Name: 유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 학습하세요 유세포 분석과 면역염색을 이용한 적혈구 CR1 수용체 밀도 측정 방법을 알츠하이머병과 전신성 홍반성 루푸스 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 URCACyt의 모든 구성원, 유동 세포 분석 기술 플랫폼, 면역학의 부서의 직원, 그리고 프로토콜을 최적화하고 검증하는 데 기여 한 내과 및 노인학과의 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 랭스 대학 병원에 의해 투자되었다 (보조금 번호 AOL11UF9156).

인간의 혈액 수집 및 취급을 위한 프로토콜은 지역 윤리 위원회 (CPP Est II)에 의해 검토되고 승인되었으며, 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다. 다음 의정서는 인간의 혈액 의학적 처리를 설명하기 때문에 생체 유해 물질 의 폐기에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비는 착용해야 합니다.
1. 적혈구 세척
참고: 취급 전날, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.15%를 함유한 인산염 완충식염수(PBS)를 함유한 PBS-BSA 완충액을 준비하고 4°C의 냉장고에 놓습니다. 이 버퍼는 세척 버퍼 및 희석 버퍼로 사용됩니다.
<ol><li>50 mL 튜브에 PBS-BSA의 파이펫 20 mL.</li>
	<li>흡인 250 μL 의 나트륨 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 항응고전 혈액을 혈액 저장 관으로부터 및 PBS-BSA의 20 mL를 포함하는 튜브에 첨가하였다. 캡을 나사로 조여 튜브를 닫습니다. 튜브를 2x 반전시켜 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 부드럽고 세심한 파이펫팅으로 상급물의 잔류 부피에 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오.</li>
	<li>펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 튜브를 원심분리기에 4°C로 두고 섹션 2로 이동합니다.</li>
</ol>2. 적혈구 희석
<ol><li>차가운 PBS-BSA의 피펫 3 mL을 50 mL 튜브에 넣고 얼음 선반에 4 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>적혈구를 함유한 원심분리튜브(1.4단계)를 얼음에 놓은 랙에 놓는다.</li>
	<li>피펫 8 μL의 펠릿적혈구를 사용하여 피펫을 사용하고 적혈구 희석을 얻기 위해 PBS-BSA의 3 mL을 포함하는 50 mL 튜브에 첨가한다. 적혈구의 균질 한 세포 현탁액을 얻기 위해 손으로 부드럽게 튜브를 혼합.</li>
</ol>3. 적혈구 면역 염색
<ol><li>적혈구 희석의 피펫 100 μL (섹션 4에서 수득) 및 1.4 mL 튜브에 추가.</li>
	<li>430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 0.05 μg/μL의 농도로 생체 질화된 항 CR1 J3D3 항체의 희석을 준비한다.</li>
	<li>원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.</li>
	<li>20 μL의 생체 측화 방지 CR1 J3D3을 펠릿에 직접 추가하십시오. 음수 제어를 준비하려면 대신 PBS-BSA 버퍼 20 μL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>45분 간 배양한 후, 튜브에 750 μL의 PBS-BSA를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.</li>
