Name: 건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 인공 눈물 제형이 건조에 노출된 인간 각막 상피 세포의 대사 활성을 보호하는지 평가하는 방법을. 이 기법은 건성안 증상 환자의 안구 보호에 도움이 되는 제형을 식별하는 데 활용됩니다.

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저자는 이러한 연구에 대 한 재정 지원을 제공 하는 알콘 감사.

1. 인간 각막 상피 세포 배양
<ol><li>콜라겐 코팅 75cm2 플라스크에서 불멸의 HCEC19를 성장시켰으며, 덜벡코의 수정된 이글 중간/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신(COS)을 37°C로2%로 성장시켰다. 참고: 흔들림은 필요하지 않습니다.</li>
	<li>매 2-3 일 마다 미디어를 변경합니다.</li>
</ol>2. 테스트를 위한 세포 준비
<ol><li>세포가 거의 수렴 된 후 배양 매체를 제거합니다.</li>
	<li>각 75cm2 플라스크에 세포 분리 용액4-6 mL을 추가합니다. 세포가 분리 될 때까지 37 °C에서 세포를 배양 (약 20-30 분), 주기적으로 현미경하에서 확인.</li>
	<li>각 75cm 2 플라스크에 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12의2-6 mL을 추가합니다.</li>
	<li>플라스크의 내용을 50mL 원심분리기 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>세포를 원심분리하여 450-500 x g에서 5분 동안 분리합니다. 상체를 피우고 미리 데워진 미디어에서 셀을 다시 중단합니다.</li>
	<li>혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 총 1 x 105 셀을 포함하는 미디어의 볼륨을 계산합니다.</li>
	<li>48 웰 콜라겐-1 코팅 배양 플레이트의 각 웰에 1 x 105 셀을 추가합니다. 우물의 마지막 미디어 볼륨이 10 % FBS와 문화 DMEM / F12의 0.5 mL되도록 우물에 충분한 미디어를 추가합니다. 참고: 인공 눈물 제제는 HCEC의 대사 활성의 감소에 의해 측정될 수 있는 세포 독성을 일으키는 원인이 될 수 있다. 데이터의 일관성은 시드를 할 때 각 웰에 동일한 수의 HCEC를 추가하는 데 따라 달라집니다. 48웰 플레이트에 권장되는 배양 농도는 1 x 105입니다. 포유류 세포는 재중단 후 원심분리기 관에 정착할 수 있기 때문에 세포 현탁액이 HCEC를 동등하게 분배하도록 세포를 세포로 파종하는 동안 자주 동요하여 세포를 재중단하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>세포를 37°C및 5%CO2에서 24시간 동안 배양한다.</li>
</ol>3. 탈수 프로토콜 없음
<ol><li>제어 절차<ol>
<li>24h 배양 후 플레이트에서 배양 매체를 제거한다.</li>
		<li>테스트 제형 및 미디어 제어 솔루션의 150 μL로 즉시 처리합니다.</li>
		<li>37°C에서 세포를 배양하고 30분 동안 5%CO2를 배양합니다.</li>
		<li>셀에서 테스트 솔루션을 제거합니다.</li>
		<li>신진 대사 활성을 테스트하기 위해 10 % 대사 염료 용액의 0.5 mL을 추가하십시오. 세포를 37°C및 5% CO2에서4시간 동안 배양한다.</li>
		<li>4h 인큐베이션 기간 후, 각 우물에서 100 μL의 대사염염액을 제거하고 각 100 μL을 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.</li>
		<li>형광판 판독기(재료표)를 사용하여 각웰의형광을 측정합니다. 540 nm에서 흥분 파장을 설정하고 590 nm에서 방출 파장을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>탈수 프로토콜 없음(복구 절차)<ol>
<li>3.1.1-3.1.4 단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 웰에 DMEM/F12 용지0.5mL를 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 18h 및 5% CO2에대한 1세트의 배양을 배양한다.</li>
		<li>미디어를 제거하고 10% 대사 염료 용액의 0.5mL를 추가합니다. 3.1.6 및 3.1.7 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 탈수 프로토콜
<ol><li>제어 절차<ol>
<li>24h 인큐베이션(단계 2.8)이 끝나면 플레이트에서 배양 매체를 제거한다.</li>
		<li>테스트 제형 및 미디어 제어 솔루션의 150 μL로 즉시 처리합니다.</li>
		<li>37°C에서 세포를 배양하고 30분 동안 5%CO2를 배양합니다.</li>
		<li>셀에서 테스트 솔루션을 제거합니다.</li>
		<li>세포를 37°C 및 45% RH 챔버에 5분 동안 배치하여 세포를 담정합니다.</li>
		<li>신진 대사 활성을 테스트하기 위해 10 % 대사 염료 용액의 0.5 mL을 추가하십시오. 세포를 37°C및 5% CO2에서4시간 동안 배양한다.</li>
		<li>4h 인큐베이션 기간 후, 각 우물에서 100 μL의 대사염염액을 제거하고 각 100 μL을 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.</li>
		<li>형광판 판독기를 사용하여 각 우물의 형광을 측정합니다. 540 nm에서 흥분 파장을 설정하고 590 nm에서 방출 파장을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구 절차<ol>
<li>4.1.1-4.1.5 단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 웰에 DMEM/F12 용지0.5mL를 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 18h 및 5% CO2에대한 1세트의 배양을 배양한다.</li>
		<li>미디어를 제거하고 10% 대사 염료 용액의 0.5mL를 추가합니다. 4.1.7 및 4.1.8 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>미디어 제어의 평균 형광을 계산합니다. 다음 수식을 사용하여 샘플의 백분율 실행 가능성을 계산합니다. 샘플의 % 생존가능성 = 시험 샘플 형광/미디어 제어 형광 x 100 참고: 미디어 제어 평균은 100% 실행 가능성이 높습니다. 대사 염료 자체는 그것과 관련된 소량의 형광을 가지고 있습니다. 대사 염료 시약의 형광은 미디어 제어에 대한 테스트 샘플의 % 생존가능성을 계산하기 전에 제어 및 시험 샘플 형광으로부터 차감될 수 있다.</li>
	<li>제어 및 테스트 샘플에서 동일한 분산에 대한 정상 테스트 및 테스트를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 통과하고 분산이 같으면 단방향 ANOVA를 수행합니다. 특정 그룹 간의 중요한 차이점을 식별하려면 호크 테스트 후 쌍별 비교(예: Tukey 또는 Dunnett의 여러 비교 테스트)를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 통과하고 분산이 다른 경우 Welch의 ANOVA를 수행합니다. 특정 그룹 간의 중요한 차이점을 식별하려면 호크 테스트 후 쌍별 비교(예: 던넷 또는 게임-하웰 다중 비교 테스트)를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 실패하면 비파라메트릭 테스트(즉, 크루스칼-월리스 테스트)를 사용하십시오. 특정 그룹 간의 상당한 차이점을 식별하려면 Hoc 테스트 후 쌍별 비교(즉, Dunn의 테스트)를 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
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<li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li>
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<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li>
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<li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li>
<li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li>
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<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li>
<li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trefoil+factor+family+peptide+3+%28TFF3%29+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li>
<li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts%3A+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights%5BTitle%5D)+AND+%22Building+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li>
<li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li>
<li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li>
<li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li>
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<li>Lievens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+enhanced+viscosity+artificial+tear+for+moderate+to+severe+dry+eye+disease%3A+A+multicenter%2C+double-masked%2C+randomized+30-day+study%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).</li>
</ol>

