Name: 면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 면역형광법을 이용하여 TNBS 유도 크론병 마우스 결장에서 에스트로겐 수용체를 시각화하는 방법을. 이 기법은 파라핀 포매 조직에서 수용체 위치를 정확히 확인하여 대장염의 병태생리를 이해하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

작품은 로츠 당국의 재정 지원 덕분에 출판되었다: 과학 연구를위한 부총장, 국가 및 국제 협력을위한 부총장과 생물학 및 환경 보호 학부의 학장. 다미안 제이스닉은 폴란드 국립과학센터의 보조금(2017/24/T/NZ5/00045 및 2015/17/Nz5/00336)을 지원받았습니다.

동물 연구는 유럽 의회 및 2010년 9월 22일 이사회의 지침 2010/63/EU 및 제도적 권고에 따라 지역 윤리위원회(28/ŁB29/2016)의 동의하에 수행되었습니다.
1. 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델
참고 : 이 프로토콜은 25-28 g의 수컷 BALB / C 마우스를 사용합니다. 동물은 일정한 온도 (22-24 ° C)에 보관되고, 상대 습도 55 ± 5 %, 표준 차우 펠릿 및 수돗물 ad libitum에무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어두운 주기에서 유지됩니다.
<ol><li>마우스를 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이소플루란(25%2 O2+1.5-2L/min)으로 마우스를 짧게 마취시다.2 참고: 호흡률은 정상보다 리드미컬하고 느리게 유지되어야 하며 유해한 자극에 반응하여 변하지 않아야 합니다.</li>
	<li>0.9% NaCl에서 0.9% NaCl에서 30% 에탄올의 0.1 mL에 TNBS의 4 mg을 주입하거나 0.9% NaCl에서 0.1% 에탄올의 0.1 mL을 카테터를 통해 말단 결장으로 의한 비히클 제어로. 참고 : 카테터는 항문으로 약 3cm 조심스럽게 도입해야합니다.</li>
	<li>체중, 직장 출혈, 대변 일관성 및 사망률을 포함한 임상 매개 변수에 대해 2일째부터 8일까지 매일 마우스를 모니터링합니다.</li>
	<li>8 일째에 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg"> 그림 1: 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델에 대한 타임라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 결장의 분리 및 거시적 평가
참고: 결장 분리 하루 전에 인산완충염수(PBS) 1mL에 100 μL의 항생제를 희석하고 밤새 4°C에서 둡니다.
<ol><li>75% 에탄올과 멸균 거즈를 사용하여 복부에 피부를 청소하십시오.</li>
	<li>멸균 가위와 핀셋을 사용하여 가슴뼈에서 항문으로 복벽을 자른다.</li>
	<li>항문과 장모에 가능한 한 가까운 결장절단.</li>
	<li>페트리 접시에 결장합니다. 항문에서 대장을 장막 끝으로 잘라냅니다. 감기 항생제-PBS 용액으로 결장 2-4회 세척합니다.</li>
	<li>표 1에따라 캘리퍼스를 사용하여 거시적 평가를 수행합니다. 참고 : 조직 부착* 및 홍반 / 출혈#,대변 혈액# 및 설사# 시각적 평가의 대상이됩니다. * 조직 접착은 3 점 척도를 사용하여 평가 (0 : 조직 접착이없는 결장, 1 : 적당한 조직 접착이있는 결장, 2 : 광범위한 조직 접착이있는 결장); #부재 (0) 또는 존재 (1) 홍반 / 출혈, 대변 혈액과 설사에 따라.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>접착*</td>
			<td>홍반/ 출혈#</td>
			<td>대변 혈액#</td>
			<td>설사#</td>
			<td>궤양의 길이</td>
			<td>결장 두께</td>
			<td>결장 길이</td>
		</tr>
<tr>
<td>포인트 (0 – 2)</td>
			<td>포인트 (0 – 1)</td>
			<td>포인트 (0 – 1)</td>
			<td>포인트 (0 – 1)</td>
			<td>cm/포인트</td>
			<td>mm/포인트</td>
			<td>cm/포인트</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 – 결석</td>
			<td>0 – 결석</td>
			<td>0 – 결석</td>
			<td>0 – 결석</td>
			<td rowspan="3">0.5 cm = 0.5 포인트</td>
			<td rowspan="3">
n mm = n 포인트</td>
			<td>0 – &lt;10% 컨트롤보다 짧아</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – 보통</td>
			<td>1 – 현재</td>
			<td>1 – 현재</td>
			<td>0.5 – 약간/느슨한 대변</td>
			<td>1 – 컨트롤보다 10~20% 더 짧습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 – 현재</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 – 현재</td>
			<td>2 – 컨트롤보다 20% 이상 짧습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스의 장의 거시적 스코어링.
<ol start="6"><li>센티미터의 궤양의 길이를 점 척도, 즉 궤양의 0.5 cm마다 0.5 포인트로 계산됩니다. 대장의 두께를 밀리미터 단위로 점 눈금으로 변환합니다( 즉, 모든 nmm은 n포인트에 해당합니다).</li>