	<li>그 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 스트렙타비딘-피코에리트린의 1:10 희석을 준비한다. 피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석및 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>튜브에 PBS-BSA 버퍼 750 μL을 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 잘 섞고 원심 분리기를 섞는다. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.</li>
	<li>원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 생체질화된 항 스트렙타비딘 항체의 1:100 희석을 준비한다.</li>
	<li>원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.</li>
	<li>피펫 20 μL의 1:100 의 생물학적 인 항 스트렙타비딘의 희석튜브내로. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.</li>
	<li>45분 간 배양한 후, PBS-BSA 완충액의 피펫 750 μL을 튜브에 첨가한다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.</li>
	<li>피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석을 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.</li>
	<li>PBS-BSA 버퍼의 피펫 750 μL을 튜브에 추가합니다. 잘 혼합하고 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 2x 반복합니다.</li>
</ol>4. 면역 염색 적혈구 고정
<ol><li>마지막 원심분리 동안, 세척 완충제 PBS-BSA를 사용하여 37% 포름알데히드의 1:100 희석, 고정 완충제를 준비한다.</li>
	<li>피펫 450 μL의 고정 버퍼를 면역 염색 적혈구 튜브(단계 3.13으로부터)에 첨가하고 5s에 대한 와류를 한다.</li>
	<li>모든 고정 셀을 5 mL 둥근 바닥 튜브에 피펫을 넣고 냉장고에 보관하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 최대 48시간 동안 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 염색된 적혈구의 유세포 분석
참고: 세포측정기(재료 표참조)에 대한 작업자 설명서를 참조하여 세포측정 판독값을 수행하는 방법을 아는 것이 좋습니다. 아래 제안된 파라미터는 사용되는 계측기에 적용되며 각 세포계에 최적화되어야 합니다.
<ol><li>유세포계를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 30 분 동안 그대로 두면 광학 시스템 온도가 안정화됩니다. Cytometer Connected</li>
	<li>버퍼 컨테이너가 가득 찼고 폐기물 컨테이너가 비어 있는지 확인합니다. 퍼지 시스템을 사용하여 버퍼 필터와 버퍼 라인의 기포를 제거합니다. 세포계의 콘솔에 프라임 버튼을 눌러 유체 시스템을 프라임. 표시등이 빨간색에서 녹색으로 바뀌를 때까지 기다립니다.</li>
	<li>유체를 청소하려면 샘플 주입 포트에 3 mL의 세척 액이 들어있는 튜브를 설치하고 높은 샘플 유량으로 5 분 동안 세척 솔루션을 실행할 수 있습니다. 증류수로 헹구는 용액으로 이 것을 반복하십시오. 시료 주입 포트에 물이 들어있는 튜브를 그대로 둡니다.</li>
	<li>캘리브레이션 비드를 준비하기 위해, PBS의 피펫 400 μL을 둥근 바닥 튜브의 바닥에. 30s. PBS를 포함하는 둥근 바닥 튜브에 드롭을 추가하여 비드 주식을 강하게 섞습니다. 30초 동안 소용돌이를 만들어 조심스럽게 섞으세요.</li>
	<li>성능 검사를 실행합니다. 소프트웨어에서 세포계 설정 및 추적 모듈을 엽니다(그림1A). PE 면역 염색을 사용하여 실험에 세포계 구성이 올바른지 확인합니다. 비드 배치보정이 구성에 맞는지 확인합니다.</li>
