PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

프레스토 탱고 플랫폼은 리간드 유도 베타 체포 2 모집을 프로파일하는 고아 표적을 포함하여 인간 게놈에 있는 모든 비 후각 GPCRs의 병렬 및 동시 심문을 실행하도록 고안되었습니다. Presto-Tango 플랫폼은 G 단백질 독립적 인 베타 체포 분석법을 사용하여 병렬 접근 법으로 전체 GPCR 게놈을 프로파일링하기위한 유일한 오픈 소스 자원입니다. 프로세서를 시연하는 것은 제네비브 라로슈(Genevieve Laroche)의 연구 준과 제 실험실에서 박사 후보인 마넬 지갈(Manel Zighal)이 될 것입니다.

시술을 시작하기 전에 밀리리터 폴리 L-리신 용액 당 25 마이크로리터를 384 개의 광학 바닥 플레이트의 각 우물에 추가하고 30 분에서 2 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 과잉 폴리 L-리신을 제거하고 각 우물에 항생제 항진용액의 40 마이크로 리터를 추가싱크를 통해 플레이트를 쓸어. 그런 다음 세포 파종에 필요한 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하고 나머지 플레이트를 섭씨 4도에 배치하여 장기 보관하십시오.

1 차 적인 검열을 위한 HTLA 세포를 종자하기 위하여는, 부드럽게 접시 당 0.05%의 트립신 EDTA의 6밀리리터로 배양을 취급하기 전에 PBS의 10 밀리리터와 콘천성 150 밀리미터 세포 배양을 부드럽게 헹구십시오. 세포가 풀을 분리했을 때 동일한 양의 DMEM을 포함하는 50 밀리리터 원판 튜브에서 세포 현탁액. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.

DMEM 농도의 밀리리터 당 5번째 세포에 2.2배 10번으로 펠릿을 다시 중단하고 싱크대 를 통해 플레이트를 쓸어 놓아 항생제 항mycotic 용액을 제거한다. 접시를 탭하여 45마이크로리터의 셀을 각 우물로 자릅니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 45%로 하룻밤 사이에 놓습니다.

384개의 잘 된 DNA 소스 플레이트를 제조하기 위해 각 플라스미드 무료 DNA의 밀리리터당 50 나노그램을 분배하여 GPRC 탱고 구조당 0.1X Tris-EDTA에 대한 관심있는 GPRC 탱고 구조가 96 웰 플레이트의 각 웰에 잘 들어갑니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에서 각 조건별로 4배의 DNA 소스 플레이트 1개중 개별 우물로 DNA 용액 10마이크로리터를 수동으로 전송한다. 다음으로, 0.313 의 어금니 칼슘 염화물 용액40마이크로리터를 DNA 소스 플레이트의 각 웰에 전달하고 각 웰의 내용을 부드럽게 혼합한다.

부드러운 혼합384 웰 DNA 소스 플레이트의 각 웰에 2x HEPES 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 1분 후 384개의 잘 DNA 소스 플레이트에서 DNA 트랜스포팅 혼합물의 10마이크로리터를 종자 HTLA 세포의 각 웰로 이송하고 하룻밤 동안 세포 배양기에서 세포를 배양한다. 다음 날 전소 세포를 직접 만지지 않도록 주의하여 각 웰에 굶주린 배지의 40 마이크로리터를 천천히 첨가합니다.

그런 다음 20 마이크로리터를 교대행으로 3배 농도로 관심 있는 화합물의 화합물 20 마이크로리터에 화합물 없이 교대행에 대한 차량 버퍼 20마이크로리터를 추가하여 세포 배양 배양 배양기로 되돌린다. 자극 이에 따라 16~24시간 전소 배지를 감착하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 5~20분 동안 각 웰에 갓 준비된 광질 시약 20마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 마이크로 플레이트 발광 카운터의 플레이트를 잘 통합한 시간으로 읽습니다.

