Name: In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 자가 혈소판 풍부 혈장을 이용한 인간 섬유아세포 배양 및 확장 방법입니다. 이 표준화된 5분 준비 프로토콜은 재생의학 연구에서 안전하고 효과적인 자가 세포 치료를 가능하게 합니다.

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유세포 분석 데이터에 대한 기술 지원을 해주신 Grégory Schneiter씨에게 감사드립니다. Muriel Cuendet 교수(약리학 실험실, 약학부 및 제네바 대학교)는 Attune 유세포 분석기 및 Cytation 3 고처리량 현미경의 사용을 허용했습니다. Brigitte Pittet 교수에게 과학적 조언을 제공합니다.

연구 프로토콜은 헬싱키 선언을 준수했으며 모든 환자는 연구에 참여하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 피부 샘플은 제네바 대학 병원 (스위스 제네바)의 성형, 재건 및 미용 외과에서 복부 성형술을받는 건강한 여성에게서 얻습니다. 이 절차는 헬싱키 선언의 원칙을 준수하며 지역 기관 윤리 위원회(프로토콜 #3126)의 승인을 받았습니다.
1. PRP의 제조
알림: CuteCell-PRP 튜브(재료 표)는 폐쇄 회로 시스템에서 소량의 환자 혈액에서 PRP를 신속하게 준비하도록 설계되었습니다.
<ol><li>전혈 수집 참고: 의료기관의 채취 프로토콜에 따라 PRP 튜브에 직접 연결된 나비 바늘을 사용하여 팔의 말초 정맥에서 자가 혈액을 채취합니다. 환자가 마취 상태인 경우 정맥 캐뉼라를 통해 혈액을 직접 빼낼 수 있습니다.<ol><li>튜브 블리스터 팩을 엽니다. 정맥 천자를 수행하고 원하는 수의 PRP 튜브를 전혈로 채 웁니다. 튜브 내부의 진공을 통해 필요한 양의 혈액(~10mL)을 자동으로 수집할 수 있습니다.</li>
		<li>조심스럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 뒤집어 혈액과 항응고제를 섞습니다.</li>
		<li>생물 안전 캐비닛(클래스 2) 내부에서 추가 혈구 수 계산을 위해 1mL 주사기를 사용하여 총 전혈 100μL를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>원심 분리 알림: 원심분리기를 시작하기 전에 원심분리기의 균형이 올바르게 맞는지 확인하십시오.<ol><li>PRP 튜브에 혈액을 채취한 후 필요에 따라 PRP 튜브의 혈액과 동일한 수준의 물이 담긴 평형 튜브(별도 공급)를 준비합니다. 채워진 튜브를 원심분리기에 서로 마주보고 놓고 기계의 균형을 맞춥니다.</li>
		<li>1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리기 시료 알림: 원심분리기 제조업체의 지침에 따라 해당 rpm 속도를 설정하십시오. 원심 분리 후 혈액이 분획됩니다. 적혈구와 백혈구는 젤 아래에 갇히고 혈소판은 젤 표면에 침전됩니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
	<li>PRP 튜브를 20배 부드럽게 뒤집어 혈장 상층액에 혈소판 침착물을 재현탁시킵니다. 알림: 혈소판이 젤에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오. 플라즈마는 투명하고 투명한 것에서 탁한 것으로 변해야합니다. 혈소판 응집체가 존재하면 혈장과 함께 수집해야합니다.</li>
	<li>PRP를 수집하려면 10mL 주사기에 연결된 주사기 이송 장치를 사용하여 튜브에서 플라즈마 용액을 채취합니다. 참고: 각 튜브에서 약 5mL의 PRP를 얻을 수 있습니다. 이제 PRP 용액을 최종 배지 준비에서 혼합할 준비가 되었습니다. 이 용액은 혈액학 분석기 및 사용과 관련된 향후 단계까지 안전 캐비닛 아래 실온(RT)에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>PRP를 사용하기 전에 자동 혈액학 분석기(표 자료)를 사용하여 혈소판 농도, 평균 혈소판 부피, 적혈구 및 백혈구 수를 결정합니다. 이렇게 하려면 용액 100μL를 조심스럽게 빼내고 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 참고: PRP는 5–20% v/v 사이의 농도에서 자가 배양 보충제로 사용됩니다. PRP의 최적 농도는 각 세포주에 대해 결정되어야 합니다. 피브린 응고 형성을 방지하기 위해 최종 배양 배지에 2U/mL 헤파린을 보충해야 합니다.</li>
</ol>2. FBS 또는 PRP 보충 배지에서 자가 섬유아세포 분리 및 배양
<ol><li>50mL 폴리프로필렌 튜브에서 부드럽게 흔들어 인산염 완충 식염수(PBS)로 피부 샘플을 세척합니다.</li>
	<li>피부 샘플이 비교적 큰 경우(>10 cm2), 샘플을 150cm2 조직 배양 접시(표피면이 아래로)의 뚜껑에 놓습니다. 집게와 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하십시오. 조직이 마르지 않도록 PBS에서 몇 분마다 조직을 헹굽니다. 참고: 더 작은 샘플에는 더 작은 조직 배양 접시를 사용하십시오.</li>
	<li>지방 다듬기가 완료되면 멸균 메스를 사용하여 조직을 약 0.5cm x 1.5cm 스트립으로 자릅니다.</li>
	<li>멸균된 15mL 튜브에 5mL의 콜라게나제-디스파아제 혼합물(재료 표; 14 Wünsch units/mL)을 추가합니다.</li>
	<li>절단된 조직을 튜브로 옮겨 조직 조각이 용액에 잠기도록 합니다. 튜브를 단단히 닫으십시오.</li>
	<li>튜브를 37°C의 인큐베이터에 넣고 150분 동안 궤도 진탕합니다. 배양 후 조직이 들어 있는 튜브를 생물안전 캐비닛에 넣습니다.</li>
	<li>멸균된 100mm 배양 접시의 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 놓습니다. 소화된 조직 용액을 튀지 않고 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다. 튜브에 조직 조각이 남아 있는 경우 멸균 1mL 피펫 또는 멸균 집게를 사용하여 조직 조각을 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다.</li>
