이미지를 시뮬레이션하는 병리학 보기의경우 구성 요소 이미지 선택 단추를 클릭합니다. 여기서 시뮬레이션된 브라이트필드 이미지를 보려면 마커를 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 세포 세분화 및 표현형 분석을 통한 다중 스펙트럼 이미지 분석
참고: 스펙트럼적으로 혼합되지 않은 이미지를 확인한 후 기계 학습 소프트웨어를 사용하여 셀 세분화를 수행할 수 있으며, 이 소프트웨어는 단계별 지침을 제공합니다. 조직 세분화는 여기서 수행되지 않았다. 패널이 하나 이상의 조직 특이적 마커를 포함하는 경우, 특히 조직이 지저분한 경우, 조직 세분화를 수행해야한다.
<ol><li>'세그먼트' 옵션에서"세포질"및"멤브레인"을 선택합니다. 참고: "핵"은기본적으로 선택됩니다.</li>
	<li>패널에서 마커를 선택합니다. 핵, 세포질 또는 막을 검출하도록 마커를 구성합니다. 예를 들어, DAPI는 멤브레인에 대한 핵 및 CD3를 검출하도록 선택될 수 있다.</li>
	<li>타원 버튼 ('...')을 클릭하여 "이 신호를 사용하여 "에서 옵션을선택하십시오. 예를 들어, DAPI에 대한 '핵'. 분할을 위해 패널의 여러 마커를 선택할 수 있습니다. 참고: 세포질 또는 멤브레인 마커의 경우"이 신호를 사용하여 핵 세분화를 지원하십시오"옵션을 선택합니다.</li>
	<li>이 소프트웨어는 이미지의 핵, 세포질 및 멤브레인에 대해 각각 마스크를 자동으로 감지하고 만듭니다.</li>
	<li>모든 셀이 분할을 위해 '마스에'있는지 확인합니다. 조정하려면 7.3에서선택한 특정 마커에 대한 병리학 보기로 전환합니다. 소프트웨어의 구성 옵션을 사용합니다.</li>
	<li>셀을분할하려면 "모든" 세그먼트를 클릭합니다.</li>
	<li>세포 분절 후 표현형 세포를 진행합니다. 이 단계에서 는 자형질 에 필요한 마커를 선택하고 선택한 마커로 밝게 염색된 5개 이상의 셀을 수동으로 선택합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 이미지에서 선택한 마커로 얼룩진 모든 셀을 자동으로 감지하도록 훈련합니다.</li>
	<li>표현형 맵이 작성됩니다. 마커로 염색된 세포가 올바르게 표현되었는지 분석합니다. 참고: 세포 자형질은 반복적인 과정이 될 수 있습니다. 소프트웨어가 세포를 올바르게 표현할 수 없는 경우 교육이 부적절하거나 올바르지 않다는 의미입니다. 이 경우 사용자는 수동으로 더 많은 셀을 선택하고 소프트웨어를 다시 학습하고 사용자가 교육에 만족할 때까지 이 단계를 반복해야 합니다.</li>
	<li>"기타"라는 그룹을 만들고 마커에 대해 더러워지지 않은 셀을 포함합니다. 참고: 이 단계는 모든 얼룩지지 않은 세포를 자형질에서 제외하도록 소프트웨어를 훈련하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>8. 이미지 및 분석 테이블 내보내기
<ol><li>내보내기 단추를 클릭하여 설정 내보내기 패널을 봅니다.</li>
	<li>"내보내기 디렉토리"에서 찾아보기를 클릭하여 이미지를 내보낼 위치를 선택합니다.</li>
	<li>"이미지 내보내기 옵션"에서 이미지 출력 형식을 선택합니다.</li>
	<li>"내보낼 이미지" 목록에서 내보낼 이미지를 선택합니다. "합성 이미지"는 최종 의사 색 혼합되지 않은 이미지입니다. "병리학 보기"는 개별 시뮬레이션 된 브라이트 필드 이미지이며 "구성 요소 이미지 (다중 이미지 TIFF)"는 타사 분석 소프트웨어에서 사용할 수있는 구성 요소 데이터의 다중 이미지 TIFF 파일입니다.</li>
	<li>"모두내보내기"버튼을 클릭하여 이미지를 내보냅니다. 참고: 이 단계에서 분석테이블을 선택하고 내보낼 수도 있습니다.</li>
</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