이차 스크리닝의 경우 HTLA 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 접시당 11밀리미터의 완전한 배지로 5배 10밀리미터 의 6세포 총 세포 밀도로 100밀리미터 의 요리로 배양한다. 다음 날, 500 마이크로리터의 트리스-EDTA 칼슘 염화염화물 용액과 함께 GPCR 무료 DNA 10마이크로그램을 혼합한 후 HEPES 버퍼500마이크로리터를 첨가했습니다. 격렬한 흔들림 후 실온에서 1 분 동안 용액을 배양하고 즉시 용액의 1 밀리리터를 세포에 현명하게 추가하십시오.

부드럽게 바위를 흔들어 침전을 고르게 분배하고 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 놓습니다. 다음 날, 형광 세포 이미저에서 형광 효율을 확인하십시오. 커버리지가 50% 이상인 트랜잭션이 이상적입니다.

0.05%의 트립신 EDTA의 3밀리리터로 세포를 분리하기 전에 반감염된 세포를 성구 용액으로 부드럽게 헹구십시오. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집하고 탄환을 기아 중간 농도의 밀리리터 당 5번째 세포로 4회 10회에서 다시 중단한다. 그런 다음 45 마이크로리터의 세포가 폴리 L-리신 코딩 384 웰 플레이트의 각 우물로 파종하고 적어도 4시간 동안 세포 배양 배양 배양에 플레이트를 배치한다.

하프 로그 용량 곡선 응답 플레이트를 준비하려면 HEPES및 항생제 항mycotic로 보충된 270마이크로리터를 96웰 플레이트의 마지막 행에 추가하고 각 고저약물 용액의 30마이크로리터를 H.Transfer각 웰의 웰에서 혼합및 혼합및 혼합및 마지막 행까지 연속적으로 희석하기 위해 용액을 전송합니다. 도달합니다. 색다른 기준으로 매틱을 사용하여, 96웰 플레이트의 G를 통해 행 A로부터 낮은 컬럼 희석제 20마이크로리터와 높은 컬럼 희석기 20마이크로리터를 96웰 플레이트의 H를 통해 B를 통해 기존 시트384 웰 플레이트에 혼합한다. 그런 다음 최소 16 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.

자극 감소 후 16~24시간 전소 세포 배지를 감착하고 5~20분 동안 각 웰에 20마이크로리터의 글로우 시약을 추가하여 마이크로 플레이트 발광 카운터에서 플레이트를 잘 1초씩 편성하였다. 이 대표적인 실험에서, 1차 선별에서 심문된 168GPCR 중에서도 도파민 수용체 D3와 opsin 5만이 잠재적인 활성 표적으로 경쟁자였습니다. 도파민 수용체 D3는 4.7의 중요한 로그2 접이식 변화를 일으켰고, opsin 5는 2.39의 약간 낮은 반응을 일으켰다.

비교하여, 도파민 수용체 D2, 1차 스크린에 대한 양성 대조군은 4.58의 로그2 접이식 변화를 일으켰다. 이차 스크리닝에서 이러한 응답 곡선은 크로마틴 과립 추출물이 도파민 수용체 D3에서 활성 히트로서의 유효성을 확인하는 퀸피롤에 반 최대 유효 농도 값으로 유사한 신호 창을 생성한다는 것을 입증했다. 음의 대조군과 유사한 평평한 투여 곡선은 opsin 5에 대해 생산되었지만 이 수용체를 크롬마틴 과립 추출물에 대한 가능한 표적으로 배제하였다. 프레스토 탱고는 세포 분포, 경질 효율 및 직렬 약물 희석의 가변성이 복합 오차를 초래할 수 있기 때문에 특별한 주의를 기울여야 하며 이는 데이터의 정확성에 영향을 미칠 수 있습니다.

Radioligand 결합 접근법, 생물 발광 공명 에너지 전송 및 순환 AMP 칼슘 및 내재 작용과 같은 직교 방법은 리간드 수용체 상호 작용을 더 확인하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.