Name: 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 배우세요 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해와 산화 인산화의 실시간 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 정자 대사 연구와 생식 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 록펠러 높은 처리량 및 분광학 자원 센터에서 박사 라보이시에 라모스 -Espiritu의 지원을 인정하고자합니다.

정자는 8-16주령의 CD-1 수컷 마우스로부터 수집된다. 동물 실험은 웨일 코넬 의학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 분석 전날
<ol><li>
센서 카트리지 및 세포외 플럭스 분석기 교정기 준비
	<ol>
<li>센서 카트리지에 수분을 공급하려면 XFe96 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.</li>
		<li>다중 채널 파이펫을 사용하여 25 mL의 이중 증류 H2O로 용액 저장소를 채우고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 μL의 H2O를추가하십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 넣고 37°C비CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 참고: 카트리지는 최소 4시간 동안 수분을 공급해야 합니다.</li>
		<li>세포외 플럭스 분석기 교정제의 Aliquot 25 mL을 50 mL 원추형 튜브내로 교정하고 37°C비CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하였다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
코나 코팅 마이크로플레이트 의 준비
	<ol>
<li>2.5 mg의 ConA를 이중 증류H2O5mL에 용해하여 0.5 mg/mL(w/v) 스톡을 준비합니다.</li>
		<li>다중 채널 파이펫을 사용하여 0.5 mg/mL Con A 용액의 50 μL로 세포외 플럭스 분석기 96웰 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 뚜껑을 열어 놓고 접시를 실온에서 밤새 건조시키십시오. 참고: 여러 플레이트를 한 번에 코팅하고 4°C에서 최대 4주간 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정자 완충제의 준비
	<ol>
<li>138 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.7 mM CaCl2,1.2 mM KH2PO4,1.2 mM MgSO4,5.6 mM 포도당 및 1 mM HEPES를 포함하는 낮은 HEPES로 세포 외 플럭스 분석기 TYH 완충제 250 mL을 준비합니다. 완충액을 37°C로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분석의 날
<ol><li>카트리지 교정 준비
	<ol>
<li>유틸리티 플레이트의H2O를 웰당 200 μL의 XF 교정란트로 교체하고 비 CO2 37°C 인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 배양한다. 참고: 교정제 대신 멸균 여과 된 PBS, pH 7.4를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>37°C에서 TYH 완충액 50 mL를 가열합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포외 플럭스 분석기를 위한 웨이브 템플릿 생성
	<ol>
<li>세포외 플럭스 분석기를 켜고 온도가 37°C로 안정화되도록 합니다.</li>
		<li>웨이브 소프트웨어를 열고 빈 템플릿을 열어 새 템플릿을 디자인합니다(보조 파일 1,웨이브 템플릿 참조).</li>
		<li>그룹 정의 탭을 엽니다. pH 7.4 및 마우스 정자로 세포 유형, 주사 전략 및 전처리 빈 두고. 각 분석 조건에 대해 다른 그룹을 만듭니다. 이 예제에서는 6개의 다른 그룹(TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, 개미/부패, 개미/부패 + db-cAMP/IBMX)이 있습니다. 디부티릴 cAMP(db-cAMP) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX)은 글리콜분해 억제제로서, 2-디옥시글루스(2-DG)를 유도하며, 항마이신 A(antA) 및 로테네(rot)는 전자 수송 사슬의 복합III 및 복합I의 억제제로 한다. 참고: 웰 간의 가변성을 고려하려면 조건당 최소 7-8개의 웰을 병렬로 측정해야 합니다.</li>
		<li>플레이트 맵 탭을 열고 특정 웰에 그룹을 할당하여 플레이트 맵을 정의합니다. 참고 : 네 개의 코너 웰 (A1, A12, H1, H12)은 TYH 버퍼 (정자 없음)로 채워지고 나중에 배경 빼기위해 사용됩니다.</li>
		<li>프로토콜 탭을 열고 4개의 다른 측정 주기를 추가하고, 각각의 포트를 선택하고 측정 세부 사항을 편집합니다(그림2, 표 1). 주입 후 측정을 강조하고 평형을강조 표시하지 않습니다.</li>
		<li>분석 템플릿을 저장하고 프로젝트 요약을 작성하고 결과 파일의 저장 위치를 정의합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>센서 카트리지에 로드할 화합물 준비