냉동 조직은 MIF 이미징을 위해 광범위하게 사용되어 왔으며 전통적으로 직접 및 간접 방법32를사용하여 조직에 3~4개의마커(31)를 검출하였다. 직접적인 방법에서, 항체는 조직을 표지하기 위하여 형광 염료 또는양자점(33)에 공액되고, 반면 간접적인 방법에서는, 비공액 1차 항체는 1차 항체를 특이적으로 인식하는 형광공 결합이차 항체에 선행하여 조직을 표지하는데 사용된다. 앞서 논의된 최근의 동시 멀티플렉스 염색 접근법 중 일부는 냉동 조직을 염색하고 4개 이상의 마커를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 그러나 시약에 대한 비용과 염색에 소요되는 시간은 검출되는 마커의 수에 따라 집중적이 된다. 동결 된 조직에 대한 또 다른 멀티 플렉스 기술은 다중 에피토프 - 리간드 - 지도 제작 (MELC)34입니다. 기술은 불소 공액 항체, 화상 진찰 및 불소의 광표백...

현미경 화상 진찰 기술에 있는 최근 어드밴스는 생물학 프로세스 및 질병 상태의 우리의 지식 그리고 이해를 현저하게 향상했습니다. 염색체 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 조직에 있는 단백질의 situ 탐지에서는 병리학에서 일상적으로 수행됩니다. 그러나, 발색성 IHC 염색을 이용한 다중 마커의 검출은 다중 면역형광(mIF) 염색 접근법을 사용하는1가지 및 새로운 방법이며, 여기서 다중 생물학적 마커는 단일 조직 샘플에 표지되고, 개발되고 있다. 다중 생물학적 마커의 검출은 조직 구조, 세포의 공간 분포 및 항원 공생과 관련된 정보가 모두 단일 조직 샘플2에서포착되기 때문에 유용하다. 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰 기술의 사용은 다중 생물학 마커의 검출가능하게 했습니다. 이 기술에서는, 특정 광학을 사용하여 각 개별 형광공의 형광 스펙트럼을 분리하거나 "혼합되지 않은", 어떤 스펙트럼 크로스토크 없이 다중 마커의 검출을 가능하게한다 3. 다스펙트럼 형광 이미징은 세포 생물학, 전임상 약물 개발, 임상 병리학 및 종양 면역 프로파일링4,,5,,6에서중요한 접근법이 되고 있다. 중요하게도, 면역 세포(특히 CD8 T 세포)의 공간 분포는 기존 종양을 가진 환자에 대한 예후 인자로서 작용할 수 있다7.
멀티플렉스 형광 염색에 대한 다양한 접근법이 개발되어 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있습니다. 동시 염색 방법에서, 모든 항체는 조직을 라벨링하는 단일 단계에서 칵테일로서 함께 첨가된다. UltraPlex 기술은 융동포극성 1차 항체의 칵테일을 사용하고, 그 다음에 는 형광공화 항체-합텐 이차 항체의 칵테일을 사용합니다. InSituPlex 기술8은 조직에 동시에 첨가되는 독특한 DNA 공액 1차 항체의 칵테일을 사용하여 증폭 단계와 최종적으로 1차 항체상에서 각각의 독특한 DNA 서열에 상보적인 플루오로포폴화 결합 프로브를 사용한다. 이 두 가지 기술은 핵 염색을 위한 4개의 마커와 4', 6-다이아미노-2-페닐린들레(DAPI)를 검출할 수 있게 합니다. 동시 멀티플렉스 염색을 위한 두 가지 다른 접근법은 이차 이온 질량분석9를기반으로 한다. 하이페리온 이미징 시스템은 이미징 질량 세포 분석10을 사용하여 최대 37개의 마커를 감지합니다. 이 기술은 금속 공액 항체의 칵테일을 사용하여 조직을 염색하고 조직의 특정 영역은 레이저에 의해 압산되어 금속 이온이 검출되는 질량 세포계로 옮겨지습니다. 또 다른 유사한 기술은 다중 이온 빔 이미징 기술11을사용하는 IONPath입니다. 이 기술은 금속 공액 항체를 제거하기 위해 레이저 대신 수정된 질량 분석 기기와 산소 이온 소스를 사용합니다. 이러한 모든 동시 멀티플렉스 염색 접근법은 여러 마커의 검출을 가능하게 하는 반면, 항체에 DNA, 합텐 또는 금속을 결합시키는 데 수반되는 비용, 절제로 인한 조직의 손실 및 혼합을 위한 광범위한 이미지 처리를 과소평가할 수 없습니다. 또한 키트 및 염색 프로토콜은 현재 FFPE 조직에서만 사용할 수 있으며 사용자 지정 패널을 개발하는 것은 추가 시간과 지출을 수반합니다.