세 작가(레카 랑가라얀, 하워드 에이 케텔슨, 락슈만 서브바라만)는 알콘의 직원이다. 알콘은 이 프로젝트의 자금 조달 및 후원자의 유일한 원천입니다. 린든 W. 존스, 지난 3 년 동안, 다음과 같은 회사에서 연구 지원 또는 강의 명예를 받은: 알콘, 알레르겐, 콘타맥, 쿠퍼 비전, GL Chemtec, 인플라맥스 연구, J&J 비전, 메니콘, 자연의 방법, 노바티스, PS 치료, 산텐, 샤이어, 시력 유리와 비전. 린든 존스는 컨설턴트이자/또는 알콘, 쿠퍼비전, J&J 비전, 노바티스 및 오브텍스의 자문 위원회에서 활동하고 있습니다. 저자의 다음 목록은 공개 할 필요가 없습니다 : 리처드 도, 데이비드 J. 맥칸나, 아델레인 수코, 대릴 엔스톤, 자야 댄탐.

이 프로토콜은 세포 건조에 대한 인공 눈물 용액의 보호 효과를 결정하도록 설계되었습니다. 처음에 세포는 세포를 코팅하기 위해 안구 안약에 노출됩니다. 다음으로, 세포는 건조되고, 대사 활성은 제형이 탈수 스트레스의 해로운 효과를 완화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 모니터링된다. 이 단계는 안구건조기 제형이 각막 상피 세포의 전반적인 생존가능성에 미칠 수 있는 전반적인 충격을 이해하는 데 중요합니다.
대부분의 안구건조건조제가 배양 우물에서 제거된 후, 세포와 접촉하는 나머지 분자의 화학은 세포 건조에 영향을 미칩니다. 일부 제품에는 세포 증발을 최소화하는 오일의 미세에멀젼(20)이포함되어 있습니다. 헹구기 후 마찰 분석을 평가한 연구는 안구건조증제형(21)의주거 시간을 나타내는 지표가 될 수 있는 일부 안구건조증 제형에 대한 낮은 마찰유지를 보여주었다. 이 분석의 한계 중 하나는 탈수 보호가 다른 안약 제형에 비해 평가될 수 있지만 이 보호의 지속 기간은 짧은 건조 시간 으로 인해 결정될 수 없다는 것입니다. 이 시험관 내 분석에서 건조 시간이 길어지면 세포 단층보다 전반적으로 수분 함량이 더 많은 다층 배양을 사용해야 할 수 있습니다.
세포상제형에 대한 구체적인 배양 시간 및 건조 시간의 지속 시간은 온도 및 습도 값이 변경될 경우 조정될 필요가 있을 수 있다. 안구건조증에 기여할 수 있는 환경스트레스 조건을 시뮬레이션하기 위한 온도, RH 및 공기 흐름을 선택하는 것은 계절및 지역 환경 조건이 매우 가변적이기 때문에 어려울 수있다. 인간 연구를 위한 현대환경챔버는 5°C와 35°C, RH 사이의 온도를 5%에서 95%22사이로변화시킬 수 있다. 증발계와 단단히 장착된 고글을 사용하여 40-45%의 RH에서 각막으로부터의 증발율은 0.037 μL/cm2/min및RH 20-25%로 증발율은 0.065 μL/cm2/min23이었다. 시험관내 모델이비행기(15),사막, 또는 건조한 실내환경(16)과같은 매우 낮은 RH 조건하에서 제형의 보호 효과를 보고 있는 경우, 인큐베이션 시간은 세포로부터의 향상된 증발속도를 수용하기 위해 감소될 필요가 있다. 인간의 눈물액에서, 메이보미안과 다른 땀샘에서 파생된 다양한 지질이 존재하여 증발로부터 눈물을 보호합니다. 이 지질은 다른 융점24를가지고 있습니다. 온도 변화는 눈물 액의 유동성에 영향을 미칠 수 있으므로 주변 온도에서 수행 된 테스트는 37 °C에서 수행 된 테스트보다 크게 다른 증발 속도를 가질 수 있습니다. 평균 안구 표면 온도 범위는 32.9 ~ 36°C25이기때문에, 이 온도 범위 근처에서 시험을 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에 사용되는 대사 염료(alamarBlue) 외에도 세포 대사 활동에 대한 제품 제형의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 화학 시약이 있다. 