	<ol>
<li>TYH 완충액에서 9.8 mg의 화합물을 용해시킴으로써 50 mM db-cAMP의 2 mL를 준비하고 IBMX를 5 mM의 최종 농도에 추가합니다. 참고: IBMX는 TYH 버퍼에서 희석된 후 침전되는 경향이 있습니다. 침전제는 37°C 열 블록에서 5분 동안 TYH/db-cAMP/IBMX 용액을 와류 및 인큐베이팅하여 용해될 수 있다.</li>
		<li>TYH 완충액에서 82.1 mg의 화합물을 용해시킴으로써 500 mM 2-DG의 1 mL을 준비한다.</li>
		<li>TYH 완충제에서 두 약물을 모두 희석하여 AntA/Rot의 5 μM 의 1 mL을 준비합니다. 참고 : 화합물은 세포 외 플럭스 분석기 카트리지에 주입하여 10 배 희석됩니다. 따라서 사출 솔루션이 10배 더 집중되어 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 정자의 격리
	<ol>
<li>이소플루란에 의해 8 및 16주 사이에 3명의 수컷 마우스를 마취시키고 발가락 꼬집기에 대한 반응이 검출된 후 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 희생시켰다. 카우다 부고디미드와 바사 deferentia를 제거합니다.</li>
		<li>각 카우다를 500 μL의 미리 온난한 TYH 완충재를 24웰 플레이트에 잘 놓고, 한 쌍의 집게를 사용하여 플레이트 바닥에 카우다를 고정시키고 깃털 가위로 5-7개의 작은 절개를 하여 조직을 엽니다.</li>
		<li>플레이트를 즉시 비CO2 37°C 인큐베이터로 옮기고 정자가 15분 동안 분산시키게 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>센서 카트리지 로딩
	<ol>
<li>세포외 플럭스 키트에는 포트 A및 D 및 포트 B 및 C용 두 개의 포트 로딩 가이드가 제공됩니다. 특정 포트를 로드하는 경우 센서 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 각 포트 로딩 가이드의 문자를 카트리지의 왼쪽 위 모서리에 맞춥니다. 주입하는 동안 비주입 손의 손끝을 사용하여 포트 로딩 가이드를 제자리에 고정하고 파이펫 팁을 포트 로딩 가이드 구멍에 수직으로 삽입합니다.</li>
		<li>포트 A: 다중 채널 파이펫을 사용하여 TYH 버퍼의 20 μL을 모든 열에 주입합니다.</li>
		<li>포트 B: TYH 완충액 22 μL을 컬럼 1-4에 주입하고, 500 mM 2-DG의 22 μL을 컬럼 5-8에 주입하고, 5 μM AntA/Rot의 25 μL을 컬럼 9-12에 주입합니다.</li>
		<li>포트 C: 25 μL의 TYH 버퍼를 홀수로 모든 열에 주입하고, 짝수로 모든 열에 10mM db-cAMP/500 μM IBMX의 25 μL을 주입합니다.</li>
		<li>교정 플레이트가 있는 센서 카트리지를 세포외 플럭스 분석기에 넣고 분석을 시작합니다. 교정은 10 - 15 분 이 소요됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정자 판의 준비
	<ol>
<li>TYH 완충액 15 mL(3 mg/mL w/v)에 BSA 45 mg을 용해하고 5 mL 원심분리기 튜브에 각각 3mL BSA/TYH 용액3개의 aliquots를 준비합니다.</li>
		<li>1.5 mL 원심 분리튜브에 각각 2개의 정자를 결합하고, 혈세포계를 사용하여 정자를 계산하고 정자를 2 x 107 정자/mL의 농도로 희석시다. 참고: 세포손상을 방지하기 위해 정자를 파이펫팅하기 위해 절단 파이펫 팁을 사용하십시오.</li>
		<li>700 x g에서3 분 동안 정자를 원심 분리하고 상류를 제거하고 TYH 완충액 1 mL을 추가하십시오. 원심 분리 단계를 반복하고 상복부를 제거하고 각 정자 현탁액을 BSA / TYH 3 mL로 5 mL 원심 분리튜브 1 개에 옮긴다.</li>
		<li>180 μL의 TYH 버퍼를 각 구석웰(A1, A12, H1, H1, H12)에 코나 코팅 플레이트의 잘 놓습니다. 180 μL의 정자 현탁액을 ConA 코팅 플레이트의 각 빈 우물에 넣습니다 (1.2 x 106 정자 / 우물).</li>
		<li>정자 판을 250 x g에서 1 분 동안 원심 분리하고 플레이트를 180 °로 회전시키고 원심 분리기를 250 x g에서 1 분 (가장 낮은 제동 속도 1)으로 다시 원심 분리합니다.</li>
		<li>세포외 플럭스 분석기에서 교정 플레이트를 제거하고 정자 플레이트를 추가합니다. 분석을 계속합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 추출 및 분석
	<ol>
<li>분석 을 완료 한 후, 카트리지를 제거, 결과 파일을 열고, 내보내기 탭을 클릭하고 그래프 패드 프리즘 파일로 완료 된 실행을 내보내기(보충 파일 2: 그림 3에사용되는 기본 예제 데이터).</li>
		<li>새 탭을 클릭한 다음 중복 패밀리... 탭(그림3A)을클릭하여 ECAR 및 OCR 파일을 복제합니다.</li>
		<li>데이터의 처음 7행을삭제합니다(그림 3B).</li>
		<li>기준선 빼기 행 1에 의해 cAMP/IBMX 주입 전에 데이터 포인트로 정규화합니다. 분석 탭을 클릭한 다음 기준선 및 열 수학 제거 탭에서 선택된 행 강조 표시: 첫 번째 행, 계산: 비율:값/기준선및 하위 열: 하위 열 무시. 확인을 클릭합니다(그림3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