	<li>샘플 주입 포트에 비드 튜브를 설치하고 낮은 샘플 유량으로 실행하십시오. 완료하는 데 약 5분이 걸리는 성능 검사를 실행합니다. 성능 검사가 완료되면 세포계 성능이 만족스러운지 확인합니다(그림1B). 소프트웨어의 세포계 설정 및 추적 모듈을 닫습니다.</li>
	<li>실험을 설정하고 응용 프로그램 설정을 만들려면 브라우저 도구 모음에서 새 실험 단추를 클릭하고 새 실험을 엽니다. 실험의 드롭다운 메뉴에서 방향 분산(FSC), 측면 분산(SSC) 및 PE(그림 1C)를선택하여 적절한 세포계 설정을 선택하여 매개변수를 지정합니다. Forward Scatter FSC 매개변수에 대한 선형 모드와 SSC 및 PE 매개변수에 대한 로가리섬 모드를 선택합니다.</li>
	<li>열린 실험에서 세포계 설정(그림 1D)을선택한 다음 응용 프로그램 설정을선택하고 전역 워크시트(그림1E)를만듭니다. 회색 상자와 십자선을 사용하여 최적화를 안내합니다.</li>
	<li>스테인드되지 않은 제어 튜브를 세포계에 로드하고 수집을실행합니다. FSC 및 SSC 전압을 최적화하여 관심 있는 인구(즉, RBC)가 확장되어 있는지 확인합니다. FSC 임계값을 최적화하여 관심 있는 인구를 방해하지 않고 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>FSC 대 SSC 플롯의 RBC 주위에 게이트를 그립니다. PE 형광의 점 도표에 RBC 인구를 표시합니다. 필요한 경우 광증배관(PMT) 전압의 형광을 증가하여 음수 모집단을 회색 상자 내에 배치합니다. 세포계에서 스테인되지 않은 제어 튜브를 언로드합니다.</li>
	<li>양수 인구가 규모에 있는지 확인합니다. 스테인드 컨트롤 튜브를 세포계에 적재하고 수집을 실행합니다. 양수 모집단이 완전히 규모로 보일 때까지 규모가 축소된 경우 양수 모집단에 대한 PMT 전압을 낮춥니다. 그런 다음 얼룩진 샘플을 언로드합니다.</li>
	<li>샘플을 기록하고 분석하려면 새 글로벌 워크시트에서 데이터를 미리 보기 위한 다음 플롯을 만듭니다: 1) FSC 대 SSC 및 2) PE 형광 히스토그램. 첫 번째 샘플을 세포계에 로드하고 수집을실행합니다.</li>
	<li>FSC 대 SSC 플롯의 적혈구 주위에 RBC 게이트를 그립니다. PE 형광 히스토그램에서 RBC 인구를 표시합니다. 통계 보기에서 GR 모집단에서 PE 형광 매개변수에 대한 평균을 선택합니다(그림1F).</li>
	<li>수집 대시보드에서 중지 게이트의 모든 이벤트와 기록할 10,000개의 이벤트를 선택합니다(그림1G). 데이터 기록 을 클릭합니다. 이벤트 기록이 완료되면 세포계에서 첫 번째 튜브를 제거합니다. 전역 워크시트 플롯은 그림 2의플롯과 같아야 합니다.</li>
	<li>다음 샘플을 로드하고 기록합니다.</li>
</ol>6. 적혈구 CR1의 밀도의 결정
<ol><li>"낮음" 피험체에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다(도3, 표 I,RBC MFI), "매체" 피험자(도4, 표 D,RBC MFI), "높음" 주제(도4, 표 I,RBC MFI), 및 음의 대조군 샘플(도3, 표 I,RBC MFI).</li>
	<li>CR1의 밀도의 함수로서 평균 형광 강도를 나타내는 그래프에서, 음의 대조군, "낮음" 피사체, "중간" 피사체 및 "높음" 피사체에 해당하는 4개의 점을 배치한다(파란색 점, 도 6).</li>
	<li>회귀 선을 그려 보정 선과 방정식을 가져옵니다.</li>
	<li>밀도가 결정되는 피험자에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다. (그림5, 표 D와 I, RBC MFI).</li>
	<li>평균 형광 강도값을 사용하여 "Y"를 대체하여 방정식을 얻고 CR1/E의 밀도를계산합니다(그림 6).</li>
	<li>그래프에서 평균 형광 강도 값과 결정된 CR1/E 밀도가 교정 선의 한 점에 해당하는지 확인합니다(그림6).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

