Name: 면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 면역형광 현미경을 사용하여 고양이 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩을 식별하는 방법을. 이중 면역표지 기법과 열 유도 항원 회수를 활용하여 NETs 검출 능력을 향상시킵니다.

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연구 결과는 캘리포니아 대학, 데이비스, 반려동물 건강을 위한 센터 (CCAH 2018-30-F)에서 기금에 의해 지원되었습니다. 저자는 형광 현미경의 사용에 대한 케빈 울라드 박사를 인정하고 싶습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학교 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 조직의 부검 및 생검은 소유자의 동의하에 수행되었습니다.
1. 조직 고정, 포함 및 단면화
<ol><li>내림차순 대동맥, 대퇴 동맥 및 일반적인 선장동맥(그림1A)을포함한 대동맥 분기를 해부하고, 인도적인 안락사 또는 사망 직후에 해부한다. 무딘 근막(그림 1B)을해부하기 전에 10 % 중성 완충 포르말린에 완전히 담그기 전에 최소 24 시간 및 48 시간 이하.</li>
	<li>시료를 탈수시키기 위해, 먼저 10% 중성 완충포르민에 1시간 동안 37°C로 가열하여 침수한다. 그런 다음 37 °C (70 %, 95 %, 100 %)로 가열 된 에탄올농도가 증가하면 침수됩니다. 각각 1 시간 동안 2 x. 마지막으로, 헹구지 않고, 각각 1시간 동안 37°C로 가열된 100% 톨루엔에 2x를 담급전시.</li>
	<li>62°C로 가열된 파라핀을 넣고 파라핀이 밤새 완전히 굳어지도록 합니다.</li>
	<li>파라핀 내장 조직의 섹션 2-3 μm는 마이크로토메를 사용하여 양전하 유리 슬라이드위에 놓습니다. 추가 분석이 될 때까지 단면 조직을 -80 °C에서 저장합니다.</li>
</ol>2. 탈파화, 재수화 및 열 유발 항원 회수
<ol><li>유리 슬라이드에 섹션의 탈파화 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 놓고 다음 순서로 처리하십시오.<ol>
<li>3 분 동안 100 % 자일렌에 완전히 잠기. 이 단계를 2x 반복하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.</li>
		<li>에탄올 농도 감소 (100 %, 95 %, 70 %) 완전히 침수 실온(RT)에서 3분 동안 3회 사용하십시오. 단계 사이에 헹장피하지 마십시오.</li>
		<li>탈이온수에서 2분 동안 완전히 물에 담그다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트리스 버퍼링 식염수에 0.1 % 트위넨 (TBST, pH = 7.6)을 2-3 분 동안 넣습니다.</li>
	<li>100 °C로 가열 된 탈이온수로 저수지를 채웁니다. 증기선 챔버가 20분 동안 평형화되도록 하십시오. 참고: 열 유도 항원 회수는 식품 증기선과 같은 미리 설정된 온도 설정을 가진 증기선에 의해 생성된 간접 가열로 가장 잘 수행됩니다.</li>
	<li>트리스 및 EDTA(pH=9)를 함유하는 시판되는 항원 회수 용액을 일정한 교반과 함께 온도 제어 핫 플레이트상에서 95-97°C로 가열한다. 끓지 않는지 확인하십시오. 참고: 솔루션이 따뜻해지면 흐려져야 합니다.</li>
	<li>가열된 항원 회수 용액을 슬라이드 용기에 붓고 용기를 증기선 의 챔버에 놓습니다. 항원 회수 용액이 증기선 의 온도에 3-4 분 동안 평형화되도록 허용하십시오.</li>
	<li>가열 된 항원 회수 용액에 슬라이드를 완전히 담그고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속하십시오.</li>
	<li>증기선에서 슬라이드 용기를 제거하고 슬라이드 및 항원 회수 용액을 RT로 냉각시키십시오. 희석된 항원 회수 용액을 4°C에 저장하고 필요한 경우 최대 2x까지 재사용하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 TBST로 3x로 5분 동안 씻습니다.</li>
</ol>3. 면역 표지 및 자동 형광 담금질
참고: 표 1에서는 다음 단계에서 사용되는 차단 버퍼의 구성에 대해 자세히 설명합니다.
<ol><li>완만한 흔들림(30-50rpm)에서 RT에서 2시간 동안 블로킹 버퍼 1의 섹션을 인큐베이션합니다. 건조를 피하기 위해 파라핀 필름으로 밀봉하십시오.</li>
	<li>세척하지 않고, 희석된 토끼 폴리클로날 항인간 시트룰린화 히스톤 H3(citH3) 항체(블로킹 버퍼 1에서 희석된 0.03 mg/mL)를 슬라이드에 직접 100 μL을 직접 바릅니다.</li>
	<li>각 섹션에 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13-0.17 mm)을 배치하여 항체 혼합물을 균일하게 분배합니다.</li>
	<li>부드러운 흔들림 (30-50 rpm)으로 4 °C에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 건조를 피하기 위해 파라필름 필름으로 밀봉하십시오.</li>
	<li>TBST로 3x를 5분 동안 씻으소서.</li>
	<li>3.3단계에서 설명한 바와 같이 100 μL의 염소 항토끼 항체를 알렉사 플루어 488(0.04 mg/mL 또는 차단 완충액 1에서 1:50의 최종 농도로 희석)에 공액화하. 부드러운 흔들림 (30-50 rpm)에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다.</li>