특정 신진 대사 기질 또는 중요한 신진 대사 효소의 부재에 있는 정액 capacitation의 손실은 성공적인 풍부하게 함을 지원하는 중요한 요인으로 에너지 물질 대사를 밝혔습니다. 세포 활성화 도중 신진 대사 스위치는 그밖 세포 모형에 있는 잘 확립된 개념입니다, 그러나, 우리는 정액이 capacitation 도중 증가하는 에너지 수요에 그들의 물질 대사를 적응하는 방법을 이해하기 시작했습니다. 세포외 플럭스 분석기를 사용하여, 우리는 정자 capacitation 도중 실시간으로 글리코용해 및 산화 인산화에 있는 변경을 감시하기 위하여 쉽게 적용 가능한 공구를 개발했습니다. 센서 프로브에 고정된 형광단을 사용하여 세포외H+와 O2의 변화를 감지하는 것은 최소 침습적이며, 4개의 개별적으로 작동된 주입 포트는 용량 화 과정 전이나 동안 별개의 시점에서 약리학적 억제제 또는 활성제와 함께 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 정자 용량 실험의 한 가지 예만 제공합니다. 결과의 해석을 단...

질량 분석법의 적용은 신진 대사의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 표적 대사 프로파일링 및 대사체 추적을 통해 에너지 대사 의 변화를 정밀하게 모니터링할 수 있습니다. 그러나 대사체학을 성공적으로 수행하려면 광범위한 교육, 숙련된 직원, 고가의 고감도 질량 분석기가 모든 실험실에서 쉽게 구할 수 없습니다. 최근에는 해마 XFe96과 같은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 다양한 세포 유형1,2,3,4,5에서에너지 대사의 변화를 측정하는 대리 방법으로 인기를 끌고 있다.
정자는 고도로 전문화된 운동성 세포입니다; 그의 임무는 난모세포에 친자 게놈을 전달하는 것입니다. 사정 후 남성 생식 기관을 떠나는 정자는 여전히 기능적으로 미숙하며 난모세포의 조끼를 관통할 수 없기 때문에 난모세포를 비옥하게 할 수 없습니다. 정자는충혈6,7로알려진 성숙 과정에서 여성 생식기관을 통과하면서 수정 능력을 습득한다. 갓 사정된 정자 또는 고다 부고환에서 해부된 정자는Ca2+및 중탄산염(HCO3-)또는 세포 투과성 cAMP 아날로그(예를 들어, dibutyryl-cAMP), 콜레스테롤 수용자 (예를 들어, 소 혈청 알부민, BSA), 및 에너지 원 (예를 들어, 포도당). capacitation 도중, 정액은 과활성화8,9에게불린 수영 모드를 나타내는 비대칭 편모 박동으로 그들의 운동성 패턴을 수정하고, 그(것)들은 곡예 반응7을겪을 수 있는 유능한 되고, 여기서 proteolytic 효소는 oocytes의 조끼를 소화하는 풀어 놓입니다. 이러한 과정은 에너지를 필요로 하고, 체세포와 유사하게, 정자는 당해용해뿐만 아니라 미토콘드리아 TCA 주기 및 산화 인산화(oxphoylation)10을통해 ATP 및 기타 고에너지 화합물을 생성한다. 여러 연구는 당해가 정자 capacitation11,12,13,14를지원하기에 필요하고 충분하다는 것을 입증하는 동안, 옥스포스의 기여는 덜 분명하다. 글리콜리시스가 TCA 주기에 물리적으로 결합되는 다른 세포 유형과는 달리, 정자는 고도로 구획화되고 별도의 편모 구획에서 이러한 과정을 유지하는 것으로 생각됩니다: 미드피스는 미토콘드리아 기계를 농축하는 반면, 글리콜리시스의 주요 효소는 주요 조각15,16으로제한되는 것으로 보입니다. 이러한 구획화는 글리코분해에 의해 주체에서 생산된 피루브산이 미드피스에서 미토콘드리아 옥스포스를 지원할 수 있는지, 그리고 미드피스에서 옥스포스에 의해 생성된 ATP가 주체17,18, 19의원단 부분에서 에너지 요구 사항을 지원하기 위해 깃넬럼의 길이를 따라 충분히 빠르게 확산될 수 있는지에 대한 지속적인 논쟁을 낳는다. 또한 정자 capacitation에 oxphos에 대 한 역할의 지원이 있다. 옥스포스는 글리콜리시스보다 16배 더 많은 ATP를 생성할 뿐만 아니라, 중간 체량과 미토콘드리아 함량은 포유류 종의 생식 적합성과 직접적으로 상관관계가 있으며, 이는짝20의경우 남성간의 경쟁이 더 치열합니다. 이 질문을 해결하는 것은 정액 capacitation 도중 glycolysis와 oxphos의 상대적인 기여를 검토하기 위한 방법을 요구합니다.