적혈구 CR1 (CR1/E)의 밀도를 결정하기 위해 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 사용된 첫번째 기술은 항 CR1항체(31)에 의한 적혈구의 응집 및 C3b32로코팅된 적혈구의 존재 에 있는 장미의 대형이었습니다. 이러한 기초적인 기술은 방사성 표지된 항 CR1 항체1,,33을사용하여 면역 염색 방법으로 빠르게 대체되었다. 또한 효소 연계 면역흡착제 분석(ELISA)34에의해 막 추출물에서 CR1의 농도를 측정할 수도 있다. 정확하지만 이러한 기술은 CR1/E 밀도의 평균 값만 제공합니다. 전체 적혈구 집단에 대한 CR1/E 밀도의 분포는 면역 염색 후 유동 세포 측정 분석에 의해서만 사용할 수 있습니다. 이 기술은 CR1/E의 밀도가 낮기 때문에 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 증폭 방법은...

CR1(수용체 타입 1, CD35)은 적혈구1,B 림프구2,단핵세포, 일부 T 세포, 여포 수지상 세포3,태아 성상세포4,및 사구체 포세포5와같은 많은 세포 유형의 표면에 존재하는 200 kDa 막 막 당단백질이다. CR1은 리간드 C3b, C4b, C3bi6,,7,,88,9,제1 보체 성분의 소단위, C1q10 및 MBL(mannan-binding lectin)을 방해하여 보체 및 세포 면역 반응의 활성화를 억제한다.11
영장류에서, 인간을 포함하는 영장류에서, 적혈구 CR1은 간 및 비장으로 면역 복합체의 수송에 관여하며, 혈액을 정화하고 피부 또는 신장과 같은 취약한 조직에 그들의 축적을방지12,,13,,14. 면역 복합체와 적혈구 사이의 면역 접착의 이러한 현상은 CR1분자(15)의수에 따라 달라지다. 인간에서, CR1/E의 평균 밀도는 단지 500 (즉, 적혈구 당 CR1의 500 분자)입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. "null" 표현형의 일부 개인은 20 CR1/E16보다 적게 표현합니다.
CR1/E의 밀도는 CR1*117,,18에대한 코딩 유전자의 인트론 27에서 점 돌연변이에 연결된 2개의 공동 지배적인 상염색체 대두에 의해 조절된다. 이 돌연변이는 HindIII 효소에 대한 추가적인 제한 부위를 생성한다. 이 경우 HindIII로 소화한 후 얻어진 제한 단편은 CR1(H: 하이 알레일)의 강한 발현에 연결된 대문자에 대해 7.4 kb이고, 낮은 CR1 발현에 연결된 대문자에 대한 6.9 kb이다(L: 저알수). 이 링크는 백인과 아시아인에서 발견되지만 아프리카 혈통의 사람들에서는 발견되지 않습니다19.
적혈구 CR1의 발현 수준은 또한 엑소13 인코딩 SCR 10(I643T) 및 엑소온 19 인코딩 SCR16(Q981H)에서 점 뉴클레오티드 돌연변이의 존재와 상관된다. 그것은 동형 접합 643I / 981Q에서 높고 동형 접합 643T / 981H 개인20에서낮습니다. 따라서, "낮은" 개별은 약 150 CR1/E를 표현하고, "매체" 개별은 약 500 CR1/E를 표현하고, "높은" 개별은 약 1,000 CR1/E를 표현합니다.
이 적혈구 밀도 다형성 이외에, CR1은 서로 다른 크기의 네 개의 allotype에 해당하는 길이 다형성을 특징으로합니다 : CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), CR1 * 4 (250 kDa) 및 항원 다형성21 및 항원 다형성21.
우리는 CR1/E의 밀도를 결정하기 위해 유동 세포측정법을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. CR1/E 밀도가 알려진 3명의 피험자를 사용하여 저밀도 수준(180 CR1/E), 중간 밀도 수준(646 CR1/E), 고밀도 수준(966 CR1/E)을 발현하여, 면역항혈투모 또는 RBC-CR1 을 이용한 적혈구 또는 적혈구(RBC) 또는 RBC MFI의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하기 가 용이하다. 그런 다음 CR1/E 밀도의 함수로 MFI를 나타내는 표준 선을 플롯할 수 있습니다. CR1/E 밀도가 알려지지 않은 피험자의 MFI를 측정하여 이 표준 선과 비교하여 개인의 CR1/E 밀도를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 실험실에서 수년 동안 사용되어 왔으며, 전신 성 홍반성 루푸스 (SLE)23,후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)24,말라리아25,최근 알츠하이머 병 (AD)26, 27과같은 많은 병리학에서 적혈구 CR1의 발현 감소를 검출 할 수있게되었습니다.26, 항혈전성약물(28)의 경우와 같이 적혈구와 결합하여 CR1을 표적으로 하는 약물의 개발은 CR1/E 밀도의 평가, 및 CR1을 정량화하는 견고한 기술의 가용성을 필요로 한다.
제시된 프로토콜은 싱글리케이트에서 실행됩니다. 상업적으로 이용 가능한 96개의 웰 플레이트를 사용하는 많은 개인에 대한 CR1/E의 밀도를 결정하는 데 적합합니다(재료 표참조). 이를 위해 96 웰 플레이트에 당사의 방법을 쉽게 조정할 수 있습니다. 각 견본을 위해, 적혈구의 세포 현탁액 (0.5 x 106 -10 06 적혈구)는 잘 당 분포됩니다. 각 우물을 위해, 첫째로 1 차적인 반대로 CR1 항체가 추가되고, 그 다음 streptavidin PE, 이차 항 스트렙타비딘 항체, 그리고 다시 스트렙타비딘 PE, 우리의 방법의 것과 동일한 희석을 사용하여, 그러나 양을 적응하고 비례를 존중해서.
CR1에 대해 정량화될 범위의 피험자 및 피험자의 혈액 샘플을 동시에 그려서 4 °C에서 냉장고에 보관하고 4 °C (얼음 및 / 또는 냉장고에서)에서 처리해야합니다.