	<li>TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.</li>
	<li>완충완충2에서 밤새 4°C에서 부드러운 흔들림(30-50 rpm)으로 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.</li>
	<li>완충3의 블로킹 섹션은 RT에서 2시간 동안 완만한 흔들림(30~50rpm)에 대해 3.3단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>생체 응모형 폴리클로날 토끼 항인간 NE 항체(최종 농도 = 차단 완충액 3에서 0.2 μg/mL)를 단계 3.2-3.4에 기재된 바와 같이 12-16시간 동안 4°C에서 배양한다.</li>
	<li>TBST 3x로 5분 동안 씻으소서.</li>
	<li>RT에서 3.2-3.3 에 대해 3.2-3.3 단계에 설명된 대로 Alexa Fluor 594 스트렙타비딘 접합체(블로킹 버퍼 3에서 0.02 mg/mL로 희석)로 배양하여 건조를 방지하기 위해 파라핀으로 보호하고 밀봉합니다.</li>
	<li>TBST 1x로 5분 동안 씻으소서.</li>
	<li>100 μL의 자동 형광 담금질 용액 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 1 분 동안 섹션에 직접 적용하십시오.</li>
	<li>즉시 10 분 동안 TBST 6x로 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	<li>각 슬라이드를 300 nM DAPI의 100 μL로 어둠 속에서 5 분 동안 덮습니다.</li>
	<li>TBST로 3분 동안 씻으면 총 5x동안 반복합니다.</li>
	<li>안티페이드 장착 매체의 드롭(~50 μL)을 오토플루오르전 담금질 키트의 일부를 섹션 주변의 유리 슬라이드에 직접 바하십시오. 기포를 만들지 않고 커버슬립(24mm x 40mm x 0.13~0.17mm)을 부드럽게 섹션에 놓습니다.</li>
	<li>침지 렌즈로 현미경 분석을 위해 장착 매체가 경화될 때까지 시료가 4°C에서 어두운 환경에서 밤새 경화될 수 있도록 하십시오.</li>
</ol>4. 호중구 세포 외 트랩 식별
참고: 다음 프로토콜은 1,280 x 960 디지털 CCD 카메라가 있는 반전된 epifluorescence 현미경을 사용합니다(재료 표참조).
<ol><li>혈전을 찾으려면, 10배 의 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 대동맥, 대동맥 분기 및 각 대퇴 동맥의 길이를 따라 두개골을 스캔합니다. 혈전은 상 대비 및 밝은 필드 현미경 검사법에 내피에 인접한 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 조직의 conglomeration이다(그림 2A, 도 2B).</li>
	<li>먼저 10x 및 20x목표(그림 2C)를사용하여 DAPI 채널(여기 = 357/44nm)을 사용하는 NET 섹션을 검사합니다. cfDNA는 단계 대조 또는 밝은 필드 현미경 검사법에 볼 때 세포의 세포질의 경계 안에 있지 않은 decondensed DNA로 나타납니다.</li>
	<li>텍사스 레드 채널(여기 = 585/29 nm, 방출 = 628/32 nm)과 녹색 형광 단백질 채널(여기 = 470/22 nm, 방출 = 525/50 nm)에서 세포외 NE 및 citH3을 각각 10, 20 및 40x 목표와 식별합니다.</li>
	<li>이미지 J(NIH)와 같은 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 혈전 내의 NET를 평가하고 분석합니다. NET 형성은 앞서 설명한 바와 같이 cfDNA, 세포외 citH3 및 NE의 공동 국소화에 기초하여 확인된다18. 픽셀 강도의 채도를 피하기 위해 이미지 수집 을 통해 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다.</li>
	<li>대역에서 가장 가까운 영역 1, 대공에서 가장 먼 영역 3, 영역 1과 3 사이의 영역 2로 나누어 내림차순 대원과의 근접성을 기반으로 각 혈전을 매핑합니다. 작업자가 각 과목의 건강 상태를 눈멀게 하면 각 구역에서 최소 10개의 무작위 필드를 가져가십시오. 각 영역에서 NET이 있는 필드의 수를 평균화하거나 영역당 평균 NET 점유 영역을 계산하여 트롬비에서 NET 분포를 특성화합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 이중 면역 표지 프로토콜 및 면역 형광 현미경 검사법을 사용하여 고정 된 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 비록 심인성 동맥 혈전만 얼룩이 있었지만, 이론적으로이 프로토콜은 다른 유형의 트롬비와 다른 수의종에 사용될 수 있습니다. 고양이 동맥 혈전 내의 NET를 식별하는 것은 NET가 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
고정 및 파라핀 내장 조직에서 면역형광에 의한 NET의 검출은호중구(13)로둘러싸인 염색질의 실을 종종 보여주는 H&E와 같은 기존의 조직학적 얼룩보다 우수하다. 고정 된 동맥 혈전의 면역 조직 화학 및 면역 형광은 CitH3와 같은 cfDNA 및 기타 세포 외 단백질의 동시 검출을 허용하며, NETs 형성18,,19에특이적인 것으로 알려져 있다. 저온 제제는...