이와 는 대조적으로 순차적 멀티플렉스 염색 방법은 하나의 마커에 항체로 조직을 라벨링하고, 항체를 제거하기 위해 스트립을 하고, 이 과정의 순차적 반복을 통해 다중마커(12)를표지하는 것을 포함한다. 티라미드 신호 증폭(TSA)은 가장 자주 사용되는 순차 적중 법입니다. 다른 두 개의 멀티플렉싱 기술은 동시 및 순차적 염색 방법의 조합을 사용합니다. CODEX 플랫폼13은 색인 된 중합 단계를 사용하여 결국 불소로 표지되는 독특한 DNA 올리고뉴클레오티드 서열에 결합된 항체의 칵테일을 채택하고 이미징, 스트립 및 반복하여 최대 50개의 마커를 검출하는 과정을 반복한다. MultiOmyx 멀티플렉스 염색 접근법14는 3~4개의 형광공형 항체의 칵테일로 염색을 반복하고, 형광을 담금질하고, 이 주기를 반복하여 단일 섹션에서 최대 60개의 마커를 검출한다. 동시 멀티플렉스 염색 방법과 유사하게 광범위한 마커를 검출할 수 있지만 염색, 이미지 수집, 처리 및 분석에 수반되는 시간은 광범위합니다. 스트리핑/담금질 단계는 가열 및/또는 조직 견본을 표백하는 관련시키고, 이렇게, 순차적인 다중 배차 염색 접근은 가열 또는 표백시 조직 무결성을 유지하는 FFPE 조직에 일반적으로 수행됩니다.
포르말린 고정 및 후속 파라핀 삽입은 임상 환경에서 용이하게 수행되고, 조직 블록은 저장이 용이하며, 여러 멀티플렉스 염색 프로토콜을 사용할 수 있다. 그러나, FFPE 조직의 처리, 포함 및 탈파화뿐만 아니라 항원회수(15)는항체가 에피토프에 더 잘 접근할 수 있는 과정은 시간이 많이 걸린다. 더욱이, FFPE 조직에 관여하는 처리는자가형광(16) 및 마스크 표적 에피토프에 기여하며, 그 결과 FFPE 조직17,,18,,19에서항원을 검출할 수 있는 항체 클론의 가변성 및 결여를 초래한다. 일례로 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I Alleles20이다. 대조적으로, 조직의 스냅 동결은 항원회수(21,,22)의필요성을 우회하고, 광범위한 표적을 검출하는 데 유익하게 하기 전 또는 후에 광범위한 처리 단계를 수반하지 않는다. 따라서 다스펙트럼 형광 이미징에 냉동 조직을 사용하여 전임상 및 임상 연구를 위한 표적을 검출하는 것이 유용할 수 있습니다.
FFPE 조직을 사용할 때 위에서 언급 한 한계를 감안할 때, 우리는 다중 스펙트럼 형광 이미징이 냉동 조직에서 수행 될 수 있는지 여부를 물었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 여러 항원을 검출하기 위해 형광 공조 항체의 패널을 사용하여 동시 멀티 플렉스 염색 방법을 테스트하고 반자동 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 염색을 분석했다. 우리는 90 분 안에 단 하나 조직 단면도에 있는 6개의 마커까지 동시에 얼룩을 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>아세톤(조직학적 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16F-1GAL</td><td>고정 조직</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3</td><td>BioLegend</td><td>100212</td><td>Clone - 17A2; 1차 공액 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53-0202-82</td><td>Clone - L26; 1차 복합 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>558617</td><td>1차 접합 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-human CD3</td><td>BioLegend</td><td>300446</td><td>Clone - UCHT1; 1차 복합 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100758</td><td>Clone - 53-6.7; 1차 복합 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD8a</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>Clone - C8/144B; 1차 복합 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)</td><td>BioLegend</td><td>141711</td><td>Clone - C068C2; primary conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100426</td><td>Clone - GK1.5; primary conjugated antibody</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mouse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>27</td><td>Mouse frozen tties used for multispectral training</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6016-6EA</td><td>슬라이드 