	<li>표피 스트립이 위를 향하게 한 상태에서 두 쌍의 집게를 사용하여 손상되지 않은 표피 시트를 진피에서 분리합니다. 한 쌍의 집게로 조직 스트립의 진피를 잡고 다른 한 쌍의 집게로 표피의 가장자리를 잡습니다. 진피와 표피를 두 조각으로 떼어 내고 분리 된 조각을 같은 뚜껑에 보관하십시오. 이 단계를 신속하게 수행하고 각 조직 조각에 대해 조작을 반복하십시오.</li>
	<li>PBS가 들어 있는 새로운 100mm 배양 접시에 진피 조각을 옮깁니다.</li>
	<li>실험실 집게를 사용하여 3mL의 0.3% 트립신/PBS가 있는 15mL 폴리프로필렌 튜브에 진피 조각을 넣습니다. 37°C 수조에서 10-20분 동안 배양하고 2-3분마다 튜브를 여러 번 뒤집습니다.</li>
	<li>효소 반응을 중지하려면 3-5mL의 얼음처럼 차가운 완전 성장 배지(Dulbecco's modified Eagle 배지[DMEM] 또는 10% FBS를 함유한 RPMI)를 추가합니다. 튜브를 여러 번 격렬하게 소용돌이칩니다. 섬유아세포 현탁액을 85μm 나일론 메쉬(50mL 튜브 상단에 배치)를 통해 여과하여 진피 파편을 제거합니다.</li>
	<li>150 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 100-1,000 μL의 완전한 성장 배지에 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액과 혼합된 트립판 블루(x2의 희석 인자)를 사용하여 혈구계의 챔버를 채워 총 및 생존 세포의 수를 계수합니다. 참고: 세포 생존율은 효소 소화에 사용되는 조건에 따라 다릅니다. 세포 회수율 및 세포 생존율을 증가시키기 위해, 피부 샘플을 더 작은 조각들로 절단할 수 있다.</li>
	<li>플레이트 3-10 x 104 세포 5mL의 완전한 FBS 성장 배지(DMEM, 56°C에서 60분 동안 10% FBS 열 비활성화, 1% 1M HEPES 완충 용액, 1% 100x 비필수 아미노산 혼합물, 1% 100x L-글루타민, 1% 100x 페니실린/스트렙토마이신, 1% 100x 피루브산나트륨) 25cm2 조직 배양 플라스크에서. 37°C에서 배양한다. 참고: 생존 가능한 섬유아세포는 24시간 이내에 플라스크에 부착되고 2-3일 안에 방추 모양을 나타내기 시작합니다.</li>
	<li>2일째에, 비부착성 세포를 함유하는 배지를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다. 참고: 배양 배지의 죽은 세포는 생존 가능한 섬유아세포의 성장에 영향을 미치므로 비부착성 죽은 세포는 배양에서 제거해야 합니다.</li>
	<li>배양 물이 70-80 % 밀도에 도달 할 때까지 3-4 일마다 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>섬유아세포를 채취하려면 PBS로 세척하고 인큐베이터에서 37°C에서 3분 동안 트립신/EDTA 용액으로 배양합니다.</li>
	<li>반응을 중지하려면 3-5mL의 따뜻한 완전 성장 배지(10% FBS를 함유한 DMEM 또는 RPMI)를 추가합니다. 혈구계로 세포를 계산하기 위해 세포 현탁액의 부분 표본을 취합니다. 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 흡인에 의해 배지를 제거합니다.</li>
	<li>섬유아세포를 PRP 배지(DMEM, 20% PRP, 1% 1M HEPES 완충액, 1% 100x 비필수 아미노산 혼합물, 1% 100x L-글루타민, 1% 100x 페니실린/스트렙토마이신, 1% 100x 피루브산나트륨, 2U/mL 헤파린)의 37°C 배양기에서 배양한다. 참고: 권장되는 최소 세포 밀도는 4,000개의 생존 세포/cm2입니다.</li>
	<li>섬유아세포 증식에 대한 PRP 효과를 평가하기 위해 PRP 농도가 다른 PRP 배지(1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 및 50%) 및 2U/mL 헤파린 또는 고전적 배양 배지 조건(10% FBS)에서 웰당 8 x 103 세포의 밀도로 24웰 플레이트의 종자 섬유아세포(계대 2). 배양 7일 후, 바이탈 염료(cell proliferation violet)를 세포에 첨가하고 유세포 분석기로 증식을 평가한다.</li>
	<li>세포골격 재배열을 연구하기 위해 96시간 동안 0.5% FBS가 보충된 완전한 FBS 성장 DMEM(2.14단계 참조)에서 1 x 105 cells/mL 농도의 24웰 흑색/투명 평평한 바닥 플레이트의 종자 세포. 10% FBS 또는 다른 PRP 농도(1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%)로 세포를 7일 동안 처리합니다.<ol><li>섬유아세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 RT에서 0.1% Triton X-100으로 5분 동안 투과시킵니다. 섬유아세포를 50mL의 5U/mL 팔로이딘으로 염색하고 PBS로 2배 세척한 다음 50mg/mL의 1mg/mL 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 5분 동안 표시합니다. Cytation 3 세포 이미징 다중 모드 판독기(BioTek)를 사용하여 팔로이딘 염색을 시각화했습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+therapies+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+and+Aesthetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li>
<li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li>
<li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li>
<li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li>
<li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li>
<li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+cell+therapy%3A+will+it+replace+dermal+fillers%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li>