비대성 심근병증을 가진 고양이는 생명을 위협하는 혈전색전성 합병증1,,2의위험이 있습니다. 고양이 심인성 동맥 혈전 색전증 (CATE)과 관련된 높은 사망률및 사망률에도 불구하고 고양이의 CATE의 근본적인 병리학은 제대로 이해되지 않습니다. 이 치명적인 상태의 위험에 고양이를 치료하고 식별하는 제한된 진단 및 치료 도구도 있습니다3.
선천성 면역에 있는 그것의 역할 이외에, 호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NETs)를 풀어 놓음으로써 혈전증에 있는 역할을 하기 위하여 보였습니다, 이는 호중구 엘라스타제 (NE) 및 골수로파소와 같은 히스톤과 과립 단백질로 둘러싸인 무세포 DNA (cfDNA)의 웹 같은 네트워크인. 호중구는 전신 염증, 병원균과의 직접적인 만남 및 활성화 된 혈소판과의 상호 작용에 대한 응답으로 NETs 형성을 겪습니다4,,5,6,,7. 개에서 호중구 유래 DNA는 응고 용해를 억제하는 것으로 나타났으며 NET 단백질은 혈전 형성을 가속화합니다. 순환 세포 및 응고 성분을 트랩하는 NET의 능력은 또한 혈전 특성8,,9,10,,11,,12의핵심입니다.,
NET는 세포외 호중구 단백질, 히스톤 및 cfDNA의 동국화에 의해 검출됩니다. 이 때문에, 탈파라핀화된 조직의 면역형광에 의한 고정된 조직에서 의한 NET의 식별 및 정량화는 밝은 필드 현미경 을 사용하여 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 얼룩보다 우수하다4,,5. 면역형광 현미경을 이용한 여러 인간 연구는 관상동맥 혈전, 대뇌 뇌졸중 혈전, 아테로스롬보증 및 정맥혈전13,,14,,15,,16,,17의구조적 성분으로 NETs를 확인하였다. 현재까지, 고양이 혈전에서 NET를 검출하고 정량화하는 표준화된 방법은 기술되지 않았다. 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하면 NET및 혈전증의 향후 번역 연구를 촉진 할 수 있기 때문에, 우리는 고양이의 파라핀 내장 동맥 혈전에서 NET 식별 및 평가의 기술을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>4,6-디아미디노-2-페닐린 (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Catalog # S11227</td><td></td></tr><tr><td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 세포 이미징 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 이미징 시스템 목표 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4681</td><td>NA 0.25, WD 6.9/7.45mm</td></tr><tr><td>EVOS 이미징 시스템 목표 20x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4682</td><td>NA 0.40, WD 6.8mm</td></tr><tr><td>EVOS 이미징 시스템 목표 40x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4699</td><td>NA 0.75, WD 0.72mm</td></tr><tr><td>염소 anti-rabbit Alexa Fluor 488 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>카탈로그 # A32723</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>카탈로그 # NC9660079. 제조업체 부품 # 005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>호중구 엘라스타제 항체</td><td>Bioss 항체</td><td>Bs-6982R-Biotin</td><td>Rabbit polyclonal 항체, Biotin conjugated</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Pierce</td><td>제품 # 28324. Lot # EJ64292</td><td></td></tr><tr><td>양전하 현미경 슬라이드</td><td>Thomas Scientific</td><td>제조업체 번호 1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>토끼 혈청</td><td>Life Technology</td><td>Catalog # 10510</td><td></td></tr><tr><td>타겟 검색 솔루션</td><td>Agilent Dako</td><td>S2367</td><td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td></tr><tr><td>TrueVIEW 자가 형광 담금질 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr></tbody></table>

