Name: 작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 C2C12 근강 세포주에서 shRNA를 이용한 유전자 안정적 녹다운 방법을. 근육 분화 과정에서 세포 외 매트릭스 단백질 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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D.H.는 국립 보건원 (국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소, NIAMS, 교부금 번호 AR070748)과 레니 & 피터 W. 월 정형 외과, 아이칸 의과 대학의 종자 기금에 의해 지원됩니다. 시나이 산.

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저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 여기에서 C2C12 근강초체에 있는 ECM 단백질의 안정한 녹다운을 위한 프로토콜및 myotubes로 C2C12 근세포의 분화의 표현형 분석을 위한 기술합니다. 여러 가지 요인이 실험 결과를 결정하며 신중하게 고려해야 합니다. 증식 상에서 C2C12 세포를 유지하는 것은 C2C12 세포를 근구 전구체 상태로 유지하는 중요한 단계이다. C2C12 세포의 능력을 유지하여 지속적으로 myotube로 분화하는 것은 i) 세포의 통로 수, ii) 일상적인 유지 동안 배양된 세포의 밀도, 및 iii) 영양소 가용성에 따라 달라지며, 세포 배양 배지11,12,13의빈번하고 정기적인 보충이 요구된다. 몇몇 알려지지 않은 기계장치 때문에, 더 높은 통로 수 C2C12 세포는 또한 추가 근막융합(11)에대한 잠재력을 잃는다. C2C...

세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 모든 조직에 대한 구조적 지원을 제공하고 세포 세포 통신을 중재하며 세포 운명을 결정합니다. ECM의 형성 및 동적 리모델링은 따라서 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요합니다1,2. ECM 단백질을 위해 코딩하는 몇몇 유전자에 있는 병리학적인 이체는 근위축성에서 가성형성에구역 수색하는 표현형을 가진 근골격계 무질서를 초래합니다3,4. 예를 들어, ADAMTSL2의 병원성 변이체는 매우 드문 근골격계 질환인 겔레오피식 이형성증을 일으키며, 이는 가짜 근육, 즉 골격근 질량의 명백한증가5를제시한다. 마우스 및 인간에서유전자 발현 데이터와 함께, 이것은 골격 근 발달 또는 항상성6,7에서ADAMTSL2에 대한 역할을 시사한다.
우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 ADAMTSL2가 세포 배양 설정에서 골격 근육 발달 및 / 또는 항상성을 조절하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 우리는 뮤린 C2C12 근강세포주에서 ADAMTSL2를 안정적으로 쓰러뜨렸습니다. C2C12 근세포 및 이들의 근체 내분체는 골격근 분화 및 골격근생물공학8,9에대해 잘 설명되고 널리 사용되는 세포 배양 모델이다. C2C12 세포는 혈청 철수 후 뚜렷한 분화 단계를 거치며, 배양 에서 3-10 일 후에 다중 핵화 된 myotubes의 형성을 초래합니다. 이러한 분화 단계는 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인(MyHC)과 같은 별개의 마커 유전자의 mRNA 수준을 측정함으로써 안정적으로 모니터링될 수 있다. C2C12 세포에서 안정적인 유전자 녹다운을 생성하는 한 가지 장점은 C2C12 분화의 후기 단계에서 발현되는 유전자가 형질감염 후 5-7일 동안 지속되고 형질전환 효율에 의해 전형적으로 지속되는 작은 간섭(si) RNA에 의해 달성된 과도적 녹다운에 비해 보다 효율적으로 표적화될 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 바와 같은 프로토콜의 제2 의제는 puromycin 선택을 사용하여 C2C12 녹다운 셀의 비교적 빠른 배치 생성이다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃 또는 인간 또는 표적 유전자 결핍 마우스로부터의 1차 골격 근 세포 전구체의 분리와 같은 대안은 기술적으로 더 도전적이거나 환자 근육 생검 또는 표적 유전자 결핍 마우스의 가용성을 각각 요구한다. 그러나, 다른 세포 배양 기반 접근법과 유사하게, C2C12 세포를 골격 근 세포 분화모델로 사용하는 데 한계가 있는데, 예를 들어 세포 배양체의 2차원(2D) 성질설정 및 미분화 골격근 전구체세포(10)를유지하는 데 중요한 생체내 미세환경의 부족.