<li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212(2018).</li>
<li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum%3A+serum-free+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li>
<li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li>
<li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Bovine+Serum+%28FBS%29%3A+Past+-+Present+-+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li>
<li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma%3A+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717(2016).</li>
<li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation%3A+Facts%2C+Fiction%2C+and+Pearls+for+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+Plastic+Surgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+%28PRP%29+systems%3A+a+call+for+PRP+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Regional+Anesthesia+and+Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li>
<li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Platelet-Rich+Plasma+%28CuteCell+PRP%29+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li>
<li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects%3A+A+Clinical+Replication+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetics%2C+Dermatological+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li>
<li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Dermatology%2C+Venereology+and+Leprology%22%5BJournal%5D)">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal%2FStem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma%3A+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li>
<li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Skin+%26+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin & Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li>
<li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li>
<li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery%3A+clinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Craniofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+%28PRP%29+in+Infrabony+Regenerative+Treatment%3A+A+Systematic+Review+and+RCT%27s+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235(2018).</li>
<li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation%3A+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li>
<li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li>
<li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting%3A+What+Is+the+Best+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406(2015).</li>
<li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platlet+Rich+Plasma+%28PRP%29+Improves+Fat+Grafting+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma%3A+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66(2017).</li>
<li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li>
<li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitivity+reactions+to+heparins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li>
<li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).</li>
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이 프로젝트는 Regen Lab SA의 자금 지원을 받았습니다. Sarah Berndt는 Regen Lab의 세포 치료 책임자 프로젝트 관리자이며 Regen Lab SA에서 근무하고 있습니다. Antoine Turzi는 RegenLab의 CEO입니다.