수화 및 세척</td></tr><tr><td>DAPI 솔루션</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>핵산 염색</td></tr><tr><td>다이아몬드 화이트 유리 하전 슬라이드</td><td>DOT Scientific</td><td>DW7590W</td><td>접착 조직 절편</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x (Ca 및 mg 제외)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td>세척 및 희석제</td></tr><tr><td>Gold Seal Cover Slips</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3306</td><td>염색된 조직 보호</td></tr><tr><td>인간 정상 편도선 OCT 동결 조직 블록</td><td>AMSBio</td><td>AMS6023</td><td>다중 스펙트럼 염색에 사용되는 인간 냉동 조직</td></tr><tr><td>인간 혈청 1x</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-512</td><td>인간 조직 차단 및 희석제</td></tr><tr><td>inForm</td><td>Akoya Biosciences</td><td>버전 2.4.1</td><td>기계 학습 소프트웨어</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td><td>BioLegend</td><td>300529</td><td>Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody</td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone - M1/70; primary conjugated antibody</td></tr><tr><td>Phenochart</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Version 1.0.8</td><td>Whole slide scan software</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36965</td><td>마운팅 매체</td></tr><tr><td>연구 : 저온 유지 장치</td>, <td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>절편 조직</td></tr><tr><td>Superblock 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37515</td><td>블로킹 마우스 조직</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T 솔루션</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>임베딩 티슈</td></tr><tr><td>Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS142568</td><td>반자동 멀티 스펙트럼 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Vectra 소프트웨어</td><td>Akoya Biosciences</td><td>버전 3.0.5</td><td>현미경 작동 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에 대한 다스펙트럼 형광 이미징을 통해 단일 조직 샘플에서 여러 마커를 검출할 수 있어 마커의 항원 공발 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나, 포르말린 고정 조직에 적합한 항체의 부족은 검출될 수 있는 마커의 성질을 제한할 수 있다. 또한, 염색 방법은 시간이 많이 걸립니다. 여기에서 우리는 동결된 조직에 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰을 능력을 발휘하는 급속한 방법을 기술합니다. 이 방법은 사용되는 형광공 조합, 마우스 및 인간 냉동 조직의 염색을 위한 상세한 단계, 및 스캐닝, 획득 및 분석 절차를 포함한다. 염색 분석을 위해 시판되는 반자동 다스펙트럼 형광 이미징 시스템이 사용됩니다. 이 방법을 통해, 단일 냉동 조직 섹션에서 최대 6개의 상이한 마커를 염색하고 검출하였다. 기계 학습 분석 소프트웨어는 정량 분석에 사용될 수 있는 표현형 세포를 표현할 수 있다. 동결 된 조직에 대해 여기에 설명된 방법은 FFPE 조직에서 검출 할 수 없거나 항체가 FFPE 조직에 사용할 수없는 마커의 검출에 유용합니다.