<table><tbody><tr><td>1000E 배리어 팁</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>2079E</td><td>시료 피펫팅</td></tr><tr><td>1-100 &micro; L 베벨, 필터 팁</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td><td>S1120-1840</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-CR1 monoclonal anti body (J3D3)</td><td>비상업적 단클론 항체의 국내 생산, Dr J. Cook</td><td></td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>Blouse</td><td></td><td></td><td>protection</td></tr><tr><td>Bovin serum albumin (7,5%)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>15260037</td><td>세포</td></tr>분석 <tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>11176917</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>Clean Solution</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>340345</td><td>세포분석</td></tr><tr><td>Comorack-96</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>944060P</td><td>랙</td></tr><tr><td>사이토미터 설정 및 추적 비드 키트</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>655051</td><td>세포 분석</td></tr><tr><td>포름 알데히드 용액 36.5 %</td> <td>Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td><td>F8775-25ML</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>10 &micro; L 눈금이 매겨진 필터 팁</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td><td>S1121-3810</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>LSRFORTESSA 유세포 분석기</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>647788</td><td>세포분석</td></tr><tr><td>Microman Capillary Pistons</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>067494</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>Micronic 1.40 mL 둥근 바닥 튜브</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>MP32051</td><td>믹스</td></tr><tr><td>마이크로피펫 Microman - type M25 -</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>066379</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>10010031</td><td>세포분석</td></tr><tr><td>피펫 PS 325 mm, 10 mL</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>391952</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>분말이 없는 니트릴 시험 장갑</td><td>Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td><td>486802</td><td>sample protection</td></tr><tr><td>Reference 2 pipette, 0,5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000024</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Reference 2 pipette, 20-100 &micro; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000059</td><td>샘플 피펫팅</td></tr><tr><td>Reference 2 피펫, 100-1000 &마이크로; L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000083</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Rinse Solution</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>340346</td><td>세포분석</td></tr><tr><td>Round bottom tube</td><td>Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td><td>55.1579</td><td>cytometry</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>0030120086</td><td>mix</td></tr><tr><td>streptavidin R-PE</td><td>Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td><td>AS-60669</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>테이퍼 원심 분리기 튜브 50 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, 프랑스</td><td>10203001</td><td>혼합</td></tr><tr><td>Vector anti streptavidin biotin</td><td>Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td><td>BA-0500</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td><td>SI-0236</td><td>믹스</td></tr></tbody></table>