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

무세포 DNA(cfDNA)와 히스톤 및 호중구 엘라스타아제(NE)와 같은 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NETs)은 전신 염증이나 병원체에 반응하여 호중구에 의해 방출됩니다. NET는 이전에 인간과 개에서 혈전 형성을 증가시키고 섬유소 용해를 억제하는 것으로 나타났지만, 비대성 심근증에 이차적인 생명을 위협하는 합병증인 심인성 동맥 혈전색전증 (CATE)을 가진 고양이의 NET의 역할 을 참조하십시오. 고양이의 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하고 정량화하는 표준화된 방법은 CATE에서의 병리학적 역할에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 여기에서, 우리는 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 혈전에서 NET를 식별하는 기술을 설명합니다 대동맥 분기 내에서, 부검 중에 추출. 자일렌으로 탈파화 한 후, 대동맥 절은 간접 열 유발 항원 검색을 시행했다. 단면도는 그 때, 투과되고, ex vivo NETs는 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 무세포 DNA (cfDNA), 시트룰린화된 히스톤 H3(citH3), 및 호중구 엘라스타제(NE)의 공동 국소화에 의해 확인되었다. 혈전에서 NET의 면역 검출을 최적화하기 위해, 조직 원소의 자가형광은 현미경 검사법 전에 자가형광 담금질 과정을 사용하여 제한되었다. 이 기술은 그밖 종에 있는 NETs 그리고 혈전증을 공부하는 유용한 공구일 수 있고 이 복잡한 조건의 병리생리학에 새로운 통찰력을 제안합니다.

파라핀화, 열 유발 항원 회수 및 파라핀 내장 트롬비의 이중 면역 라벨링을 위해 이 프로토콜을 사용하여 고양이 CATE에서 처음으로 NET를 확인했습니다. 대동맥 분기 내의 Thrombi는 표준 H&amp;E 염색 및 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 형광 현미경 검사법 및 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 위치했습니다. 밝은 필드 현미경 검사법에, 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 이루어져 있습니다(그림 3A). H&amp;E는 특정 NET 구성 요소를 더럽히지 못하지만, NET는 근처의 적혈구와 백혈구를 둘러싼 다양한 길이의 깊은 보라색 스레드네트워크로 자주나타났습니다(그림 3A,점선 윤곽선). 혈전은 상 대비 현미경 검사법에 대한 혈관 공간 내에서 잘 비경계구조로 특징지어졌다(도2A, 도 4B).</st...