테트라졸륨 염(MTT, XTT, MTS, WST)은 사용할 수 있는 대체 화학물질입니다. 테트라졸륨 염의 차이는 MTT가 양전하 분자이므로 살아있는세포(26)의세포질에 들어갈 수 있다는 것입니다. MTT는 NAD(P)H27에의한 감소 후 용해되지 않게 된다. 플레이트 판독기에서 흡광도를 읽기 전에 용해성화되어야 합니다. 다른 테트라졸륨 염은28로음하로 충전된다. 그(것)들은 세포를 입력하고 세포 내 분자(29)와직접 상호 작용할 수 없기 때문에 살아있는 세포 외부의 이차 분자에 의해 감소되어야 합니다. XTT, MTS 및 WST-1 아세의 경우 전자 커플링 에이전트 1-메톡시 페나진 메토술페이트(PMS)를 첨가하면아세서(30)의성능을 향상시킬 수 있다. tetrazolium 염을 사용 하는 대사 assays와는 달리, alamarBlue 추가 용용 또는 전자 커플링 에이전트를 필요로 하지 않습니다. 또한, XTT, MTS 또는 WST-1과 달리, alamarBlue는 세포막을 관통하고 세포효소(27,29)에의해 직접 감소될 수 있다. alamarBlue를 테트라졸륨 염에 직접 비교한 결과, AlamarBlue는 HCEC3,27,31,32등 다양한 세포주의 대사 활성을 평가하기 위해 더 민감하다는 것을 보여주었다.
다른 생화학적 종점은 또한 탈수에 의한 인간 각막 상피 세포의 보호를 평가하기 위한 고려될 수 있습니다. 형광염염료는 세포막 투과성 및 세포 에스트라아제 활성1을검출하는 데 사용될 수 있다. 또한, 세포 표면에 세포 표면에 석멸 마커에 대한 염색또는 카스파제 활성1,33을측정함으로써 세포 세포 에 스테인싱하여 세포 세포증을 검출할 수 있다. 다른 assays는 HCEC 꽉 접합34에안과 제품의 효과를 결정했다. 이러한 논문은 이 문서에 설명된 탈수 절차를 활용하여 향후 평가에 포함될 수 있습니다.
안구건조증의 원인은 여러 가지가 있습니다. 안구 건조증은 눈물의 분비 감소, 안구 표면 염증 증가 또는 안구 표면의 탈수 증가로 인해 발생할 수 있습니다. 건조 조건 동안 건조에서 그들의 세포를 방지 하는 안구 건조 방울의 증발 안구건조증 사용 이 개인에 대 한 안구 건조의 증상을 완화수 있습니다. 일부 안구 건조증 제제의 문제 중 하나는 안구 표면에 해를 끼칠 수 있는 방부제의 존재입니다. 부상당한 세포가 탈수 스트레스(35)에더 취약하기 때문에 더 많은 세포가 죽을 수 있으므로 세포를 손상시키는 것은 안구 건조 환자에게 도움이되지 않습니다.
Garrigue 외.36에 의해 최근 검토 기사는 지질 기반 제품이 증발 안구건조증을 완화하기 위해 어떻게 작용하는지에 대한 현재의 지식의 평가를 제공합니다. 지질 결핍 눈물에 지질을 추가하면 증발을 방지 할 수 있으므로 세포가 건조로부터 보호됩니다. 또한, 군수제는 안구표면(37)에서물을 유치하고 유지하는 분자이다. 용액 #1 글리세린과 용액의 프로필렌 글리콜 #3 모두 부추관입니다. 용액 #3 제형 성분의 지질 및 후유성 특성 때문일 수 있는 HCEC의 더 큰 보호 효과를 보였다.
이 프로토콜은 안구건조증 제형에 노출된 후 HCEC의 대사 활성을 평가하고 건조 스트레스를 평가하도록 설계되었습니다. 이 문서에 설명된 방법을 사용하여 증발성 안구건조증을 앓고 있는 사람들을 위해 새로운 비자극성 및 보호 점안액을 개발할 수 있습니다.