상처 세포 치료에서 다른 필러 재료에 비해 자가 섬유아세포를 천연 대안으로 사용하면 우수한 생체 적합성, 부작용 최소화, 수확 및 사용 용이성 등의 장점이 있습니다. 그러나 일상적인 임상 환경에서 이러한 치료제를 사용하기 전에 이식 전후에 성장 특징을 확인하고 분리된 섬유아세포의 생물학적 기능과 안전성을 평가하기 위해 적절한 전임상 연구가 필요합니다. 따라서, 분리 과정 직후, 세포의 시험관 내 확장은 세포 분열의 수를 제한하기 위해 신속하게 수행되어야 한다. 배양 조건은 최종 자가 생물학적 제제의 안전성과 효능을 보장하기 위해 엄격하게 통제되어야 합니다.
발표된 전임상 연구에서, 계대 3-4의 세포는 세포 양과 증식/분비 활성 측면에서 가장 적합하기 때문에 일반적으로 주입 대상으로 선택되었다15. 대부분의 전임상 연구는 FBS가 영양소와 성장 인자의 공급원인 배양 배지를 사용하여 수행되었다16...

재생 의학은 나이, 질병 또는 외상으로 손상된 조직과 기관을 치유하거나 대체하고 선천적 결함을 교정하는 것을 목표로 합니다. 자가 요법에서는 세포나 조직을 환자에게서 빼내어 확장하거나 변형한 다음 기증자에게 다시 도입합니다. 이러한 형태의 치료제는 피부과 분야에서 광범위한 잠재력을 가지고 있다1. 자가 섬유아세포 치료에서는 환자의 섬유아세포를 배양하고 재주입하여 주름, 백합 또는 여드름 흉터를 치료합니다. 섬유아세포는 진피의 주요 기능세포이기 때문에 자가 섬유아세포 주사는 안면 회춘에 다른 치료법보다 더 유익할 수 있다2.
피부에서 섬유아세포는 세포외 단백질(즉, 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 글리코사미노글리칸)의 합성 및 분비를 담당합니다. 또한 정상적인 피부 항상성 및 상처 치유에서 세포 기능, 이동 및 세포-기질/세포-세포 상호작용을 조절하는 성장 인자를 방출합니다3. 피부 섬유아세포는 피부 상처 치유를 위한 잠재적인 임상 세포 치료제로 이미 소개되었다.4, 조직 재생5 또는 심미와 성형 수술에서 피부 필러6. 일부 연구에서는 재생 의학의 맥락에서 섬유아세포가 중간엽 줄기세포보다 더 실용적이고 효과적인 세포 치료제가 될 수 있다고 제안하기도한다 7.
임상 적용을 위해 충분한 수의 섬유아세포를 얻으려면 일반적으로 세포 확장이 필수입니다. 생체 외/체외 세포 배양에는 세포 부착 및 증식을 지원하기 위해 성장 인자, 단백질 및 효소가 보충된 기본 배지가 필요합니다. 태아 소 혈청(FBS)은 태아 혈액이 1) 성인 혈액에 비해 성장 인자가 풍부하고 2)항체 함량이 낮기 때문에 세포 배양 배지의 일반적인 보충제입니다8. 세포 치료가 진행됨에 따라 FBS가 배양 배지에 첨가되는 고전적인 세포 배양 조건의 안전성에 대한 우려가 있습니다. 더욱이 FBS를 대안으로 대체하는 경향이 있습니다9. 여러 FBS 대체품이 유망한 결과를 보여주었습니다10.
혈소판 풍부 혈장(PRP) 대체품이 여기에서 선택되었으며, 당사는 CuteCell-PRP라는 PRP의 표준화된 제제를 생산하기 위한 의료 기기를 개발했습니다. 이 장치의 의도된 용도는 GMP 조건에서 자가 세포의 시험관 내 확장을 위한 배양 배지 보충제로 사용할 자가 PRP의 준비입니다.
PRP는 혈장 내 농축 혈소판 현탁액으로 정의됩니다. 1) 필요한 혈액의 양, 2) 사용되는 장치 유형 및 3) 원심분리 프로토콜이 다른 수많은 준비 프로토콜이 있기 때문에 결과 혈소판 농도는 혈액 기준선 값보다 약간 높거나 10배 이상까지 다양합니다. 또한 PRP 제제에는 다양한 수준의 적혈구 및 백혈구 오염이 포함되어 있습니다. 따라서 "PRP"라는 용어는 생물학적 구성과 잠재적인 치료 효과가 크게 다른 제품을 설명하는 데 사용됩니다.