<table><tbody><tr><td>아세톤</td><td>피셔 화학 191784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기 Countesse II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4205987</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher 화학 183172</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (Amplification Grade)</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>VWR Life Sciences</td><td>19C2656013</td><td></td></tr><tr><td>염소-안티-마우스 2차 항체(IRDYE 800CW)</td>Li-C90130-02 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소-안티 마우스 2차 항체(로다민-레드)</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>133389</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>피셔 케미컬</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터(셰이커)</td><td>Denville Scientific Corporation</td><td>1704N205BC105</td><td></td></tr><tr><td>메르캅토에탄올</td><td>Amresco, VWR Life Sciences</td><td>2707C122</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep 플라스미드 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 4 (myosin heavy chain)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6503-82</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>Invitrogen</td><td>2086310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Life Sciences</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>비이온 계면활성제/세제</td><td>VWR Life Sciences</td><td>18D1856500</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>MP</td><td>199983</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 항생제</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페트리디쉬</td><td>코닝</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>149569C</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>33576300</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>PCR(실시간)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359284</td><td></td></tr><tr><td>반응 튜브</td>: <td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcription, Master Mix</td>, <td>Applied Biosystems</td>, <td></td> 4368814 <td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>, Thermo Scientific</td><td>TK274910</td><td></td></tr><tr><td>sh control plasmid</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>07201820MN</td><td></td></tr>, <tr><td>sh 3086 plasmid</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092578</td><td></td></tr><tr><td>sh, 972 plasmid</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>TRCN0000092579</tr><tr><td>sh 1977 plasmid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092582</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 (Nanodrop)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One C</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Reagent Master Mix Applied</td><td>Biosystems</td><td>743566</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Acros Organics</td><td>30145369</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Ambion</td><td></td><td></td>254707</tr><tr><td>Trypan blue</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA 0.25%</td><td>Gibco-Life Technology Corporation</td><td>2085459</td><td></td></tr><tr><td>물(DEPC 처리 및 뉴클레아제 없음)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>186163</td><td></td></tr><tr><td>Western blotting apparatus</td><td>Biorad</td><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

작은 헤어핀 (sh)rna를 사용하여 c2c12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 골격 근 발달과 항상성에 매우 중요합니다. C2C12 근구 세포체에서 ECM 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운은 골격 근력 발달에서 이러한 단백질의 역할을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 C2C12 세포에서 작은 헤어핀(sh) RNA를 사용하여 ECM 단백질 ADAMTSL2를 고갈시키기 위한 프로토콜을 예로 기술한다. shRNA 플라스미드의 형질감염 후, 안정한 세포는 푸로마이신을 사용하여 일괄 선택하였다. 우리는 또한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 C2C12 분화를 통해 이들 세포주의 유지 및 표현형 분석의 유지를 기술한다. 이 방법의 장점은 비교적 빠른 안정적인 C2C12 녹다운 세포의 생성과 세포 배양 배지에서 혈청의 고갈 시 다중 핵화 된 myotubes로 C2C12 세포의 신뢰할 수있는 분화이다. C2C12 세포의 분화는 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 및 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인 (MyHC)과 같은 정식 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 Myotube로 C2C12 근강변 분화의 진행을 나타내는 모니터링할 수 있습니다. 작은 간섭 (si) RNA를 가진 유전자의 과도 한 녹다운대조적으로, C2C12 분화 도중 또는 myotube 성숙 도중 나중에 표현되는 유전자는 shRNA를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포를 생성해서 보다 효율적으로 표적으로 할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 CRISPR/Cas9에 기초한 유전자 녹아웃 전략을 사용하여 극복될 수 있는 특정 shRNA에 따라 녹다운 효율의 가변성뿐만 아니라 고려해야 할 shRNA의 잠재적인 오프 타겟 효과이다.

puromycin 저항하는 C2C12의 선택은 비 저항성, 즉, 비감염세포의 효율적인 제거로 인해 형질전환 후 10-14일 후에 달성될 수있다(도 1B). 전형적으로, 세포의 80% 이상은 세포 배양 접시에서 분리하고 이 세포는 일상적인 세포 유지 동안 제거됩니다. Puromycin 저항하는 C2C12 세포는 제어 (스크램블드) shRNA를 표현하는 낮은 세포 밀도및 myotube로 분화하는 기능에서 스핀들 모양, 가늘게 한 세포 형태를 유지합니다. 혈청 금단에 따른 C2C12 분화는 밝은 현장 현미경 검사법및 myotube 마커 미오신 중대사슬(MyHC)에 대한 면역염색에 의해 모니터링될 수있다(그림 2). MyHC 양성 myotubes는 분화 개시 후 3-5 일 사이에 관찰됩니다. Myotube는 MyHC 양성 세포 경계 내에서 하나 이상의 DAPI 양성 핵의 존재에 의해 도시된 바와 같이...