다용량 안과 용액의 많은 다른 성분은 안정성, pH, 발진 및 효능을 유지하기 위해 필요합니다. 그러나, 안구 솔루션에서 방부제 또는 계면활성제와 같은 일부 화학 물질은 각막 상피1,2에손상을 일으킬 수 있다. 인간 각막 상피 세포(HCEC)를 이용한 세포 생존성 테스트는 안과 제제에서 이러한 다양한 성분에 의한 잠재적 손상을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 세포 손상을 평가하는 데 특히 유용한 체외 분석 중 하나는 alamarBlue 분석3이다. 이 분석에서, 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 세포 생존 성 지표로 작동하는 레사쥐린을 포함합니다. 세포 호흡 동안, 레사쥐린은 전자4를받아들이면 레스소루핀으로 감소된다. 레소루핀의 감소는 비형광 분자에서 분광성계5를사용하여 검출될 수 있는 형광 분자로의 변화를 일으킨다.
이 조사는 각막 상피 세포의 2개의 다른 처리를 사용하여 안구건조구건조기 제품이 체외 모형에서 어떻게 능력을 발휘할 수 있는지 결정하기 위하여. 첫 번째 평가에서, 세포는 30 분 동안 이러한 제품으로 처리된다. 치료 후, 세포는 안구건조건조건조제품에 노출된 직후와 회복 시간 간격 이후에 대사 활성을 평가한다. 이 평가는 습도 챔버에서 건조하기 전에 세포에 이러한 제품의 효과를 결정합니다. 이러한 솔루션에서 용액 방부제, 계면 활성제 또는 완충제는 대사 염료를 사용하여 검출될 수 있는 세포에 약간의 세포독성 효과가 있을 수 있다.
두 번째 평가는 안구건조에 노출된 후 세포의 대사 활성을 결정한다. 이 평가에서, 제품 치료가 탈수 손상으로부터 세포에 대한 보호를 제공하는 경우, 세포의 대사 활성은 유지될 것이다. 건조의 유해한 영향으로부터 세포 보호는 안구 건조의 유해한 영향으로부터 발생하거나 제품이 세포에 수분을 추가하는 주변환경으로부터 액체를 흡수할 수 있는 경우 발생할 수 있다.
이 프로토콜은 세포에 대한 환경 스트레스의 심각한 조건을 시뮬레이션하도록 설계되었습니다. 다른 연구는 이 외부 응고를 만들기 위하여 각종 모형을 이용했습니다. 일부 연구는 라미나르 유동 후드6,7,8에서세포를 건조한 반면, 다른 연구는 실온 및 다양한 상대 습도(RH) 값을9,10,11로사용했다. 안구건조증 상태를 시뮬레이션하는 방법은 인큐베이팅용액(12,13)의진동을 증가시키는 것이다. 불리한 환경 조건을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 체외 방법은 안구건조증 환자의 눈물액을 시뮬레이션하기 위해 세포 매체에 사이토카인을 첨가하여14. 이 시험은 화학 물질이 삼투압응을 감소시키는 방법을 평가하거나 면역 계통을 자극할 수 있는 흥미로운 모형이지만, 이 모형은 화학 제형이 탈수 긴장에서 세포를 보호할 수 있는 방법을 직접 보여주지 않습니다.
탈수 모델은 온도/습도 챔버 37°C 및 45% RH를 사용합니다. 안구 표면에서 증발을 일으킬 수 있는 환경 조건을 시뮬레이션합니다. 비행기캐빈(15)이나 겨울철 실내 환경에서 발견되는 습도가 낮거나16년 동안 실내 환경에서 발견되는 다른 극단적인 환경 조건의 시뮬레이션도 이 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.
세포 배양 모델링은 인간 각막에 대한 건조 응력의 효과를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 세포 스트레스를 감지하기 위해 세포 생존 가능성 테스트는 세포 건강에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행됩니다. 몇몇 다른 생리학적 시험은17의스트레스를 받는지 결정하기 위하여 세포에 수행될 수 있습니다. 이 시험 절차에서 수행된 분석은 시판되는대사염(재료표)을 사용한다. 그것은 비 독성, 성장 매체에 용해하고 세포 고정없이 세포를 평가 할 수 있다는 점에서 많은 다른 세포 스트레스 테스트에 비해 장점을 갖는다18. 이 절차에서 세포는 각 치료 직후 대사 활성을 테스트하고 두 번째 세포 세트는 성장 매체로 다시 배치되고 18 h 회복 후 평가됩니다. 회복 기간 이후에 즉시 테스트하는 이유는 대사 활동과 지연된 효과를 유발하는 세포 손상에 즉각적인 영향을 미치는 세포 손상을 식별하기 때문입니다. 또한, 이러한 제제가 단기 대 장기 손상에 미치는 영향과 초기 모욕으로부터 복구/복구하지 않는 제제의 능력을 평가할 수 있는 기회를 제공한다.