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, C3b/C4b를 위한 보체 수용체 타입 1)은 약 200 kDa의 고분자량 막 당단백질로, 활성화를 보완하고 면역 복합체를 운반하며 체액 및 세포 면역 반응에 참여합니다. CR1은 적혈구를 포함한 많은 세포 유형의 표면에 존재하며, 길이, 구조(Knops, 또는 KN, 혈액형) 및 밀도에서 다형성을 나타낸다. 적혈구 당 CR1의 평균 밀도 (CR1/E) 적혈구 당 500 분자입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. 우리는 증폭 면역 염색 시스템의 도움으로 낮은 밀도를 발현하는 과목을 포함하여 CR1/E의 밀도를 측정하는 견고한 유량 세포 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 알츠하이머 병 (AD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에이즈 또는 말라리아와 같은 질병에서 CR1 적혈구 발현의 저하를 보여줄 수있게했습니다.

CR1의 밀도가 알려진 3명의 피험자의 적혈구("낮음" 대상 [180 CR1/E], "중간" 대상 [646 CR1/E], 및 "높음" 대상 [966 CR1/E]), 그리고 CR1 밀도가 결정되어야 하는 2명의 피험자의 항 CR1 항체결합을 사용하여 증폭계에 면역으로 염색하였다. 처음에, 낮은 고범위로부터 피험자의 CR1 밀도는 방사성 표지된 항체를 이용한 Scatchard 방법29에 의해 결정되었다. 결정된 표준(낮음, 중간 및 높음)은 교정 곡선에 사용되었고, 당사의 세포분석 방법30에의해 새로운 표준 또는 하부 표준을 정량화할 수 있게 하였다. 유세포계에서 면역염색된 적혈구의 통과 후, 표지의 강도는 각 대상체에 대한 평균 형광 강도(RBC MFI)로 관찰 및 측정하였다(도3F,I; 그림 4B,<stron...