대부분의 연구에서 FBS 치환은 (트롬빈 또는 칼슘에 의해) 활성화되는 다양한 농도의 PRP를 사용하여 달성됩니다. 이 인공 활성화는 15 분에서 24 시간11까지 혈소판 성장 인자의 즉각적이고 중요한 방출을 유발합니다. 따라서, 혈소판 활성화는 점진적인 혈소판 탈과립화로부터 성장 인자의 느린 방출이 요구되는 세포 배양에서의 적용에 바람직하지 않은 것으로 여겨진다.
PRP 요법은 농축 혈장에서 자가 혈소판을 준비하는 것을 포함한다12. 최적의 혈소판 농도는 불분명하며 PRP13을 준비하기 위해 광범위한 상용 장치를 사용할 수 있습니다. 이러한 표준화의 부족은 연구 간의 불일치로 인해 발생하며 주사 용량 및 시기에 관한 블랙박스로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 100% 자가 생체 외 배양 모델에서 피부 섬유아세포를 확장하기 위해 이 전용 PRP 장치를 사용하여 자가 PRP를 얻는 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 블랙 클리어 플랫 바텀</td><td>BD Falcon</td><td>353219</td><td>32/케이스</td></tr><tr><td>셀 트레이스 바이올렛 염료</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C34557</td><td>180 어세이</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>패키지당 튜브 3</td></tr>개 <tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500mL</td></tr><tr><td>글루타민 200mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100mL</td></tr><tr><td>혈액학 계수기</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 5000E 리크민</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0.5mL</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>2x 패키지당 5mg</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Na 피루브산 1mg/mL</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100mL</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100mL</td></tr><tr><td>팔로이딘 alexa Fluor 488</td><td>분자 프로브</td><td>A12379</td><td>300 단위</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500mL</td></tr><tr><td>트립신 1x 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100mL</td></tr><tr><td>트립신 EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>100mL</td></tr></tbody></table>

in vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

현재 피부 복구를 위한 자가 섬유아세포의 사용에 대한 임상적 관심이 크다. 대부분의 경우 시험관 내에서 피부 세포의 배양이 필요합니다. 그러나, 이종 또는 동종 배양 배지를 사용하는 세포 배양은 몇 가지 단점(즉, 감염원 전파 또는 느린 세포 확장의 위험)을 갖는다. 여기서, 환자 자신의 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 이용하여 체외에서 인간 피부 섬유아세포의 확장을 위한 자가 배양 시스템을 개발한다. 인간 진피 섬유아세포는 복부 성형술을 받는 동안 환자로부터 분리됩니다. 배양은 소 태아 혈청(FBS) 또는 PRP가 보충된 배지를 사용하여 최대 7일 동안 추적됩니다. PRP 제제의 혈구 함량, 증식 및 섬유아세포 분화를 평가합니다. 이 프로토콜은 전용 의료 기기를 사용하여 PRP의 표준화된 비활성 제제를 얻는 방법을 설명합니다. 준비에는 의료 기기 (CuteCell-PRP)와 원심 분리기 만 있으면됩니다. 이 장치는 충분한 의료 행위 조건에서 적합하며 5분 동안 1,500 x g 의 단일 소프트 스핀 원심분리가 필요한 원스텝, 발열성 및 멸균 폐쇄 시스템입니다. 원심 분리 후 혈액 성분이 분리되고 혈소판이 풍부한 혈장이 쉽게 수집됩니다. 이 장치를 사용하면 인간 세포의 시험관 내 확장을 위한 세포 배양 보충제로 사용할 수 있는 PRP를 빠르고 일관되며 표준화된 제조가 가능합니다. 여기서 얻은 PRP는 전혈에 비해 혈소판 농도가 1.5 배 더 높으며 적혈구와 백혈구가 우선적으로 제거됩니다. PRP는 FBS(7.7배)에 비해 세포 증식 촉진 효과를 나타내며 PRP 치료 시 섬유아세포가 활성화되는 것으로 나타났습니다.

이 특허 기술은 표준화된 PRP 제제를 생산하는 데 사용되는 간단하고 빠르며 재현 가능한 의료 기기입니다. 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 정맥 전혈에서 PRP를 제조할 수 있는 원스텝 완전 폐쇄 시스템입니다(분리 젤 기술로 인해). 원심분리 후 얻은 PRP는 젤 아래에 있는 적혈구와 백혈구에서 제거됩니다. 여러 차례 관을 반전시킨 후 겔 위에 있는 혈소판이 혈장에 재현탁되고 PRP를 사용할 준비가 됩니다(그림 1).
제제에서 혈구 함량의 재현성을 평가하기 위해 혈액학 분석기를 사용하여 10명의 다른 환자로부터 전혈 및 PRP 샘플을 분석했습니다. 장치로 전혈을 처리한 후 대부분의 적혈구(RBC)와 백혈구(WBC)를 제거했습니다. 평균 혈소판 농도는 전혈에서 발견되는 생리학적 농도와 비교할 때 1.5배 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2).<...