이 조사는 건조유무의 HCEC 대사 활동에 미치는 영향에 대해 다양한 지질 함유 안구건조증 제품을 비교하는 데 사용됩니다. 테스트된 안구건조기 제품의 성분은 재료표에기재되어 있다. 용액 #1 성분은 카복티메틸셀룰로오스 나트륨(0.5%), 글리세린(1%), 폴리소르바테 80(0.5%), 용액#2 광광유(1.0%) 및 미네랄 오일(4.5%)과 용 #3액에서 지질은 미네랄 오일과 프로필렌 글리콜이 데물입니다. 이러한 지질은 건조로부터 HCEC의 보호를 제공할 것으로 예상되는 제형 성분이다.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 벤티드 플라스크</td><td>코닝</td><td>354485</td><td>이것은 BioCoat 브랜드 콜라겐 코팅</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>알라마블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>코닝 48 웰 플레이트</td><td>코닝</td><td>354505</td>입니다 이것은 <td>BioCoat 브랜드 콜라겐 코팅</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV입니다.</td><td>280 - 700 nm (분석 540/590의 경우)</td></tr> <tr><td>L- 글루타민 및 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>이 매체에는 페놀 레드가 없습니다</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Hycone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>인간 각막 상피 세포</td><td>오타와 대학교</td><td>N / A</td><td>M. Griffith 박사(캐나다 오타와 안과 연구소)의 SV40 불멸화 인간 각막 상피 세포는 Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA를 특성화했습니다. 세포주에서 구성된 기능적 인간 각막 등가물. 과학. 1999; 286:2169&ndash;72.</td></tr><tr><td>습도/온도 챔버</td><td>관련 환경 시스템</td><td>LH-1.5</td><td>이코노미 라인 습도 챔버</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100X 농도이므로 각 99ml의 미디어에 1ml를 추가하십시오</td></tr><tr><td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td><td>Allergan, Inc</td><td></td><td>카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨 (0.5 %), 글리세린 (1 %), 폴리 소르 베이트 80 (0.5 %), - 윤활제 - 비활성 성분 - 붕산; 카보머 공중합체 A형; 피마자유; 에리스리톨; 레보카르니틴; 정제수; Purite (stablized oxychloro complex)이며 pH를 조정하기 위해 수산화 나트륨을 함유 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Soothe XP (solution #2)</td><td>바우쉬 & </td><td></td> 롬 <td>라이트 미네랄 오일 (1.0 %), 미네랄 오일 (4.5 %) - emolients - 비활성 성분 - 붕산, 에데 테이트 디 소듐, 옥 톡시 놀 -40, 폴리 쿼터 늄 -1 (방부제), 폴리 소르 베이트 80, 정제수, 붕산 나트륨 수화물. 염산 및/또는 수산화나트륨(pH 조절용)을 포함할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Systane Complete (솔루션 #3)</td><td>Alcon Inc.</td><td></td><td>프로필렌 글리콜 0.6% 윤활제 비활성 성분- 보릭산, 디미리 스토일 포스파티딜글리세롤, 에다타테이트 디소듐, 하이드록시프로필 구아, 미네랄 오일, 폴리옥슬 40 스테아레이트, POLYQUAD&reg; (폴리쿼터늄-1) 0.001% 방부제, 소르비탄 트리스테아레이트, 솔비톨 및 정제수. pH를 조절하기 위해 염산 및/또는 수산화나트륨을 함유할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TrypLE Express(세포 분해 솔루션)</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td><td></td></tr></tbody></table>