냉동 비장 섹션에서 단일 염색 마커 검출 반자동 이미징 시스템은 더 넓은 범위의 파장검출(25)을가능하게 하는 액정 튜닝 필터(LCTF) 시스템을 사용하며, 여기서 신호 증폭 단계가 수행되지 않기 때문에 현미경의 각 마커에 대한 1차 공액 항체의 검출을 먼저 최적화했습니다. 그림 1에는각 단일 염색 마커가 의사 색상의 빨간색인 예가 나와 있습니다. 여기에서 사용된 알렉사 플루어 공액 항체는 면역형광 및 유세포 측정을 위한 회사에 의해 검증되었습니다. 그러나 Per-CP-Cy5.5 형광단은 유세포 측정에 대해서만 검증됩니다. 우리는 우리의 단 하나 염색한 미끄럼틀에서 이 색깔을 검출할 수 있었습니다, 다중 스펙트럼 화상 진찰에서 사용하기 위하여 유세포 측정 검증 항체의 적합성을 지원하고 2개의 다른 기술 (즉, 유동 세포분석 및 다중 스펙트럼 화상 진찰)를 사용하여 관측을 검증하기 위하여 그 같은 항...

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

이 방법은 파라핀 섹션에서 일반적으로 검출할 수 없는 마커를 포함하여 단일 극저온 섹션에서 여러 바이오마커를 검출하고 공동 국소화하는 데 도움이 됩니다. 이러한 실험염색 방법을 사용하여 염색 시간이 현저히 감소하고 모든 실험실에서 방법을 수행할 수 있다. 이 방법을 시연하는 것은 디네시 자이샨카르입니다.그는 실험실에서 숙련 된 postdoc, 또한 면역 요법 평가 코어, 시설 관리자. 분석을 위해 항체를 선택할 때 반자동 이미징 시스템에서 사용할 수 있는 여기 및 방출 필터 세트를 고려하십시오. 그리고 형광소의 다양한 조합을 테스트 한 후 1 차 항체를 공각 한 후, 당신이 테이블에 제안 된 바와 같이 최소한의 스펙트럼 중복을 갖도록 사용되는 형광을 준비.멀티플렉스 염색의 경우, 미리 정해진 최적의 망상에서 호환되는 형광과 함께 항체의 칵테일을 준비하고, 관심있는 조직 섹션에 칵테일을 추가하십시오. 단일 마커 염색의 경우, 슬라이드에만 1차 공조 항체를 추가합니다. 모든 염색에 대해, 1차 공각 항체를 첨가하지 않고 동일한 염색 절차를 겪는 제어 미염색 슬라이드를 포함한다.빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 잠복한 후 PBS로 슬라이드를 세척당 5분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 카운터는 빛으로부터 보호 실온에서 7 분 동안 DAPI와 멀티 플렉스 스테인드 슬라이드를 얼룩, PBS에서 두 5 분 세척. 스펙트럼 라이브러리를 만들려면 다중 스펙트럼 이미징 시스템의 램프 전력을 100%로 설정하고 현미경 작동 소프트웨어를 엽니다.프로토콜 편집 및 새 프로토콜을 선택합니다. 프로토콜 이름을 입력하고 이미징 모드에서 형광을 선택합니다. 그런 다음 스터디 이름을 제공하고 단일 스테인드 슬라이드를 스테이지에 로드합니다.노출 편집을 클릭하고 자동 초점 및 자동 노출 옵션을 사용하여 노출 시간을 조정하고 단일 스테인드 슬라이드에 대한 스냅숏을 얻습니다. 단일 스테인드 슬라이드를 이미징한 후 프로토콜을 저장합니다. 그리고 빌드 라이브러리의 탭 아래의 기계 학습 소프트웨어에서 각 스테인드 이미지를 로드합니다.적절한 바닥을 선택하고 추출을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 바닥에서 선택한 형광 신호를 추출합니다. 추출된 색상을 저장하려면 저장을 클릭하여 저장합니다.새 그룹을 만들거나 추출된 색상을 기존 그룹에 저장할 수 있습니다. 다중 스펙트럼 이미징의 경우 스펙트럼 라이브러리가 만들어지고 확인되면 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 초점 및 노출 시간을 설명한 대로 조정하고 스캔된 슬라이드를 열어 새로운 작업을 만듭니다. 슬라이드 ID를 제공하고 프로토콜을 선택합니다.작업에서 전체 슬라이드 스캔을 선택하여 멀티플렉스 스테인드 슬라이드에서 전체 슬라이드 스캔을 수행합니다. 전체 슬라이드 스캔 이미지에서 이미지 전체의 관심 영역을 선택합니다. 이러한 영역은 스펙트럼 언믹싱 및 분석에 사용되는 멀티플렉스 슬라이드에서 이전에 설정된 노출 시간을 사용하여 스캔됩니다.현미경 작동 소프트웨어에서 작업 중인 MSI 필드를 획득한 다음 프로세스 슬라이드를 클릭하여 20배 배율로 관심 영역을 획득합니다. 관심 영역을 획득하면 기계 학습 소프트웨어에서 수동 분석 탭에서 파일 및 열기를 클릭하여 멀티플렉스 스테인드 이미지를 로드합니다. 