Tourmente 등은 24웰 세포외 플럭스 분석기를 적용하여 현저히 다른 정자 성능파라미터(21)와밀접하게 관련된 마우스 종의 에너지 대사를 비교한다. 비 정전 용량 정자의 기저 ECAR 및 OCR 값을보고하는 대신, 여기에서, 우리는 실시간으로 마우스 정자 capacitation 동안 에너지 대사의 변화를 모니터링하기 위해 96 잘 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 자신의 방법을 적응. 산소(O2)와 양성자(H+)의 유속을 측정하여 최대 12개의 다른 실험 조건에서 기모를 이겨내며정자에서 글리코용해와 옥스포스를 실시간으로 모니터링할 수 있는 방법을 개발하였다(그림1A). Glycolysis 동안 젖산질화에 대한 피루브산염의 고장으로 인해 TCA 사이클을 통해CO2의 생산, 비-커패시테이트 및 정전 용량 정자 돌출 H+는 H+민감한 형광을 통해 세포 외 플럭스 분석기에 의해 검출되는 분석 매체내로 센서 카트리지의 프로브 팁에 고정된다. 병행하여, 산화인산화에 의한O2 소비는 동일한 프로브 팁에 고정화된O2-민감성형광체를 통해 검출된다(도1B). 방출된H+와 소비된O2의 효과적인 검출은 중탄산염 또는 페놀 적색 없이 낮은 완충 용량을 가진 수정된 정자 완충을 필요로 한다. 따라서, 중탄산염의 부재에서 의 한축을 유도하기 위해, 우리는 광범위 PDE 억제제 IBMX22와함께 주입된 세포 투과성 cAMP 아날로그의 사용을 채택했다. 3개의 추가 독립적인 주입 포트는 약리활성제 및/또는 억제제를 주입할 수 있게 해주며, 이를 통해 실험 조작으로 인한 세포 호흡 및 당해 비율의 변화를 실시간으로 감지할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td> 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; DMSO(111.1 mg/ml)에서 500 mM 원액을 준비하고 작은 부분 표본에 보관</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>안타; DMSO(2.7mg/ml)에서 5mM 원액을 준비하고</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>콘카나칼린 A, 아라키스 하이포게아 (땅콩)의 렉틴</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>L7381</td><td>ConA</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마 -알드리치</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>이소 thesia</td><td>헨리 샤인 동물 건강</td><td>1169567761</td><td>이소 플루란</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O- 디 부티 릴라 데노신 3 ', 5'- 고리 형 일 인산 나트륨 염</td><td>시그마 -알드리치</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>시그마 -알드리치</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>인산이수소</td>칼륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; DMSO (2mg/ml)에 5 mM 원액을 준비하고 작은 부분 표본에 보관</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Equipment 및 재료 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 채널 피펫 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>12채널 피펫 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, non-CO2 인큐베이터</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>5 mL cetrifuge tube</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>플레이트가 있는 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>40X 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr> OctaPool 솔루션 리저버가 있는 도립 위상차 현미경<tr><td>, 25 ml, 분리형</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool 솔루션 리저버, 25 mL,</td><td>분할 Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 분석기</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>XFe96 FluxPak mini(102601-100)로 판매되며 18캐럿 대신 6캐럿이 있습니다.</td></tr></tbody></table>