우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

이 프로토콜은 우리가 근관 형성 또는 성숙의 후반 단계에서 위로 조절되는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 단백질의 기능을 연구할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 방법은 특정 shRNA 및 표화를 위한 각각의 분석 도구를 사용하여 C2C12 세포에 대한 관심있는 유전자를 노크하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 성숙한 심모튜브에서도 관심 유전자를 지속적으로 억제할 수 있는 C2C12 세포를 생성했다는 것입니다.이 절차의 가장 중요한 양상은 일상적인 세포 배양 동안 낮은 세포 밀도를 의미하는 미분화 상태에서 C2C12 세포를 유지하는 것입니다. 전일, 5회 10~4차 C2C12 세포를 밀리리터당 2밀리리터당 6웰 플레이트에 5번 10번 시드하여 하룻밤 동안 37도, CO25%의 인큐베이션 후 40~50%의 합류를 달성합니다. 다음 해 아침, 25밀리알나트륨 100마이크로리터를 배양당 1.5밀리리터 반응튜브에 잘 결합하여 25.5 마이크로리터 PEI 스톡 용액을 37도에서 5분간 배양할 수 있습니다.다음으로, 3마이크로그램의 플라스미드 DNA와 문화당 25밀리알라 나트륨 염화나트륨 100마이크로리터를 잘 결합하여 섭씨 37도에서 5분간 배양할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면 각 희석 된 PEI 시약의 전체 부피를 각 희석 된 플라스미드 솔루션과 37 °C의 25 분 배양시 부드러운 파이펫팅을 결합합니다. 인큐베이션 동안, C2C12 세포 배양물의 초월체를 항생제 나 혈청 없이 DMEM으로 대체한다.인큐베이션의 끝에서, 세포 배양 접시를 지속적으로 이동하면서, 물방울에 각 잘 각 투명 믹스의 전체 볼륨을 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 6시간 후, 각 웰의 배지를 완전한 DMEM으로 교체한다. 24시간 후, 전체 DMEM을 푸오마이신의 밀리리터당 5마이크로그램으로 보충한 선택 매체로 교체하고, 세포를 10~14일 동안 또는 안정적인 C2C12 세포가 관찰될 때까지 세포 배양 배양배로 돌려보도록 한다.그런 다음 푸오마이신의 밀리리터 당 5 마이크로그램이 존재하여 저세포 밀도 배양에서 푸오마이신 내성 C2C12 세포를 확장하고, 향후 사용을 위해 세포의 6~10개의 유리병을 냉동 보존한다. 분화를 위해 C2C12 세포를 준비하기 위해, 종자 1.5배 10~5차 안정형 푸오마이신 내성 C2C12 세포는 12웰 플레이트에서 잘 선택매체의 1밀리리터로, 배양이 95% 컨플루언물이 될 때까지 섭씨 37도,

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

테트라사이클린 반응성 렌티바이러스 shRNA 발현 시스템을 이용한 조건부 넉다운 세포 생성

이 동영상에서는 shRNA 렌티바이러스 벡터의 transduction을 수행하여 immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs)에서 안정적인 knockdown cell line을 얻는 방법을 보여줍니다.

짧은 헤어핀 RNA 매개 유전자 knockdown in iHSPCs In vitro: 특정 유전자 발현의 Knockdown을 위해 iHSPC에 렌티바이러스 기반 shRNA 발현 시스템 전달

inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

siRNA에 의한 유전자 침묵은 암 생물학을 더 잘 이해하기 위해 즉각적인 영향을 미치는 BRCA2 의존적 생물학적 기능을 분석하기 위한 편리한 실험 전략을 나타냅니다. 인간 세포주에서 면역 블로팅을 통해 BRCA2 단백질 발현의 변화를 검출하고 정량화하는 실험 절차와 함께 BRCA2를 효율적으로 침묵시키는 방법을 제시합니다.

의 침묵<em&gt; BRCA2</em&gt; 배양 된 인간 세포에 소설 BRCA2 규제 생물학적 기능을 확인하는

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

우리는 골격 근의 중재 된 손상과 자가 전달 siRNA의 주입의 조합을 사용하여 위성 세포에서 특정 유전자의 기능적 손실을 조사하는 생체 내 방법을 설명합니다.

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

본 연구에서, 발현은 특정 shRNA를 사용하여 PERK 경로의 두 가지 다운스트림 신호 전달 성분인 세포보호 칼시뉴린 및 프로-아폽토시스 CHOP의 녹다운됩니다. 반대로, 이들은 소포체 스트레스 유도 후 신경돌기 위축에 대한 일차 피질 뉴런의 감수성을 조절합니다.

소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.

렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

배우세요 C2C12 근강 세포주에서 shRNA를 이용한 유전자 안정적 녹다운 방법을. 근육 분화 과정에서 세포 외 매트릭스 단백질 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

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