	<li>콜론의 길이를 3점 척도로 센티미터단위로 변환합니다. TNBS-유도 된 크론 병을 가진 각 마우스로부터 얻은 결장의 길이는 대조군에 대한 평균 결장 길이와 관련하여 평가된다(0: lt;10% 대조군보다 짧음, 1: 대조군보다 10~20% 더 짧음, 2: 20% 이상 짧아 제어)를 참조하십시오.</li>
	<li>방정식에 따라 총 거시 점수 계산: 총 거시 점수 = 접착력 (점) + 홍반/출혈 (점) + 대변 혈중 (점) + 설사 (점) + 궤양의 길이 (포인트) + 결장 두께 (포인트) + 결장 길이 (점).</li>
</ol>3. 결장 샘플 준비
<ol><li>결장 1-2cm 조각으로 잘라 적절하게 표지 조직 학적 카세트에 스폰지에 각각을 배치합니다. 참고: 조직학적 카세트용 스폰지는 액체 파라핀의 탈수 및 배양 중에 결장 접이식을 방지합니다.</li>
	<li>결장 단편을 포름알데히드 4% 에 놓고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.</li>
	<li>조직 프로세서를 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올, 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v) 및 자일렌만, 액체 파라핀에서 3시간 이상 인큐베이션할 때 1시간 동안 준비및 프로그래밍한다. 참고 : 탈수는 에탄올과 자일렌의 농도가 증가함에 따라 수행되어야하지만 에탄올의 농도는 수정 될 수 있습니다. 자일렌/에탄올 혼합물은 권장되지만 필수는 아닙니다.</li>
	<li>결장 단편을 조직학적 상자로 옮기고 미리 프로그래밍된 조직 프로세서에 놓습니다.</li>
	<li>티슈 프로세서를 실행합니다.</li>
	<li>배양 단계 후, 결장의 두 끝이 똑바로 놓이게 하고 금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채우게 되도록 결장 단편을 금속 몰드에 넣습니다.</li>
	<li>금형을 냉각 영역(-5°C)에 몇 초 동안 둔다음 금형을 온난화 영역(70°C)으로 옮니다. 조직학 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.</li>
	<li>냉각 영역에서 몇 분 동안 파라핀에 결장 조각과 금속 금형을 둡니다. 파라핀 블록에서 금속 몰드를 제거하고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.</li>
	<li>블록에서 여분의 파라핀을 제거하고 완전히 자동화 된 회전 마이크로 토메에 삽입합니다. 참고: 파라핀 블록은 이 단계 전에 -20°C에서 몇 분 동안 보관될 수 있다.</li>
	<li>결장 조각을 5 μm 섹션으로 자른다.</li>
	<li>결장 부분을 40°C로 예열된 수조로 옮김을 옮김.</li>
	<li>라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 부분을 제거합니다. 참고: 결장 섹션은 물에 떠 있습니다. 라벨이 붙은 유리 슬라이드를 결장 섹션 아래에 있는 물에 넣고 유리 슬라이드를 조심스럽게 철회합니다.</li>
	<li>실온에서 24 시간 동안 유리 슬라이드를 둡니다. 장기간 보관을 위해 실온에서 24시간 배양한 후 유리 슬라이드를 4°C로 유지하십시오.</li>
</ol>4. 면역형광 염색을 가진 면역성화학
참고: 수술 중 어떤 단계에서도 결장 부분을 건조시키지 마십시오.
<ol><li>자일렌에서 유리 슬라이드를 5분 동안 배양하여 파라핀을 제거합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드를 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v)에 5분 동안 놓습니다.</li>
	<li>결장 부위를 일련의 감소에 따라 수화, 즉 70%, 50%, 30% 및 10% 에탄올을 5분 동안 반복한다.</li>
	<li>흐르는 물에 유리 슬라이드를 5 분 동안 헹구십시오.</li>
	<li>예열 항원 회수 완충제(구연산 나트륨 10mM; 0.05% 트웬20, pH 6.0)를 95-98°C로 가열하고 10분 동안 끓는 항원 회수 용액으로 유리 슬라이드를 가열한다. 참고: 항원 검색 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 마스킹 해제 용액은 실험에 사용된 항체에 따라 최적화되어야 한다.</li>
	<li>소수성 펜을 사용하여 콜론 섹션 주위에 원을 그립니다. 참고: 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 소수성 펜은 액체를 원 내부에 작은 부피로 풀링하여 시약 낭비를 방지합니다.</li>
	<li>10 분 동안 수소 과산화효소의 3 % 물 용액으로 섹션을 배양하십시오.</li>
	<li>세척 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬 20)에서 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>차단 용액에서 배양 (5 % 일반 염소 혈청, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05 % 트리톤 X-100) 실온에서 1 시간 동안. 참고 : 차단 용액에서 정상적인 혈청은 이차 항체와 동일한 종에서 온 것이어야합니다. 배양이 필요한 단계에서 는 과도한 증발을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 습도 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>차단 용액을 제거하고 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100으로 1% 소 혈청 알부민으로 희석된 ERα, ERβ 또는 GPER에 대해 20-50 μL의 1차 항체를 첨가한다. 참고: 1차 항체의 권장 희석은 표 2에나와 있다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항체 유형</td>