이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

이 프로토콜은 환자 자신의 혈소판이 풍부한 혈장과 5분 동안 표준화된 제제를 사용하여 인간 섬유아세포 배양을 위한 자가 시스템입니다. PRP는 배양에서 섬유아세포의 대규모 세포 확장을 촉진합니다. 자가 세포 치료를 위해 대규모 개울과 안전한 세포 확장이 필요할 때 PRP를 세포 보충제로 사용하여 이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.이 프로토콜을 시도할 때 PRP 무결성을 확인하는 것이 좋습니다. 혈장은 적혈구가 없는 상태에서 매우 깨끗해야 합니다. 전송할 때 매우 신중하게 수행해야 합니다.그리고 조직의 소화와 관련하여 진행하기 전에 매우 깨끗해야 합니다. 시작하려면 혈액이 채워진 혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 튜브를 조심스럽게 세 번 뒤집어 혈액과 항응고제를 혼합합니다. 고정된 45도 각도의 로터에서 1500g에서 5분 동안 혈액 샘플을 원심분리하고 튜브의 균형을 맞춥니다.원심분리 후, 분획된 혈액은 분리 겔 아래에 갇힌 적혈구와 백혈구를 가지며 겔 표면의 혈소판을 갖는다. PRP 튜브를 부드럽게 20회 뒤집어 혈장 상등액에 혈소판 침착을 재현탁시킵니다. 혈소판이 젤에서 완전히 분리되고 혈장이 투명하고 투명하게 변해야합니다.10 밀리리터 주사기에 연결된 이송 장치를 사용하여 튜브에서 플라즈마 용액을 수집하십시오. PBS가 있는 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 피부 샘플을 넣고 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 피부 샘플이 비교적 큰 경우 표피면이 아래로 향하도록 150제곱센티미터 조직 배양 접시의 뚜껑에 놓습니다.집게와 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하십시오. 조직이 마르지 않도록 PBS에서 몇 분마다 조직을 헹굽니다. 지방 제거가 완료되면 메스를 사용하여 피부 샘플을 약 0.5 x 1.5 센티미터의 스트립으로 자릅니다.다음으로, 5 밀리리터의 콜라게나제 / 디스 파아제 혼합물을 멸균 된 15 밀리리터 튜브에 첨가한다. 절단된 조직을 튜브에 옮깁니다. 티슈 조각이 용액에 잠겨 있는지 확인하고 튜브를 단단히 덮습니다.튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 150분 동안 궤도를 흔들어 놓습니다. 배양 후 조직이 들어 있는 튜브를 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 멸균된 100mm 배양 접시의 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 놓습니다.조직 현탁액을 튀지 않고 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다. 튜브에 조직 조각이 남아 있으면 멸균 1 밀리리터 피펫 또는 멸균 집게를 사용하여 조각을 배양 접시 바닥으로 옮깁니다. 표피가 위를 향하도록 하여 한 쌍의 집게로 진피를 잡습니다.다른 한 쌍의 집게로 표피의 가장자리를 잡고 진피와 표피를 떼어냅니다. 분리된 조각을 동일한 뚜껑에 보관하고 PBS가 들어 있는 새로운 100mm 배양 접시에 진피 조각을 넣습니다. 다음으로, 실험실 겸자를 사용하여 3밀리리터의 0.3% 트립신 PBS가 들어 있는 15밀리리터의 폴리프로필렌 튜브에 진피 조각을 옮깁니다.섭씨 37도의 수조에서 튜브를 배양하고 튜브를 여러 번 뒤집어 2-3분마다 내용물을 혼합합니다. 10 내지 20분 후, 3 내지 5밀리리터의 얼음-차가운 완전 성장 배지를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 튜브를 여러 번 격렬하게 소용돌이칩니다.섬유아세포가 포함된 현탁액을 85미크론 나일론 메쉬를 통해 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 섬유아세포 용액 150g에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 세포 계수를 위해 100 내지 200 마이크로리터의 완전한 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다.세포를 25제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 플레이트합니다. 그런 다음 플라스크를 섭씨 37도에서 배양합니다. 부착되지 않은 세포가 포함된 배지는 다음 날에, 그리고 다시 3-4일마다 교체하십시오.섬유아세포가 70 80% confluency를 도달할 때, PBS로 그(것)들을 세척하고 Trypsin-EDTA 해결책을 추가하십시오. 플라스크를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양한 후, 3 내지 5밀리리터의 따뜻한 완전 성장 배지를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 200g에서 5분 동안 원심분리한다.흡인에 의해 상청액을 제거합니다. PRP 배지에서 섬유아세포를 배양하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 권장되는 최소 세포 밀도는 제곱 센티미터 당 4, 000 생존 세포입니다.전용 의료 기기를 사용하여 10 명의 다른 환자의 전혈을 처리하여 PRP를 생산했습니다. 이 장치는 대부분의 적혈구와 백혈구를 제거했습니다. PRP의 평균 혈소판 농도는 전혈의 혈소판 농도보다 약 50% 높았습니다.자가 섬유아세포는 10% FBS를 갖는 배지 또는 1 내지 50% 범위의 PRP 농도를 갖는 배지에서 배양하였으며, 배양 7일 후, 배지를 바꾸지 않고, 20% PRP로 프라이밍된 배양은 더 많은 수의 생존 가능한 섬유아세포를 나타냈다. PRP는 FBS에 비해 최대 7.7배까지 증식 촉진제로서 강력한 효과를 보였습니다. 팔로이딘 염색은 PRP 활성화 시 관찰되는 형태학적 변화가 섬유아세포 활성화의 시그니처인 F-액틴 재구성과 관련이 있음을 보여주었습니다.급속한 세포 확장의 주요 관심사는 게놈 변형의 위험입니다. 이를 평가하기 위해 비교 게놈 혼성화 분석을 수행하여 세포의 게놈 안정성을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 FBS를 PRP로 대체하는 것입니다., 더 강력한 자가 생물학적 보충제입니다.이를 통해 연구원은 이종 물질을 추가하지 않고도 더 많은 세포를 더 빠르게 성장시킬 수 있습니다. 임상 적용 전에 생체 외 확장이 필요한 다른 세포 유형(예: 각질세포 또는 중간엽 줄기 세포)에 이 기술을 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