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

결핍된 눈물 지질 층의 복원에 의한 눈물 증발을 줄이기 위해 인공 지질 함유 눈물 제형이 개발된다. 세포 탈수를 방지하는 인공 눈물 제형은 안구 표면 보호 및 세포 대사 활동의 유지 를 초래할 것이다. 탈수 하는 동안, 세포 신진 대사 활동의 손실 및 이후 세포 죽음의 과정을 겪고. 이 작품은 인공 눈물 제형의 효능을 평가하는 방법을 설명합니다. 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 낮은 형광 분자 resazurin에서 실행 가능한 세포에서 형광 분자 resorufin로 변경됩니다. 인공 눈물 제형의 생물학적 성능은 (a) 세포 생존가능성을 유지하고 (b)가 탈수로부터 세포 보호를 제공하는 제형의 능력으로 측정된다. 성장 매체와 식염수는 세포 생존/탈수 검사에 대한 컨트롤로 사용됩니다. 세포는 30분 동안 테스트 용액으로 배양한 다음 37°C에서 0 또는 5분 및 상대 습도 45%로 건조됩니다. 세포 대사 활동은 초기 노출 후 및 세포 건조 후 결정된다. 결과는 세포 대사 활동 및 탈수 보호에 안약 제형의 비교 효력을 보여줍니다. 이 방법은 증발 성 안구 건조증을 가진 개별을 취급하도록 디자인된 안구 건조제 제형을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다.

3개의 안구건조도 제형을 비교하는 연구 결과에서 결과는 도 1에도시된다. 이 수치는 3개의 제품, 솔루션 #1, 솔루션 #2 및 솔루션#3(재료표)가HCEC의 생존가능성에 미치는 영향에 차이가 있음을 보여줍니다. 해결책 #1 및 해결책 #2 건조하기 전에 HCEC의 대사 활동에 중요한 영향을 미쳤습니다. 즉, HCEC의 대사 활성을 방해할 수 있는 이러한 제품에 제형 성분이 있다. #1 용액에 노출된 세포의 18h 회복 후 발생한 세포 대사 활동의 추가 하락은 HCEC가 처음에 부상을 입었으며 18시간 이후에 는 부상이 복구되지 않았다는 것을 보여줍니다. 비교에서, 해결책 #3 HCEC의 신진 대사 활동에 온화한 효력이 있었습니다.
도 2는 이러한 지질 함유 안구건조증제의 세포 보호 효과를 나타낸다. 18h 회복 간격에서 거의 0% HCEC 대사 활성으로, 용액 #1 및 용액 #2 탈수 스트레스로부터 세포를 보호하지 못했습니다. 그러나 솔루션 #3 탈수 스트레스에 대한 일부 보호를 제공했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> 그림 1: 안구건조증 지질 강화 제품의 효과로 세포 생존가능성에 영향을 미칩니다. 지질 함유 안구건조증 제품으로 치료 후 HCEC 대사 활성에 의해 측정된 상대적 생존가능성. * = 적절한 복구 기간 동안 미디어 제어에 비해 용액 #3, Δ = 통계적 유의(p &lt; 0.05)에 비해 통계적 유의(p &lt; 0.05). 막대의 높이는 평균 값을 나타내며 오류 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">SD입니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> 그림 2: 건조 방지에 대한 안구건조증 강화 제품의 효과. 지질 함유 안구건조증 제형이 세포 보호에 미치는 영향. 솔루션 #1 솔루션 #2 건조 스트레스로부터 세포를 보호하지 않았고 시간이 지남에 따라 탈수 효과에서 회복되지 않았습니다. 대조적으로, 해결책 #3 탈수 응력에 대하여 몇몇 보호를 제안했습니다. * ※ p &lt; 0.05 용액 #3 상대적이며, Δ = p&lt; 0.05 처리되지 않은 (대조군) 매체에 상대적 적절한 복구 시간. 막대의 높이는 평균 값을 나타내며 오류 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">SD입니다.</a>