			<td>반대 항체</td>
			<td>복제</td>
			<td>호스트 종</td>
			<td>종 반응성</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">기본</td>
			<td rowspan="4">ERα</td>
			<td rowspan="4">Polyclonal</td>
			<td rowspan="4">토끼</td>
			<td>인간의</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스</td>
		</tr>
<tr>
<td>거북이</td>
		</tr>
<tr>
<td>카피바라 주</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">ERβ</td>
			<td rowspan="6">Polyclonal</td>
			<td rowspan="6">토끼</td>
			<td>인간의</td>
		</tr>
<tr>
<td>원숭이</td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐</td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스</td>
		</tr>
<tr>
<td>양</td>
		</tr>
<tr>
<td>돼지</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">GPER</td>
			<td rowspan="3">Polyclonal</td>
			<td rowspan="3">토끼</td>
			<td>인간의</td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐</td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스</td>
		</tr>
<tr>
<td>보조</td>
			<td>다이라이트 650</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>염소</td>
			<td>토끼</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 항체의 특성.
<ol start="11"><li>어둠 속에서 4 °C에서 하룻밤 1 차 항체와 배양.</li>
	<li>항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척한다.</li>
	<li>1% 소 혈청 알부민에 희석된 DyLight 650 이차 항체 20-50 μL을 첨가합니다(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100 함유). 이차 항체와 배양염료와 결합 1 시간 어둠 속에서 실온에서. 참고: 이차 항체의 권장 희석은 표 2에나타내고 있다.</li>
	<li>항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl에서 희석 한 2 % DiOC6 (3)을 넣고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>용액을 제거하고 세척액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>콜론 섹션에 DAPI가 있는 글리세롤 기반 액체 몇 방울을 넣고 커버 슬라이드로 조심스럽게 덮습니다. 4 °C에서 적어도 24 시간 동안 결장 섹션을 배양합니다. 참고: 커버 슬라이드로 티슈를 덮을 때기포를 피하십시오.</li>
	<li>전용 소프트웨어를 사용하여 20배 또는 63배 의 목표와 오일 침수를 특징으로 하는 공초점 현미경으로 결장 섹션을 분석합니다. 참고: 표 3은 이 연구에 사용된 불소의 특성을 나열합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">플루오로홈 타입</td>
			<td colspan="2">파장 (nm)</td>
			<td rowspan="2">염료</td>
		</tr>
<tr>
<td>흥분</td>
			<td>방출</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>블루</td>
		</tr>
<tr>
<td>디OC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>녹색</td>
		</tr>
<tr>
<td>다이라이트 650</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>빨간색</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 불소의 특성.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된모델(15)을포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증상을 갖는다. 유도된 대장염을 가진 동물은 일관되지 않은 발판 대형, 피 묻은 설사 및 체중의 손실을 특징으로 합니다. 그러나, 이것은 이 모형이 CD 병인증을 독점적으로 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 의미하지 않습니다. TNBS 유도된 모형은 잠재적인 치료 검열을 위해, 예를 들면, 추천되고 일반적으로 이용됩니다. 화학적으로 유도된 대장염의 경우에 몇몇 중요한 점은 강조될 필요가 있습니다. TNBS는 점막 장벽을 방해하고 TNBS가 장 벽을 관통하고 고분자량 단백질과 상호 작용하도록 허용하는 에탄올...