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

포유류 정자는 capacitation로 알려져 있는 프로세스에 있는 여성 생식 기관에 있는 풍부하게 함 용량을 취득합니다. 정전 관련 공정에는 에너지가 필요합니다. 정자 진보적 인 운동성 연료 ATP를 생성하는 소스에 대한 지속적인 논쟁이 남아있다, 용량, 과소 활성화, 및 곡예 반응. 여기에서, 우리는 마우스 정액 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 분석하는 공구로 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다. H+및O2- 민감한 형광을 사용하여, 이 방법은 비 커패시타이드 대 정전 용량 정자에서 실시간으로 글리코용및 산화 인산화를 모니터링할 수 있게 합니다. 다른 에너지 기판 및 /또는 약리 활성제 및 / 또는 억제제의 존재에서이 분석법을 사용하여 다른 대사 경로의 기여와 정자 capacitation 동안 신호 캐스케이드와 신진 대사 사이의 교차점에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

이 방법은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 당해 및 옥스포스 의 비율의 실시간 변화를 모니터링합니다. 도 4는 정자가 유일한 에너지 기판으로서 포도당의 존재에서 정전되었고 2-DG 및 항마이신 및 로테인을 약리학적 변조기로서 가꾸어낸 예시적인 실험을 나타낸다. 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 및 약리학적 변조기 내의 에너지 기질은 실험의 목표에 따라 자유롭게 선택될 수 있다. BSA/TYH에 있는 비 정전 용량 마우스 정액은 그들의 머리를 통해 ConA 코팅된 과도 마이크로 챔버의 바닥에 부착되었습니다. 이 예에서, 검출된 모든 웰 들 사이의 평균 기저 ECAR 및 OCR 값은 각각 12.76±2.75 mpH/min 및 23.64±2.78 pmol/min이었다.
TYH 완충액을 가진 모의...