이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

이 프로토콜은 관심의 세포 수용체에 항원 부위의 수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저밀도로 발현된 수용체에 대해서도 견고한 결과를 생성한다는 것입니다. 이 방법은 CR1 적혈구 발현의 감소의 평가를 가능하게 하고 이것은 알츠하이머병, 전신 루푸스 홍반, 에이즈 및 말라리아와 같은 것입니다.이 프로토콜은 세포 수용체 밀도의 모든 분석에 유용하며 형광 현미경에 의한 세포 수용체 발현 연구에도 적용될 수 있다. 우리는 세포 와 항체 분포 동안 튜브를 간격을 두는 것이 좋습니다, 가능한 경우 첫 번째 분석 중에 세포 전문가와 동반. 유동 세포측정에 의한 면역염색 및 밀도 정량화의 시각적 데모는 분석 파라미터를 올바르게 설정하는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다.분석을 시작하기 전에, 4섭씨 PBS-BSA의 20 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원옥 관에 혈액 저장 관에서 EDTA 항응성 전혈의 250 마이크로리터를 추가합니다. 튜브 내용기를 부드러운 반전으로 섞고 세포를 원심분리로 회전시합니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 폐기하고 잔류 용액 의 펠릿을 조심스럽게 재보힙합니다.감기 PBS-BSA의 20 밀리리터를 추가하고 세포를 원심분리합니다. 원심 분리의 끝에, 랙에 튜브를 배치, 얼음에 배치하고 PBS-BSA의 세 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 세척 적혈구의 8 마이크로 리터를 전송. 그런 다음 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 회전하여 적혈구를 부드럽게 혼합합니다.적혈구 면역 염색의 경우 희석 된 적혈구 의 100 마이크로 리터를 개별 1.5 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기고 원심 분리에 의해 적혈구를 수집합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, PBS-BSA에 바이오티니화 항 CR1 J3D3 항체의 마이크로리터 농도당 0.5 마이크로그램의 20마이크로리터를 각 펠릿에 직접 첨가한다. PBS-BSA 버퍼 20마이크로리터를 음의 대조체 세포에 단독으로 추가하고 4°C에서 45분 동안 시료를 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 세척당 튜브 당 750 마이크로리터의 신선한 PBS-BSA로 샘플을 두 번 세척하십시오. 두 번째 세척 후 PBS-BSA에 1~10개의 스트렙타비딘 피코에리스린을 희석한 20마이크로리터를 완만한 믹싱으로 각 튜브에 추가하고 4°C에서 45분 동안 샘플을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 시연된 대로 샘플을 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후, 각 셀 샘플 펠릿을 450 마이크로리터의 고정 버퍼로 고정한 후 각 샘플을 4°C까지 최대 48시간 동안 개별 5밀리리터 라운드 바닥 튜브로 전송합니다. 유동 세포측정을 위한 면역염색된 적혈구를 분석하려면, 유동 세포계의 새 실험 버튼을 클릭하고 새로운 실험의 이름을 바꿉니다. 사이토미터 설정 창에서 전방 분산, 측면 산란 및 PE를 선택합니다.열린 실험에서 사이토미터 설정 응용 프로그램 설정을 선택하고 회색 상자와 십자선을 사용하여 최적화를 안내하는 전역 워크시트를 만듭니다. 모든 파라미터가 설정된 경우, 스테인드되지 않은 제어 튜브를 사이토미터에 로드하고 인수를 실행하여 전방 및 측면 산란 전압을 최적화하여 이물질을 제거하고 관심 모집단이 규모에 있는지 확인합니다. 다음으로, 전방에 적혈구 주위의 게이트를 그리고 측면 산란 플롯을 표시하고 PE 형광의 점 플롯에 적혈구 집단을 표시한다.양수 집단이 규모에 있는 경우 스테인드 컨트롤 튜브를 사이토미터에 적재하고 인수를 실행합니다. 샘플을 기록하고 분석하려면 스테인드 샘플을 언로드하고 새로운 글로벌 워크시트에서 전방 대 측면 분산 플롯 및 PE 형광 히스토그램을 만듭니다. 첫 번째 샘플을 사이토미터에 로드하고, 인수를 실행하고 전방과 측면 산란 플롯의 적혈구 주위에 적혈구 게이트를 그립니다.PE 형광 히스토그램및 통계 탭하에서 적혈구 집단을 표시하고, 적혈구 집단에 대한 PE 형광 파라미터에 대한 평균을 선택한다. 수집 대시보드에서 정지 게이트및 10, 000 이벤트를 모두 선택하고 레코드 데이터를 클릭합니다. 이벤트 기록이 완료되면 세포계에서 튜브를 제거합니다.전역 워크시트 플롯은 그림처럼 보여야 합니다. 알려진 CR1 밀도의 세 가지 피험자로부터 면역 염색 된 적혈구의 흐름 세포 측정 분석은 각 주제에 대한 라벨링의 평균 형광 강도를 측정 할 수 있습니다. 적혈구 CR1의 알려진 밀도로 피사체의 값을 사용하여 곡선을 플로팅하면 이러한 데이터를 평균 형광 강도의 함수로 보고할 수 있습니다.이 곡선에서 다른 피험자의 평균 형광 강도의 값으로 인한 회귀 선을 비교하면 CR1 적혈구 밀도를 결정할 수 있습니다. 적혈구와 항체가 제대로 분포되어 있으므로 음의 대조군에서 실험된 시료의 교정 곡선은 사이토미터 설정범위 내에 있습니다. 이 절차를 조정하여 다른 밀도 세포 수용체를 측정할 수 있으며, 단순히 1차 항체를 변경하고 증폭 층을 적응시키는 것만으로도 가능합니다.혈액을 취급할 때마다 병원균 오염의 위험이 있습니다. 따라서, 좋은 실험실 관행을 사용하고 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다.

measuring-erythrocyte-complement-receptor-1-using-flow-cytometry

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

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간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

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여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

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