크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이있다 1. 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해,장 염증의 여러 모델이2,3,43,5,56,7을사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.
에스트로겐은 만성 장 염증8,,9,10,,11,,12를변조 할 수 있다는 것이 문서화되었습니다.9 에스트로겐의 생물학적 활성은 핵 에스트로겐 수용체(ER), 즉 ERα(유전자 ESR1)및 ERβ(유전자 ESR2),G 단백질 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(유전자 GPER1)로지칭되는 핵 에스트로겐 수용체(ER)에 의해 매개된다.13,14 에스트로겐 수용체의 수준을 결정하는 몇 가지 방법이 있습니다, 하지만 몇 가지만 장에서 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
면역 조직화학(IHC)은 불소-컨쥬게이트 항체를 가진 세포 또는 조직에서 특정 항원검출을 위한 임상 및 기초 연구에서 널리 사용되는 방법이다. IHC는 대장염의 발달을 이해하는 것이 중요할 지도 모르다 특정 단백질의 식별 그리고 현지화에서 조직 구조 시각화에 있는 중요한 방법 일 것 같습니다. 여기에서, 우리는 면역형광을 사용하여 창자에 있는 에스트로겐 수용체의 면역성 화학적 시각화를 위한 완전하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C 마우스</td><td>University of Lodz</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>판지 블록</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>전자동 회전식 마이크로톰 - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>가열식 파라핀 임베딩 모듈 - EG1150</td><td>H Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>조직학 상자</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>실험실 저울</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>LAS X 소프트웨어</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metal mold</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>멸균 가위</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>멸균 핀셋</td><td>NA</td><td>NA 조직</td><td></td></tr><tr><td>프로세서 - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 2차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab96886</td><td></td></tr><tr><td>ER&alpha; 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta; 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Avantor 성능 재료 폴란드</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Avantor 성능 재료 폴란드</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>GPER 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Avantor Performance Materials 폴란드</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>수소 과산화효소</td><td>Avantor Performance Materials 폴란드</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란(구멍)</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Petrie dish</td><td>Nest Scientific</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>생리식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (항생제)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Chempur</td><td>WE/231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>아반토르 성능 재료 폴란드</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>아반토르 성능 재료 폴란드</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>아반토르 성능 재료 폴란드</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 형광을 사용하여 tnbs 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.

