산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장
May 23rd, 2020
이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.
신경권 분석법은 생리학적 및 병리학적 맥락에서 증식, 자기 재생 및 다효능을 포함한 신경 줄기/전구 세포의 내재된 특성을 연구하기 위한 체외 기법에 유용합니다. 3차원 구조로 인해 이 기술은 성인 신경 발생을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 또한 배양 하 고 신경 줄기/전구 세포의 높은 수율을 얻기 에 대 한 유용.
이 신경권 분석은 알츠하이머병과 파킨슨 병 또는 다발성 경화증과 같은 뇌 질환연구에 적용될 수 있습니다. 신경구는 또한 다른 두뇌 지구 또는 시스템에서 얻을 수 있습니다., 지방 조직 또는 창 자 등. 필리핀 리베이로와 함께 절차를 시연하는 것은 리타 소아레스, 내 그룹에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.
산후 날부터 3개의 마우스 두뇌를 수확하기 위해, 머리 의 밑에 바디의 복부 부분을 잡고 두개골을 드러내기 위하여 머리의 전체 길이에 있는 피부에 있는 중간 절개를 만들기 위하여 작은 뾰족한 가위를 이용합니다. 두개골 의 바닥에 세로 절개를하고 뇌 구조를 손상시키지 않도록 가능한 한 얕은 각도에서 간구 봉합사를 따라 절단을 계속합니다. 구부러진 집게를 사용하여 두개골을 측면에 껍질을 벗기고 뇌 의 밑에 작은 주걱을 밀어 뇌의 기지에 연결된 두개골 신경과 혈관을 잘라냅니다.
항생제로 보충 된 차가운 HBSS의 페트리 접시에 뇌를 넣고 낮은 배율에서 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 등대 표면에 뇌를 배치합니다. 소뇌에 의해 뇌를 들고있는 동안, 뇌와 후각 전구의 복부 측에서 수막을 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다.
뇌를 복부 측면으로 회전시키고 나머지 수막을 벗겨냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 소뇌를 제거하고 구부러진 뾰족한 집게를 사용하여 조직 헬기 위에 11 마이크로미터 기공을 가진 필터 용지 조각으로 뇌를 옮겨냅니다. SVZ 및 DG 미세 절의 경우 뇌를 450 마이크로미터 관상 섹션으로 자르는 것으로 시작합니다.
젖은 라미나는 절제된 뇌를 해부 현미경으로 보충한 차가운 항생제 로 채워진 새로운 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 측삭 심실이 있는 슬라이스에 도달할 때까지 앞쪽에서 후방 방식으로 관상 동맥 조각을 분리합니다. 미세 한 집게를 사용하여 심실의 측면 벽을 둘러싼 조직의 얇은 층을 잘라, striatal parenchyma와 코퍼스 callosum을 제외하고, 즉시 코퍼스 callosum 아래에 집게의 한 끝을 배치하고 다른 하나는 SVZ를 분리하기 위해 측면 심실의 복부 영역에 인접한 조직에 즉시 배치합니다. 측면 심실을 둘러싼 작은 조직의 라인을 잘라 보충 HBSS 용액을 포함하는 샘플 튜브로 해부 된 조직을 수집합니다.
모든 슬라이스가 집게와 해마 형성으로 미세 해부되었을 때 DG가 여전히 인식할 수없는 해마로 첫 번째 조각을 폐기하십시오. DG를 제거하려면 먼저 해마를 슬라이스에서 분리하고 현미경에 다시 초점을 맞추어 DG 주변의 테두리를 시각화합니다. DG를 수확하려면 집게를 사용하여 DG와 CA1 영역 을 잘라내고 DG와 CA3 영역 사이의 수직 절단을 합니다. 그런 다음 펨브리아와 인접한 조직을 제거하고 수확한 조직을 항생제 보충제 HBSS 용액의 별도의 튜브에 배치합니다.
SVZ 및 DG 샘플을 분리하려면 트립신-EDTA0.05%를 HBSS에 0.05%의 최종 농도에 0.05%를 추가하여 섭씨 37도에서 약 50분 간 배양합니다. 트립신 또는 너무 긴 잠복기의 전체 사용은 세포 성장에 부정적인 영향을 미치는 증가 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 조직이 함께 뭉쳐지면 효소 용액을 4 연속 세척용으로 교체하여 세척당 신선한 보충 HBSS 1밀리리터로 바꿉니까.