이 프로토콜의 목적은 다른 인공 눈물 제형이 체외 모델을 사용하여 건조로부터 인간의 각막 상피 세포를 보호 할 수 있는지 평가하는 것입니다. 인공 눈물 제형 및 탈수에 노출 된 후, 인간 각막 상피 세포는 대사 활성을 위해 평가됩니다.

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

이 프로토콜의 목적은 인공 눈물 제형이 인간 각막 상피 세포를 건조로부터 보호할 수 있는지 여부를 체외 모델에서 평가하는 것입니다. 이 방법은 안구 건조 증상이 있는 개인의 안구 보호에 도움이 될 수 있는 안구 건조증 제형을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 각막 상피 세포 대사 활성을 감지하는 매우 민감한 측정 방법을 사용합니다.그 결과, 건조로 인한 각막 세포 건강의 작은 변화를 감지할 수 있습니다. 오늘 시연을 맡은 사람은 파리사 미르자푸르(Parisa Mirzapour), 니자니 나가루드쿠마란(Nijani Nagaarudkumaran), 아델린 수코(Adeline Suko)입니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10%의 소 태아 혈청과 1%페니실린/스트렙토마이신이 함유된 20ml의 DMEM/F12가 함유된 콜라겐으로 코팅된 플라스크에서 불멸의 인간 각막 상피 세포를 성장시키고 2-3일마다 배지를 교체하는 것으로 시작합니다.세포가 거의 융합되면 세포 배양 배지를 제거하고 각 플라스크에 4-6ml의 세포 해리 배지를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양하고 주기적으로 현미경으로 확인합니다. 각 플라스크에 10%FBS의 DMEM/F12 2-6ml를 넣고 내용물을 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.450-500 곱의 g에서 5분 동안 세포를 원심분리한다. 그런 다음 상층액을 흡인하고 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계로 세포 농도를 측정하고 100, 000 개의 세포가 포함 된 부피를 계산하십시오.계산된 세포 부피와 함께 48웰 콜라겐 I-코팅 배양 플레이트의 각 웰에 배지를 추가하고 각 웰의 최종 부피가 0.5밀리리터가 되도록 합니다. 그런 다음 24시간 동안 세포를 배양합니다. 제어 절차의 경우 웰에서 배양 배지를 제거하고 즉시 150마이크로리터의 테스트 제형 또는 배지 제어 용액으로 세포를 처리합니다.그런 다음 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포에서 시험 해결책을 제거하고, 10%metabolic 염료 해결책의 0.5 밀리리터를 추가하십시오. 세포를 4시간 더 배양합니다.배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 염료 용액을 제거하고 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광을 측정하고 여기(excitation)를 540나노미터로, 방출을 590나노미터로 설정합니다. 회수 절차를 수행하려면 앞에서 설명한 대로 테스트 용액 또는 대조군으로 세포를 배양합니다.그런 다음 각 웰에 0.5ml의 DMEM/F12 매체를 추가합니다. 18시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 대사 활동을 테스트합니다.제어 절차를 수행하려면 48-well 플레이트의 세포에서 배양 배지를 제거하고 즉시 테스트 제형 또는 배지 제어 용액으로 처리합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 세포에서 테스트 용액을 제거하고 섭씨 37도, 습도 45%의 챔버에 5분 동안 넣어 건조시킵니다.다음으로, 0.5 밀리리터의 10 % 대사 염료 용액을 첨가하고 섭씨 37 도에서 5 % 이산화탄소에서 4 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 대사 염료 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 형광을 측정합니다. 회수 절차를 수행하려면 앞서 설명한 프로토콜을 반복하고 건조 단계 후 DMEM/F12 배지를 사용한 18시간 배양을 포함합니다.그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 데이터에 대한 통계 분석을 수행합니다. 인간 각막 상피 세포의 생존력에 미치는 영향에 대해 세 가지 안구 건조증 제형을 비교했습니다. 용액 1과 2는 건조 전에 세포의 대사 활성에 상당한 영향을 미쳤습니다.용액 1에 노출된 세포는 18시간의 회복 후 세포 대사 활동이 추가로 감소했는데, 이는 세포가 초기에 손상을 입었고 손상이 복구되지 않았음을 의미합니다. 이에 비해 용액 3은 상피 세포의 대사 활성에 가벼운 효과만 미쳤습니다. 이러한 지질 함유 안구건조증 제형의 세포 보호 능력을 비교한 결과, 용액 1과 2는 건조 스트레스로부터 세포를 보호하지 못하는 것으로 나타났습니다.그러나 해결책 3은 어느 정도 보호를 제공했다. 세포를 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 파종할 때, 각 웰이 동일한 세포 번호로 파종되도록 세포 현탁액에 균일하게 혼합된 세포가 포함되어 있는지 확인하십시오. 용액 3은 다른 두 가지 지질 함유 제품에 비해 세포 생존율과 건조 스트레스로부터의 보호가 통계적으로 유의하게 개선된 것으로 나타났습니다.HP-guar 및 프로필렌 글리콜과 함께 인지질이 함유된 미네랄 오일을 사용하면 용액 3이 각막 세포에 수분을 보호하고 건조 시 증발을 줄일 수 있습니다.