우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

파라핀 에베디드 대동맥 섹션의 항원 회수에 이어 파라핀 삽입 대동맥 절제물의 이러한 프로토콜은 고양이 혈전증에서 호중구 삼세포 트랩의 역할을 연구하는 유용한 도구가 될 수 있다. 고정 및 파라핀 임베디드 조직에서 면역 형광에 의한 호중구 삼세포 트랩의 검출은 HNE와 같은 기존의 조직학적 스텐트보다 우수하며, 안전한 DNA 및 세포 외 단백질의 동시 검출을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 혈전 및 기타 수의종에서 사용할 수 있습니다.고양이 동맥 혈전 내에서 호중구 세포 외 트랩의 식별은 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 여기에 제시된 프로토콜은 지침입니다. 우리는 연구원이 만족스러운 신호를 산출하기 위해 항원 검색 과정의 지속 시간과 조건을 조정하는 것을 강력히 권장합니다.자동화된 시스템을 사용하여 유리 슬라이드의 섹션의 분리 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 배치합니다. 3 분 동안 100 % 식염수에 완전히 잠급. 이 단계를 두 번 반복합니다.단계 사이에 헹지 마십시오. 실온에서 에탄올 농도를 3분씩 3회 감소시키는 데 완전히 잠급한다. 2 분 동안 탈이온 된 물에 완전히 잠그고 한 번 더 반복하십시오.TBST로 처리 한 후, 100섭씨까지 가열 된 탈이온 된 물로 저수지를 채웁니다. 증기선이 20분 동안 평형화되도록 합니다. 열판에서 트리스와 EDTA를 포함하는 시판가능한 항원 검색 용액을 pH 9.0 ~ 95 ~97도에서 가열합니다.끓지 않도록 하십시오. 가열된 항원 검색 용액에서 슬라이드를 완전히 구부리고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속합니다. 다음으로 TBST로 슬라이드를 3번 세척하여 5분간 세척합니다.이제 섹션을 차단 버퍼 1에 배치합니다. 30~50rpm 사이의 부드러운 흔들림 아래 실온에서 2시간 동안 배양하세요. 세척없이 즉시 희석 된 토끼 폴리클론 항인간 시트룰러 히스톤 H3 항체100 마이크로 리터를 슬라이드에 직접 적용하십시오.항체 혼합물의 균일한 분포를 허용하기 위해 각 섹션에 커버 슬립을 놓습니다. 부드러운 흔들림으로 섭씨 4도에서 12~16시간 동안 배양하세요. 그 후, 매번 TBST로 슬라이드를 세 번 씻습니다.항체를 적용하려면 파이펫을 사용하고 알렉사 플루어(488)에 공주된 염소 항토끼 항체 100마이크로리터를 고르게 분배한다. 주석 호일로 슬라이드를 덮고 부드러운 흔들림 아래 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 원고에 따르면 TBST로 세척 한 후 완충2를 막는 섹션을 부드러운 흔들림 아래 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.빛으로부터 보호하십시오. TBST로 매번 5분간 세 번 씻으시면 됩니다. 완충제 3을 차단하는 섹션을 부드러운 흔들림 아래에서 2시간 동안 실온에서 했던 것처럼 차단합니다.이전에 설명한 바와 같이 12~16시간 동안 4도에서 비오틴 래드 계포계종 토끼 항인간 호중구 엘라스타제 항체로 섹션을 배양한다. TBST로 세척한 후 알렉사 플루어 594 스트렙타비딘 컨쥬게이트와 함께 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 후, TBST로 5 분 동안 한 번 씻으시면 됩니다.제조업체의 지시에 따라 1분 동안 1분 동안 100마이크로리터의 오토플루오레스향 담금질 용액 혼합물을 섹션에 직접 적용합니다. TBST로 슬라이드를 매번 10분 동안 6회 즉시 세척합니다. 각 슬라이드를 300 나노몰러 DAPI의 100마이크로리터로 5분간 덮습니다.그런 다음 TBST로 매번 3분간 5회 세척합니다. 단면을 둘러싼 유리 슬라이드에 직접 페이드 장착 매체한방울을 발라주세요. 거품을 만들지 않고 커버 슬립을 섹션에 부드럽게 놓습니다.샘플이 섭씨 4도에서 어둠 속에서 하룻밤 동안 치료하도록 허용하십시오. 혈전을 찾으려면 대동맥, 대동맥 분비화 및 각 태아 동맥의 길이를 따라 10배 의 목표를 가진 위상 대비 현미경 검사를 사용하여 소생하여 스캔합니다. 