마지막 세척 후, 혈청없는 매체의 1 밀리리터에 소화 된 조직을 다시 일시 중단 표피 성장 인자의 밀리리터 당 10 나노 그램과 튜브 당 기본 섬유 아세포 성장 인자의 밀리리터 당 5 나노 그램. 그런 다음 동질세포 용액이 얻어질 때까지 P1000 파이펫으로 7~10회 부드러운 파이펫으로 조직을 기계적으로 분리한다. 해리된 DG 또는 SVG 셀의 밀도를 결정하려면 각 현탁액의 세포를 혈중세포계에서 계산합니다.
신경구로 세포를 확장하려면, 성장 인자와 함께 보충 세럼없는 매체에 밀리리터 밀도 당 네 번째 세포 당 두 배 10에서 개별 세포 인구를 희석하고 코팅되지 않은 60 밀리미터 직경 페트리 접시에 세포 현탁액의 씨앗 5 밀리리터. 그런 다음 SVZ 세포를 6~8일 동안 배양하고 DG 세포는 1차 신경권 형성을 위해 섭씨 37도에서 10~12일 동안 배양한다. 신경구의 대다수가 150 에서 200 마이크로미터 직경을 가지고 있을 때, 배양에서 세포 현탁액을 수확하고 원심분리에 의해 신경구를 수집합니다.
다른 원심 분리로 세포를 수집하기 전에 제조업체의 지시에 따라 마우스 화학 해리 키트로 신경 구 팔레트를 다시 중단하십시오. 상체를 성장 요인으로 보충한 세럼이 없는 매체의 1밀리리터로 대체하고 펠릿을 약 10회 부드럽게 평가하십시오. 해리된 신경 세포를 입증된 대로 계산하고 새로운 60 밀리리터 페트리 접시로 성장 인자로 보충된 혈청 이없는 배지의 밀리리터 밀도당 4번째 세포에 2회 10회에서 세포를 재시드한다.
그런 다음 이차 신경구를 얻기 위해 적절히 6 8 일 또는 10 일 에서 12 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 세포를 반환합니다. 신경권 분석체를 이용하여 얻은 SVG 및 DG 신경구는 미분화된 Sox2 양성, 네신 양성 세포로 구성된다. 특히, SVG 유래 신경구는 DG 보다 더 큰 치수를 가지고 있습니다.
중요한 것은, 분화 조건하에서, SVG 및 DG 유래 신경 줄기/선조 세포는 신경구에서 이동하여 세포의 의사단층을 형성한다. 두 신경발생 부위모두에서, 스스로 재생을 나타내는 대칭 분열에 대응하는 Sox2 이중 양성, 네틴 이중 양성, 이중 코르틴 이중 음세포 쌍의 존재를 관찰할 수 있다. 세포쌍은 Sox2 양성, 네스트린 양성 및 이중 코르틴 음성의 한 세포, 및 다른 세포 Sox2 네거티브, 네스트린 네거티브 및 이중 코르틴 양성 비대칭 분열을 입증하는 쌍을 이.
및 Sox2 이중 음수, 네신틴 이중 음수 및 이중 코르틴 이중 양성 세포 쌍은 분화를 나타내는 대칭 분열에 해당한다. 전반적으로, 패혈증은 체외에서 둘째 날에 세포 사망률을 변경합니다. Neuritogenesis는 분화의 시작 부분에 SVG 및 DG 신경 줄기/전구 세포의 분화에서 얻은 뉴런에서 평가될 수 있다.
관찰된 바와 같이, 중성염의 길이와 파급효과는 분화와 함께 증가한다. 증식 세포의 높은 비율은 DG에 비해 SVG에서 관찰된다. 성숙한 뉴런으로 분화하는 증식 선조의 비율은 신경성 틈새 시장 모두에서 유사합니다. 두 세포 유형 은 또한 미성숙 뉴런으로 분화 할 수 있습니다, 성숙한 중성자, 올리고 드로키테스 전구 세포, 성숙한 올리고드로키테스, 그리고 성상 세포.
신경구를 얻은 후 면역 세포 화학, 칼슘 이미징, 서양 얼룩 및 RT-PCR을 포함한 여러 가지 방법이 신경 줄기/전구 세포의 줄기 및 다효능을 연구하기 위해 수행될 수 있다. 신경권 분석체는 신경 줄기/전구 세포의 증식 및 분화 모두에 수반되는 분자 및 세포 과정을 더욱 평가하기 위해 유전 및 질병 모델에 적용될 수 있다.
개요
본 연구는 주요 신경 발생 틈새에서 유래한 생후 마우스 신경 줄기 세포로부터 신경구 배양을 생성하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이는 신경구를 이용하여 신경 줄기 세포 집단을 식별하고 추정하는 동시에 세포 운명 연구를 위해 뉴런, 올리고덴드로사이트 및 성상교세포로의 분화를 촉진합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 줄기 세포 생물학
- 세포 배양 기술
배경
- 신경구 분석은 신경 줄기/전구 세포의 시험관 내 검사를 허용합니다.