스펙트럼 라이브러리 소스를 선택하고 바닥 선택을 클릭하여 이전에 저장된 스펙트럼 라이브러리를 선택합니다.파일 및 열기를 클릭하여 얼룩이 없는 이미지를 로드합니다. 그런 다음 자동 불피성 잉크 마커 아이콘을 클릭하고 스테인드 슬라이드에 선 또는 영역을 그려 조직 내의 자동 형광을 식별합니다. 그런 다음 마커 및 색상 편집 탭에서 각 마커에 대한 이름을 할당하고 모두 준비를 클릭합니다.기계 학습 소프트웨어에서 스펙트럼 혼합 되지 않은 이미지를 확인한 후 패널에서 세포막 및 마커 옵션을 선택합니다. 그리고 타원 버튼을 사용하여, 이 신호를 사용하여 핵, 세포질 또는 막을 검출하기 위해 마커를 구성한다. 세포질 또는 멤브레인 마커를 선택하면 핵 분할 옵션을 지원하기 위해 신호 사용법을 선택합니다.이 소프트웨어는 핵, 세포질 및 멤브레인에 대한 개별 마스크를 자동으로 감지하고 생성합니다. 소프트웨어의 특정 마커 및 구성 옵션에 대한 병리학 보기를 사용하여 마스크를 조정하고 세그먼트 모두를 클릭하여 셀 세분화 맵을 만듭니다. 세포 세분화 후 마커를 선택하여 양수 세포를 표현합니다.또한, 선택된 마커로 염색되지 않은 적어도 5개의 세포를 선택하여 음세포를 표현한다. 그런 다음 Train Classifier를 클릭하여 소프트웨어를 학습하여 이미지 내에서 선택한 마커로 얼룩진 모든 셀을 자동으로 감지합니다. 표현형 맵이 만들어집니다.이러한 심상이 입증된 바와 같이, 혈류 세포측정을 위해 검증된 항체는 반자동 이미징 시스템에서 액정 튜닝 필터를 사용하여 조직 염색을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 여기서 는 여포 발아 센터 내의 B 세포 및 증식 세포의 라벨링, 및 간 여포 T 세포 영역의 확산을 포함하는 고정된 인간 편도선의 반사혼합 이미지를 관찰할 수 있다. 병리학 보기 옵션은 관심있는 조직 내의 각 마커에 대한 개별 염색 패턴을 시각화 할 수 있으며, 멀티 플렉스 염색 방법 및 스펙트럼 이미징이 냉동 조직에 작용함을 시사합니다.냉동 마우스 종양 섹션에서 입증된 바와 같이, 다중 스펙트럼 이미징은 또한 종양 침투 T 세포, 및 종양 관련 대식세포를 포함한 다른 골수성 세포 계보를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 세포 세분화 및 표현형 맵, 소프트웨어에 의해 분석된 각 마커에 대한 스테인드 셀의 수가 생성될 수 있으며, 이는 소프트웨어가 냉동 조직에 대한 다중 스펙트럼 염색의 정량화에 사용될 수 있음을 입증한다. 새로운 6to 기술의 경우, 플루오로크롬의 특정 특징을 파악하고 스펙트럼 을 최소화한 스펙트럼 중복으로 스펙트럼 을 풀기 위한 고품질 라이브러리 슬라이드를 준비하는 것이 중요합니다.항체 적정을 수행하는 것도 중요합니다. 우리의 의견으로는, 이 방법은 특히 타이밍이 본질일 때 암 및 그밖 치료 응용을 위한 면역 요법의 효험에 관하여 침대 측 정보를 제공할 수 있습니다.

a-rapid-method-for-multispectral-fluorescence-imaging-frozen-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

이 비디오는 근육 조직을 스냅 동결하고 얇은 부분을 얻는 절차를 설명합니다. 이 기술은 대장암 마우스 모델에서 암 관련 악액질을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절편을 위한 근육 조직의 스냅 동결: 급속 동결된 쥐 근육 조직의 초박형 절편을 얻기 위한 프로토콜

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

이 원고에서는 광물화된 조직의 동결된 절편에 대한 여러 차례의 형광 이미징에서 여러 차례의 반응 측정의 정렬된 복합 이미지를 생성하기 위해 고처리량 반자동 극저온 조직학 플랫폼을 제시합니다.

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.

자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

배우세요 냉동 조직 섹션에서 다중 바이오마커 공동정위화를 위한 신속 염색법. 이 방법은 염색 시간을 단축하고 다양한 실험실에서 수행 가능하며 면역학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

더 많은 동영상 탐색