우리는 마우스 정자 capacitation 도중 당해 및 산화 인산화에 있는 실시간 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

이 프로토콜은 정자 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 것을 이용될 수 있습니다. 우리는 비 커패시케이트와 커패시케이트 마우스 정자 사이 실시간으로 글리코리시스와 산화 인산화의 변화를 비교하기 위하여 이 프로토콜을 개발했습니다. 분석 전날, 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.25밀리리터의 이중 증류수로 용액 저장소를 채우고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 물을 추가한 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 다음으로, 외세포 플럭스 분석기의 25 밀리리터를 50밀리리터 원추형 튜브로 보정하고 튜브를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.ConA 코팅 마이크로 플레이트를 준비하려면 2.5 밀리그램의 ConA를 이중 증류수 5밀리리터에 녹이고 멀티채널 파이펫을 사용하여 ConA 용액의 50마이크로리터가 있는 세포외 플럭스 분석기 96웰 플레이트의 각 우물을 채운 다음 뚜껑을 열어 밤새 접시가 건조하게 합니다. 정자 버퍼를 준비하려면 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 250 밀리리터를 섭씨 37도로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다. 분석 당일, 유틸리티 플레이트의 각 우물의 물을 우물당 200 마이크로리터XF 교정기로 교체하고 플레이트를 비이산화탄소 인큐베이터에 1시간 이상 다시 배치한다.웨이브 템플릿을 생성하려면 세포외 플럭스 분석기를 켭니다. 온도가 섭씨 37도로 안정화되는 동안 웨이브 소프트웨어를 열고 빈 템플릿을 엽니다. 그룹 정의 탭에서, 분석 매체를 TYH및 세포 유형을 마우스 정자로 정의하여 주사 전략과 전처리를 비워 둡시킵니다.각 분석 조건에 대해 서로 다른 그룹을 만들고 플레이트 맵을 열어 각 그룹을 특정 우물에 할당합니다. 프로토콜 탭에서, 강조 표시 해제 평형, 네 가지 측정 주기의 각각을 추가, 각 포트를 선택하고 주사 후 측정이 강조되도록 측정 세부 사항을 편집, 다음 분석 템플릿을 저장, 프로젝트 요약을 작성하고 결과를 저장합니다. 정자를 수확하기 전에, 37 섭씨에서 TYH 버퍼의 50 밀리리터를 예동.성인 수컷 마우스로부터 코다를 수확한 후, 각 카우다를 24웰 플레이트의 개별 우물에 미리 데운 TYH 버퍼500 마이크로리터에 놓습니다. 각 우물의 바닥에 개별적으로 각 카우다를 고정하고 신속하게 깃털 가위를 사용하여 각 조직에 5 ~ 7 개의 작은 절개를 만들기 위해 집게를 사용합니다. 모든 소다절이 되면 즉시 플레이트를 비 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 정자가 15 분 동안 분산되도록하십시오.센서 카트리지를 로드하려면 센서 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 각 포트 로딩 가이드의 문자를 카트리지의 왼쪽 상단 모서리에 정렬합니다. 포트 로딩 가이드를 제자리에 놓고 파이펫 팁을 포트 A의 포트 로딩 가이드 구멍에 수직으로 삽입하고 모든 열에 20 마이크로리터의 TYH 버퍼를 삽입합니다. 포트 B의 경우, 1~4개의 탄열에 TYH 버퍼 22개, 500밀리머 2-데옥시글루의 22마이크로리터를 5~8개의 컬럼에 주입하고, 5개의 마이크로몰라 항마이신 A 로테네톤 25마이크로리터를 9내지 12개의 열로 삽입한다.포트 C의 경우, 홀수 번호로 모든 열에 25 마이크로리터를 주입하고 디부티릴-사이클 AMP 500 마이크로몰라 IBMX의 10 밀리리터를 모든 열에 삽입한 다음 교정 플레이트가 있는 센서 카트리지를 여분의 세포 형플럭스 분석기에 넣고 분석을 시작합니다. 교정에는 10~15분이 소요됩니다. 정자 플레이트를 준비하려면, 3 개의 5 밀리 리터 원심 분리 튜브의 각각에 TYH 버퍼에 밀리리터 소 혈청 알부민 당 3 밀리리터를 추가합니다.다음으로, 3개의 1.5 밀리리터 원심분리기 관의 각으로 정액의 2개의 우물을 풀. 계산 후, 소 혈청 알부민으로 보충 신선한 TYH에서 샘플 당 밀리리터 농도 당 7 개의 정자에 2 번 10으로 정자를 희석. 원심분리에 의한 정자를 퇴적시키고 TYH 완충제의 1밀리리터에서 정자 펠릿을 재중단한다.정자를 다시 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않도록주의하는 슈퍼 나티츠를 제거하십시오. 각 정자 현탁액을 준비된 5밀리리터 원심분리기 튜브 중 하나로 옮기고 ConA 코팅 플레이트의 각 구석 우물에 180 마이크로리터의 TYH 버퍼를 추가합니다. 180 마이크로리터의 정자를 ConA 코팅 플레이트의 각 빈 우물에 넣고 원심 분리 사이에 플레이트를 180도 회전하는 플레이트를 두 번 원심 분리한 다음 정자 판으로 교정 플레이트를 놓고 분석작업을 계속합니다.이 대표적인 실험에서, 정자는 약리학적 변조기로서 유일한 에너지 기판및 2-deoxyglucose 및 항마이신 및 로테네온으로서 포도당의 존재에서 커패시핑되었다. 화살표는 capacitation의 유도를 나타냅니다. 포도당의 존재에서, capacitation는 2-deoxyglucose와 글리코리시스를 차단하여 억제되는 세포외 산성화 비율에 있는 7 배 증가를 동반했습니다.정전 식 정자는 마우스 정자가 캐포라송 중 증가하는 에너지 수요를 지원하기 위해 글리코리시스와 산화 인산화를 모두 향상시킨다는 것을 보여주는 비 커패시티드 정자에 비해 산소 소비율이 20배 증가하는 것을 입증했습니다. 정자 캐포터절 중 세포외 산성화율의 상승은 산화 인산화 억제제 인미신 A 및 로테네네에 의해 영향을 받지 않으며, 이 비율의 변화는 주로 글리코리시스로부터의 수소 방출에 의해 구동된다는 것을 나타낸다. 산소 소비율의 증가는, 그러나, 항마이신 A와 로테논뿐만 아니라 2-deoxyglucose에 의해 차단되는 것은 정자 capacitation 도중 OXPHOS의 증가가 글리코리스틱 활동에 달려 있다는 것을 드러내는.에너지원 및 약리학적 활성제 및 억제제는 실험의 목표에 따라 다양할 수 있으며 최대 12개의 상이한 조건을 병렬로 측정할 수 있다. 프로토콜은 쉽게 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경이 동등하게 수수께끼인 인간 또는 소 같이 그밖 종에 적응할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