인간의 혈소판 lysate 성장 요인 풍부한 소스와 세포 배양에서 강력한 보충이다. 이 프로토콜은, 혈소판 풍부 혈장부터 몇 동결 - 해동 사이클을 수행하고 혈소판 조각을 파괴하여 인간의 혈소판 lysate의 큰 수영장을 준비하는 과정을 보여줍니다.

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

이 비디오는 거핵세포의 분화와 혈소판 형성을 위한 기술을 보여줍니다. 인간 탯줄 혈액에서 분리된 조혈 줄기 전구 세포는 트롬보포이에틴이 존재하는 상태에서 성숙한 거핵세포로 분화합니다. 성숙한 거핵세포는 프로혈소판(proplatelet)이라고 하는 세포질 확장을 생성하며, 이는 개별 혈소판을 생성합니다.

거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

이 동영상은 혈소판 수 스크리닝, 혈액 채취 및 원심분리, 혈소판 분리를 통한 고품질 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 준비를 보여줍니다. 이 PRP는 조직 재생 및 치유를 위한 치료 응용 분야에 사용됩니다.

Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood(인간 말초 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장)의 제조

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF)은 독특한 피브린 구조, 풍부한 혈소판 및 풍부한 성장 인자를 가진 자가 혈소판 농축액의 FDA 승인 제제를 나타냅니다. 여기에서는 L-PRF의 체어 사이드 생성을 위한 프로토콜을 제시하고 단축 테스트 및 봉합사 유지 강도 테스트를 포함한 기계적 특성을 평가합니다.

백혈구 - 혈소판 풍부한 섬유소, 소설 생체 재료의 특성

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 말 근골격계 질환의 치료에 사용됩니다. 다양한 기술은 다양한 혈소판 및 백혈구 농도로 PRP를 생성합니다. 이 기사에서는 말의 혈액에서 PRP를 얻는 방법에 대해 설명합니다.

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전방 십자 인대 (ACL)의 부분적인 눈물을 복구하는 패치 향후 애플리케이션의 경우, 인간의 ACL 유래 세포는 체외에서 확장 및 조직 공학적 지지체에 성장 재건 과정 중에 얻은 조직에서 분리되었다. 세포 접착 및 형태학이어서 지지체 표면에 생체 적합성을 확인하기 위하여 실시 하였다.

외과 검색, 분리 및<em&gt; 체외</em&gt; 조직 공학 응용 프로그램에 대한 인간의 전방 십자 인대에서 파생 된 세포의 확장

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

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모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다.

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

배우세요 자가 혈소판 풍부 혈장을 이용한 인간 섬유아세포 배양 및 확장 방법입니다. 이 표준화된 5분 준비 프로토콜은 재생의학 연구에서 안전하고 효과적인 자가 세포 치료를 가능하게 합니다.

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

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