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 레사주린 기반 알라마르 블루 용액을 사용하여 각막 상피 세포의 세포 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 효과를 평가하기 위한 체외 형광 분석에 대해 설명합니다. 무독성 제형은 세포를 건강하고 대사적으로 활성화된 상태로 유지하여 레사주린을 고형광 레소루핀으로 환원시키는 것을 촉진합니다.

alamarBlue Assay: 인간 각막 상피 세포의 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 세포 독성 효과를 스크리닝하는 민감한 형광 측정 방법

이 비디오는 자가면역 쥐 모델에서 각막의 평활도와 눈물막 안정성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 안구건조증을 이해하는 데 중요한 눈물막 안정성에 대한 분비샘 기능 장애의 영향을 강조합니다.

자가면역 안구건조증 쥐 모델의 각막 및 눈물 부드러움 평가

이 기사에서는 궤도 해구 시스템의 모든 부분에 concanavalin A를 주입하여 토끼에서 급성 또는 만성 안구 건조 증을 유도하는 방법의 개발을 설명합니다. 이미 보고된 방법보다 우수한 이 방법은 약리학 적 제제의 연구에 적합한 안구 건조증의 재현 가능하고 안정적인 모델을 생성합니다.

코카나발린A에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용

토끼에 있는 만성 안구 건조병을 외과로 모든 궤도 해구땀샘을 제거하여 유도하기 위하여 새로운 접근이 제시됩니다. 이전에 보고된 것과 는 구별되는 이 방법은 눈물 생리학 및 병리생리학 및 안구 치료제를 연구하는 데 적합한 수성 결핍 안구 건조증의 안정적이고 재현 가능한 모델을 생성합니다.

토끼의 완전한 다크레오아데네절제술을 이용한 중증 안구건조증 모델 구축

이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.

일차 및 불멸화 된 인간 각막 상피 세포에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 독성 결정

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

우리는 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 통해 심각한 각막 염증을 일으키는 쥐 모델을 개발했습니다. 이 연구는 염증 상태에서 각막 염증 패턴, 상피 증식 및 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다.

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

여기에서는 안와외 및 안와하부눈물샘을 절제하여 수성 결핍성 안구건조증의 마우스 모델을 확립하고 수성 결핍성 안구건조증에서 안구 표면의 변화를 평가하는 방법을 제시합니다.

수성 결핍성 안구건조증 Mouse Model 구축

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

장기 배양 돼지 각막 및 상피 상처 치유를 사용한 치료 및 화학적 독성 평가

OSTSS는 눈물막에 고입된 염증 매개체를 유도하여 후각 및 불편함과 같은 증상을 유발합니다. 본 연구에서는 2개월마다 실시한 비강경화 세척으로 후반증과 가려움증이 해소된 사례를 제시하여 OSTSS에 대한 치료적 중재로서의 효능을 제시한다. 또한, 3명의 추가 환자에서 주관적 증상 개선이 보고되었습니다.

안구 표면 독성 수프 증후군의 치료제로서의 Nasolacrimal Lavage

학습하세요 인공 눈물 제형이 건조에 노출된 인간 각막 상피 세포의 대사 활성을 보호하는지 평가하는 방법을. 이 기법은 건성안 증상 환자의 안구 보호에 도움이 되는 제형을 식별하는 데 활용됩니다.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

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