- 성인 신경 발생 연구 및 세포 유형 식별에 대한 강력한 모델로 기능합니다.
- 이 기술은 신경 줄기/전구 세포의 더 높은 양을 생성할 수 있습니다.
- 응용 분야는 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 신경학적 장애 연구로 확장됩니다.
연구 목적
- 신경구 생성을 위한 상세한 프로토콜을 수립합니다.
- 3D 배양 시스템에서 신경 줄기 세포의 특성을 특성화합니다.
- 분석을 위한 주요 신경 세포 유형으로의 분화를 촉진합니다.
사용된 방법
- 본 연구는 주로 세포 배양을 위한 신경구 분석을 활용합니다.
- 생물학적 모델은 생후 마우스 뇌에서 신경 줄기 세포를 분리하는 것을 포함합니다.
- 주요 절차 단계에는 해부, 효소적 분리 및 배양 조건이 포함됩니다.
- 신경구 형성은 세포 유형에 따라 6-12일의 기간에 걸쳐 발생합니다.
- 세포는 Sox2 및 nestin과 같은 마커에 기반하여 확장 및 특성화됩니다.
주요 결과
- 신경구는 특정 배양 조건 하에서 미분화, 다분화 특성을 나타냅니다.
- 하복미 영역(SVZ)에서 유래한 신경구는 치아 회(DG)에서 유래한 신경구보다 더 큽니다.
- 세포 생존율 및 성장은 취급 절차 및 분리 시간에 의해 영향을 받습니다.
- 본 연구는 신경 줄기 세포에 대한 향후 분화 연구를 위한 기반을 제공합니다.
결론
- 이 방법은 신경 줄기 세포 행동 및 분화에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 얻은 통찰은 신경 발생 과정 및 잠재적 치료 응용에 대한 우리의 이해를 알려줍니다.
- 신경학적 질환에 기여하는 메커니즘을 조사하는 데 귀중한 시사점을 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
The neurosphere assay enables scalable in vitro modeling of neural stem/progenitor cell (NSPC) behavior, supporting target validation in neurodegenerative disease research. By providing a renewable source of multipotent cells from defined neurogenic niches, the method reduces reliance on primary tissue and enhances reproducibility in early discovery workflows. This positions the assay as a mechanistic de-risking tool for evaluating intrinsic and extrinsic factors influencing NSPC proliferation, differentiation, and lineage commitment in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing NSPC self-renewal and multipotency under controlled conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantifiable readouts of proliferation and differentiation potential.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating dose-response data on intrinsic or extrinsic modulators of stem cell fate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, suspension-based NSPC cultures suitable for high-content imaging and biomarker screening.
- Operational Value: Enables assay standardization via defined growth factor conditions and passaging protocols.
- Scalability: Supports expansion of SVZ- and DG-derived neurospheres for reproducible compound testing across wells and plates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Differentiated neurosphere-derived pseudomonolayers allow study of neuritogenesis and lineage-specific maturation relevant to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of symmetrical and asymmetrical division patterns as indicators of stem cell fate decisions.
- Disease Model Compatibility: Compatible with genetic and disease models to assess molecular pathways in NSPC proliferation and differentiation.
Pipeline & Workflow Integration
The neurosphere assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling iterative assessment of NSPC behavior before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of targets regulating stem cell maintenance and differentiation.
- Screening: Delivers quantitative, suspension-based cultures amenable to automated imaging and multiparametric readouts.
- Analytics: Generates measurable outputs including sphere diameter, marker expression (Sox2, nestin, doublecortin), and differentiation efficiency.
- Translational Research: Connects in vitro stem cell behavior to preclinical continuity through lineage-specific differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for NSPC expansion and characterization across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in stem cell regulation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in NSPC culture and passaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target effects on stem cell proliferation and differentiation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, lineage-resolved stem cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue microdissection and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to dissection microscopes, tissue choppers, and CO2 incubators with precise temperature control.
- Necessitates standardized enzymatic dissociation protocols to minimize variability and cell death.
- Requires adaptation of growth factor concentrations and culture duration based on regional NSPC source (SVZ vs DG).
- Limited by the need for careful monitoring of neurosphere size and passaging timing to avoid spontaneous differentiation or overgrowth.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Postnatal Day 1-3 (P1-3) Mouse Brain Harvest
2:28
Subventricular Zone (SVZ)/Dentate Gyrus (DG) Microdissections
4:22
Tissue Dissociation
5:27
Postnatal Neural Stem Cell Expansion
6:09
Neurosphere Passaging
7:10
Results: Representative Neurosphere Expansion and Characterization
9:21
Conclusion
