건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

이 프로토콜의 목적은 인공 눈물 제형이 인간 각막 상피 세포를 건조로부터 보호할 수 있는지 여부를 체외 모델에서 평가하는 것입니다. 이 방법은 안구 건조 증상이 있는 개인의 안구 보호에 도움이 될 수 있는 안구 건조증 제형을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 각막 상피 세포 대사 활성을 감지하는 매우 민감한 측정 방법을 사용합니다.

그 결과, 건조로 인한 각막 세포 건강의 작은 변화를 감지할 수 있습니다. 오늘 시연을 맡은 사람은 파리사 미르자푸르(Parisa Mirzapour), 니자니 나가루드쿠마란(Nijani Nagaarudkumaran), 아델린 수코(Adeline Suko)입니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10%의 소 태아 혈청과 1%페니실린/스트렙토마이신이 함유된 20ml의 DMEM/F12가 함유된 콜라겐으로 코팅된 플라스크에서 불멸의 인간 각막 상피 세포를 성장시키고 2-3일마다 배지를 교체하는 것으로 시작합니다.

세포가 거의 융합되면 세포 배양 배지를 제거하고 각 플라스크에 4-6ml의 세포 해리 배지를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양하고 주기적으로 현미경으로 확인합니다. 각 플라스크에 10%FBS의 DMEM/F12 2-6ml를 넣고 내용물을 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

450-500 곱의 g에서 5분 동안 세포를 원심분리한다. 그런 다음 상층액을 흡인하고 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계로 세포 농도를 측정하고 100, 000 개의 세포가 포함 된 부피를 계산하십시오.

계산된 세포 부피와 함께 48웰 콜라겐 I-코팅 배양 플레이트의 각 웰에 배지를 추가하고 각 웰의 최종 부피가 0.5밀리리터가 되도록 합니다. 그런 다음 24시간 동안 세포를 배양합니다. 제어 절차의 경우 웰에서 배양 배지를 제거하고 즉시 150마이크로리터의 테스트 제형 또는 배지 제어 용액으로 세포를 처리합니다.

그런 다음 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포에서 시험 해결책을 제거하고, 10%metabolic 염료 해결책의 0.5 밀리리터를 추가하십시오. 세포를 4시간 더 배양합니다.

배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 염료 용액을 제거하고 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광을 측정하고 여기(excitation)를 540나노미터로, 방출을 590나노미터로 설정합니다. 회수 절차를 수행하려면 앞에서 설명한 대로 테스트 용액 또는 대조군으로 세포를 배양합니다.

그런 다음 각 웰에 0.5ml의 DMEM/F12 매체를 추가합니다. 18시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 대사 활동을 테스트합니다.

제어 절차를 수행하려면 48-well 플레이트의 세포에서 배양 배지를 제거하고 즉시 테스트 제형 또는 배지 제어 용액으로 처리합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 세포에서 테스트 용액을 제거하고 섭씨 37도, 습도 45%의 챔버에 5분 동안 넣어 건조시킵니다.

다음으로, 0.5 밀리리터의 10 % 대사 염료 용액을 첨가하고 섭씨 37 도에서 5 % 이산화탄소에서 4 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 대사 염료 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 형광을 측정합니다. 회수 절차를 수행하려면 앞서 설명한 프로토콜을 반복하고 건조 단계 후 DMEM/F12 배지를 사용한 18시간 배양을 포함합니다.

그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 데이터에 대한 통계 분석을 수행합니다. 인간 각막 상피 세포의 생존력에 미치는 영향에 대해 세 가지 안구 건조증 제형을 비교했습니다. 용액 1과 2는 건조 전에 세포의 대사 활성에 상당한 영향을 미쳤습니다.

용액 1에 노출된 세포는 18시간의 회복 후 세포 대사 활동이 추가로 감소했는데, 이는 세포가 초기에 손상을 입었고 손상이 복구되지 않았음을 의미합니다. 이에 비해 용액 3은 상피 세포의 대사 활성에 가벼운 효과만 미쳤습니다. 이러한 지질 함유 안구건조증 제형의 세포 보호 능력을 비교한 결과, 용액 1과 2는 건조 스트레스로부터 세포를 보호하지 못하는 것으로 나타났습니다.

그러나 해결책 3은 어느 정도 보호를 제공했다. 세포를 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 파종할 때, 각 웰이 동일한 세포 번호로 파종되도록 세포 현탁액에 균일하게 혼합된 세포가 포함되어 있는지 확인하십시오. 용액 3은 다른 두 가지 지질 함유 제품에 비해 세포 생존율과 건조 스트레스로부터의 보호가 통계적으로 유의하게 개선된 것으로 나타났습니다.

HP-guar 및 프로필렌 글리콜과 함께 인지질이 함유된 미네랄 오일을 사용하면 용액 3이 각막 세포에 수분을 보호하고 건조 시 증발을 줄일 수 있습니다.