먼저 357 및 44 나노미터에서 여기를 가진 DAPI 채널을 사용하여 세포없는 DNA에 대한 섹션을 검사합니다.텍사스 적색 및 녹색 형광 단백질 채널에서 세포외 호중구 엘라스테아제및 시트룰러 히스톤 H3를 각각 식별합니다. 픽셀 강도의 포화를 방지하기 위해 이미지 수집 기간 동안 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다. 호중구 세포 외 트랩은 호중구 엘라스테아제, 시트룰러 히스톤 H3 및 세포 없는 DNA의 기반 공동 국소화를 확인합니다.헤마톡시린과 에오신 얼룩, 그리고 브라이트필드 현미경검사를 사용하여 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 구성됩니다. NET는 근처의 적혈구와 백혈구를 둘러싼 다양한 길이의 깊은 보라색 스레드의 네트워크로 나타났습니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역 형광 현미경 검사법은 세포없는 DNA, 세포 외 세포 세포 석회 분해 히스톤 H3 및 호중구 엘라스타아제로 구성된 NET의 큰 골재를 밝혀냈습니다.면역 현미경 검사법의 위상 대조하에서, 혈전은 혈관 공간 내의 잘 경계구조로 특징지어졌다. 그러나, 혈전은 어떤 대조군 샘플에서도 검출되지 않았다. 이 그림은 488 나노미터 파장에서 이미지될 때 적혈구와 같은 응고 원소의 심오한 자동 형광을 보여줍니다.면역 라벨링 후 간단한 자동 불발 담금질은 적혈구가 풍부한 지역에서도 단백질 공동 국소화 및 NET 검출의 감도를 크게 증가시켰습니다. 고정 의 지속 기간은 특정 항원의 면역 반응성. 24시간 이상 탈수와 파라핀 포함을 하지 않는 것이 좋습니다.또는 메탄올이 없는 파라포름알데히드는 포름알데히드산화로부터 포름산과 케톤에 의해 유물을 제한하는 데 사용될 수 있다. 동일한 종에서 유래된 1차 항체를 사용할 때 간섭을 방지하기 위해, 우리는 이차 항체에 남아있는 결합 부위를 포화시키는 추가 차단 단계를 포함했다. 조사원은 등류형 항체로 구성된 부정적인 통제, 1 차적인 항체 및 면역 라벨링 단계 및 혈전증없이 고양이의 생물학적 통제를 배제해야 합니다.혈전염의 조직 한계의 자동 불발성은 호중구 세포 외 트랩의 현미경 식별을 망치 수 있습니다. 조사자는 극한형형광을 사용하여 형광을 최소화할 수 있다. 이 기술은 그밖 수의학 종에 있는 호중구 세포 외 덫의 연구를 위한 귀중한 공구일 수 있습니다.이것은 혈전증의 병리생리학의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

identification-neutrophil-extracellular-traps-paraffin-embedded

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

여기에서는 DIG 표지된 16S rRNA 표적 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 포매 조직 내에서 박테리아를 국소화하는 방법이 설명되었습니다. 이 프로토콜은 치주염, 암, 염증성 면역 질환과 같은 다양한 질병에서 박테리아의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

우리는 여기서 획득 및 호중구 유래 거 식세포의 새로운 특징 모집단을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 세포는 신선한 인간의 혈액 호중구에서 문화를 개발하고, 식균 작용, 자식 작용, 상당히 큰 크기, 확장 된 수명을 특징으로한다. 이 방법은 또한 독특한 호중구 유래 모집단을 조사하기 위해 필수적이다.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

배우세요 면역형광 현미경을 사용하여 고양이 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩을 식별하는 방법을. 이중 면역표지 기법과 열 유도 항원 회수를 활용하여 NETs 검출 능력을 향상시킵니다.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

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