TNBS 유도 된 크론 병을 가진 마우스에 있는 결장의 거시적 특성 대조군 및 TNBS 처리 마우스로부터 채취한 결장의 대표적인 이미지는 도 2에나타내고 있다. 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스에서, 결장의 길이는 결장의 폭이 증가하는 동안 감소된다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig2a.jpg"> 도 2: 대조군 마우스(대조군) 및 TNBS 처리 마우스(TNBS)로부터 수득된 대표적인 결장. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig2large.jpg" target=...

이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

증가 증거는 생리학의 식민지 부분에 에스트로겐 신호의 영향을 제안, 면역 집중 화학결에 에스트로겐 수용체를 식별하기위한 유망한 기술이며 대장염으로 진화. 우리는 면역 형광을 사용하여 결장의 에스트로겐 수용체의 면역 히스토케토화학 시각화를위한 완전하고 검증 된 프로토콜을 제시합니다. 로츠 대학의 현미경 이미징 연구소의 실위아 Michlewska 박사와 함께, 우리는 절차를 시연 할 것입니다.결장은 페트리 접시에 놓습니다. 결장들을 1~2센티미터 의 조각으로 자른다. 적절하게 표시된 조직학적 카세트에 각 조각을 스폰지에 놓습니다.4%의 파라포름알데히드에 결장 파편이 들어 있는 카세트를 놓습니다. 섭씨 4도에서 최소 24시간 동안 배양하세요. 50%70%90%95%와 100%에탄올, 자일렌 100%에탄올, 자일렌만으로 1시간 동안 티슈 프로세서를 준비하고 프로그래밍할 뿐만 아니라 액체 파라핀에서 적어도 3시간 동안 배양할 수 있다.결장 조각을 조직상자로 옮는다. 미리 프로그래밍된 티슈 프로세서에 상자를 배치하고 프로세서를 실행합니다. 조직 프로세서에서 의배복 후 조직 상자에서 결장 제거 하 고 금속 금형에 결장 조각을 배치, 결장의 두 끝이 똑바로 위치에 있도록.금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채웁니다. 금형을 섭씨 영하 5도에서 몇 초 동안 그대로 두은 다음 금형을 섭씨 70도의 온난화 영역으로 옮습니다. 그런 다음 금형을 조직 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.콜론 파편과 파라핀을 함유한 금속 금형을 냉각 부위에 몇 분 간 배치합니다. 그런 다음 결장 과 파라핀 블록에서 금속 금형을 제거합니다. 섭씨 4도에서 적어도 24시간 동안 결장과 파라핀 블록을 배양합니다.인큐베이션 후 블록에서 과도한 파라핀을 제거합니다. 결장과 파라핀 블록을 완전히 자동화된 로터리 마이크로토메에 삽입합니다. 결장 조각을 5 마이크로미터 섹션으로 자른다.1개의 결장 구간을 수조로 옮기고, 예열된 섭씨 40도. 라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 섹션을 제거하고 실온에서 유리 슬라이드를 24시간 동안 배양합니다. 먼저, 5분 동안 자일렌에 유리 슬라이드를 배양하여 파라핀을 제거합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 자일렌과 100% 에탄올의 일대일 혼합물에 5분간 놓습니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.결장 섹션을 재수화하기 위해 감소 에탄올 농도의 시리즈를 사

visualization-estrogen-receptors-colons-mice-with-tnbs-induced-crohn

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 마우스 결장 조직의 면역조직화학적 염색을 통한 화학적 유발 대장염의 평가를 보여줍니다. 염색된 조직 절편에서 손상된 조직에 많은 수의 면역 반응 세포가 존재한다는 것은 대장염 중 면역 세포의 침투를 나타냅니다.

결장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통한 화학적 유발 대장염 평가

이 동영상은 형광 매개 단층촬영(FMT)을 사용하여 쥐 대장염 모델에서 장 대식세포 침투를 평가하는 기술을 보여줍니다. 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 통해 마우스에 대장염을 유발하면 대장에 침투한 대식세포의 F4/80 당단백질 마커를 인식하는 항체를 동물에게 주입합니다. 그런 다음 FMT 장치에서 마우스를 이미지화하여 형광 및 반사 신호를 3차원 이미지로 재구성하여 형광의 공간 분포와 강도를 결정합니다.

쥐 장 염증을 평가하기 위한 형광 매개 단층 촬영(Fluorescence-Mediated Tomography) 사용

작은 동물 이미징 기술은 직렬 진단 시험 및 생체 내에서 치료 적 개입을 허용한다. 최근, 응용 프로그램의 범위가 크게 확대하고 현재 대장 종양 발생의 평가, 상처 치유 및 염증의 모니터링이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 내시경 검사의 이러한 다양한 응용 가능성을 보여줍니다.

에 대한 쥐의 내시경 생체 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

이 항원 주도 대장염 모델에서는 적색 형광 단백질을 발현하는 OT-II CD4+ T 세포를 단핵 식세포(MP)에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 RAG-/- 마우스로 채택하여 전달했습니다. 숙주는 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 오브알부민 단백질(OVA)을 발현하는 대장균(E.coli)에 도전했습니다.

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

이 연구에서는, 우리는 Crohn의 섬유증에 비교병생리학을 전시하는 TNBS 중재장 섬유증의 상세한 절차를 기술합니다. 우리는 또한 라파마이신이 장 섬유증에 대한 억제 효과를 촉진에 비추어이 접근법을 논의합니다.

TNBS 중재장 섬유증의 발달에 기계론적 통찰력 과 라파마이신의 억제 효과 평가

본 프로토콜은 설치류에서 크론과 같은 대장염 모델의 개발을 설명합니다. 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서 협착으로 이어지고, 협착증에 근접한 세그먼트에서 기계적 확대가 관찰됩니다. 이러한 변화는 대장염의 기계적 스트레스를 연구 할 수있게합니다.

크론병에서 기계적 스트레스의 병원성 역할을 연구하는 TNBS 유도 설치류 모델

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

배우세요 면역형광법을 이용하여 TNBS 유도 크론병 마우스 결장에서 에스트로겐 수용체를 시각화하는 방법을. 이 기법은 파라핀 포매 조직에서 수용체 위치를 정확히 확인하여 대장염의 병태생리를 이해하는 데 활용됩니다.

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

더 많은 동영상 탐색