모든 세포 유형에 대한 단백질체 분석은 액체 크로마토그래피 질량 분석법(MS) 전에 시료의 복잡성을 줄이기 위해 출발 물질의 순도와 사전 분획에 크게 의존합니다. 역 세척 기술을 사용하면 설치류에서 순수한 정자를 얻을 수 있습니다. 분해 후 인산펩티드는 TiO2를 사용하여 농축할 수 있습니다.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

해당작용은 여러 생물학적 시스템에서 정의하는 대사 마커입니다. H+의 세포외 플럭스를 측정하여 해당과정을 모니터링하는 것은 일반적이지만, 정량적이고 명확한 보정이 필요합니다. 여기에서는 세포 외 산성화의 호흡기 및 해당작용 원인을 구별하기 위해 세포 외 플럭스 데이터를 수집하고 수정하는 방법을 보여줍니다.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

고분해능 호흡 측정법에 의한 정자 미토콘드리아 기능 분석은 밀폐 챔버 시스템에서 자유롭게 움직이는 정자의 산소 소비량을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 정자 미토콘드리아 특성 및 무결성에 대한 정보를 제공하는 인간 정자의 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

여기에 설명된 AcroSensE 마우스 모델 및 살아있는 세포 이미징 방법은 정자 아크로솜의 세포 내 구획에서 칼슘 역학을 연구하고 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.

실시간 이미징 of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

이 프로토콜은 1차 마우스 미세아교세포에서 대사 재프로그래밍을 정량화하기 위해 해당분해 스트레스 검사를 비용 효율적으로 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 및 염증 자극 후, 신선하게 준비된 pH 조정 시약을 사용해 세포외산성화 속도(ECAR)를 측정한 후, 단백질 정규화를 통해 당해질 변화를 정확하고 재현 가능하게 평가합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 1차 미세아교세포의 당화 연구

배우세요 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해와 산화 인산화의 실시간 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 정자 대사 연구와 생식 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

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