Name: 활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 마우스 피부에서 mALA 크림과 적색광을 이용한 활성 산소 종(ROS) 유도 방법으로 조직 재생 및 모발 성장을 촉진하는 기전을 탐구하는 실험 기법입니다.

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이 작업은 스페인의 Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 to JE) 및 Instituto de Salud Carlos III (PI15 / 01458 to JE)의 보조금으로 지원되었습니다. EC는 Atracción de Talento Investigador 보조금 2017-T2 / BMD-5766 (Comunidad de Madrid 및 UAM)의 지원을 받았습니다.

모든 마우스 사육 및 실험 절차는 동물 실험에 관한 지역, 국가, 국제 법률 및 지침에 따라 수행되어야합니다.
1. 꼬리 피부 상피 wholemounts에 있는 모발 성장, 화상 유도 및 장기 BrdU LRCs의 동정의 유도
참고: 아래에 설명된 실험 설계를 위해 10일 또는 7주 된 C57BL/6 마우스, 가급적이면 새끼를 사용하십시오. 모든 실험 절차에서 동물은 표시된 대로 3% 이소플루란 흡입으로 마취되거나 자궁경부 탈구로 안락사됩니다.
<ol><li>두 번째 휴지기 (휴식) 단계 (출생 후 약 50 일)에서 마우스의 등 피부에서 모발 성장 유도<ol><li>3 % isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취하십시오. 페달 반사의 부족(단단한 발가락 꼬집음)으로 완전한 심부 마취를 확인합니다. 헤어 클리퍼와 제모 크림을 사용하여 각 단일 마우스에서 등 피부의 두 개의 독립적인 영역을 나란히 면도합니다(Table of Materials). 왼쪽은 대조군으로, 오른쪽은 치료에 사용하십시오. 참고: 면도 후 등 아래 피부가 분홍빛을 띠고 회색/검은색이 아닌지 확인하는데, 이는 이 마우스 균주에서 멜라닌 생성 및 성장기(성장) 단계로의 진입을 나타내는 지표입니다.</li>
		<li>PBS로 철저히 세척하여 모든 크림 잔여물을 제거하고 섹션 2.1에 설명된 대로 치명적이지 않은 ROS 수준의 일시적인 현장 생산 유도를 진행합니다.</li>
		<li>각 동물의 대조군 및 처리된 등 피부 부위의 고해상도 이미지를 매일 획득하여 모낭 성장을 기록합니다(예: 5-20x 쌍안경 렌즈에 연결된 HD 카메라 사용).</li>
	</ol></li>
	<li>두 번째 휴지기(휴식) 단계(출생 후 약 50일)에서 생쥐의 등 피부에서2도 화상 병변 유도<ol><li>마우스를 마취하십시오. 머리 깎기와 제모 크림을 사용하여 각 단일 마우스의 등 피부 부위 전체를 면도하고 PBS로 철저히 씻어 크림 잔여물을 모두 제거합니다. 참고: 연소 절차 직전에 멸균 식염수에 리도카인 0.5%(2mg/ml)를 7mg/ml를 초과하지 않는 현장 피하 주사를 투여합니다.</li>
		<li>끓는 물에 담가 황동 막대(단면 1cm)를 95°C로 예열한 다음 각 마우스의 등쪽 피부 표면의 중앙 영역에 5초 동안 적용합니다.</li>
		<li>화상 발생 직후, 탈수를 방지하기 위해 전기 담요에 생리 용액 (0.9 % NaCl) 1mL를 동물에게 복강 주사합니다. 동물이 24시간 동안 회복되도록 하고 섹션 2.3에 설명된 대로 치명적이지 않은 ROS 수준의 일시적인 현장 생산 유도를 진행합니다.</li>
		<li>각 동물의 대조군 및 치료된 등 피부 부위의 고해상도 이미지를 매일 획득하여 화상 상처 진행을 기록합니다(예: 5-20x 쌍안경 렌즈에 연결된 HD 카메라 사용).</li>
	</ol></li>
	<li>꼬리 피부 상피에서 장기 BrdU LRC의 생성 및 식별<ol><li>10/14일 된 새끼를 PBS에 용해된 50mg/kg 체중 BrdU로 연속 4일 동안 하루에 한 번 복강내(마취 없음) 주사합니다. 라벨링 단계 후, 치료 전에 50-60 일 동안 마우스가 자랄 수 있도록하십시오. 알림: 주사할 때마다 새 바늘을 사용하십시오.</li>
		<li>조직 전체 마운트를 준비하기 전에 다른 시간에 꼬리 피부에서 일시적인 제자리 비치명적 ROS 생산 유도에 대해 섹션 2.3에 설명된 대로 진행합니다.</li>
		<li>꼬리 표피의 전체 마운트를 준비하려면 자궁 경부 탈구로 생쥐를 안락사시키고 수술 용 가위로 꼬리를 자릅니다.<ol><li>메스를 사용하여 꼬리 전체를 똑바로 세로 절개하고 척추에서 피부 전체를 한 조각으로 벗겨냅니다. 박리된 피부를 37°C에서 4시간 동안 5mL 튜브의 PBS 중 5mM EDTA로 인큐베이션하고 집게를 사용하여 진피에서 손상되지 않은 표피 시트를 조심스럽게 분리합니다.</li>
			<li>실온(RT)에서 최소 72시간 동안 PBS의 4% 포름알데히드에 조직을 고정하고 적절한 항체를 사용하여 BrdU 검출을 진행합니다.</li>
			<li>형광/공초점 현미경을 사용하여 앞서 자세히 설명한 바와 같이 조직 전체 마운트를 준비하기 전에 서로 다른 시간에 광 제어 및 광역학 처리를 포함하여 각 실험 조건에서 LRC를 식별하고 정량화합니다(앞서 자세히설명한 바와 같이). 참고: 고정 표피 시트는 0.02°C에서 4% 아지드화나트륨이 함유된 PBS에 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 고정된 표피 시트는 표준 조직학적 절편 절차에 따라 필요한 단백질의 면역국소화에 사용될 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 피부에서 치명적이지 않은 ROS 수준의 일시적인 생산 유도
참고: 마우스 피부에서 치명적이지 않은 ROS 수준의 일시적인 생성을 유도하기 위해 내인성 광감작제 PpIX, 이 경우 메틸-아미노레불리네이트(mALA)의 전구체를 사용한 광역학 치료 및 적색광이 사용됩니다.
<ol><li>등 피부의 모발 성장 유도를 위해 일시적인 ROS 생산을 켜려면 섹션 1.1에 표시된 대로 동물을 준비합니다.<ol><li>~25mg의 mALA를 오른쪽 부위에 국소 크림(재료 표) 형태로 바르고 왼쪽은 내부 대조군으로 유지하여 개인차를 피합니다. 어둠 속에서 2.5 시간 동안 배양하고 PBS로 여분의 크림을 완전히 씻어 내십시오. 마취 깊이를 확인하려면 완전히 회복 될 때까지 10 분마다 동물을 모니터링하십시오. 참고: 후면 피부에서 PpIX의 생성은 청색광(407nm) 여기 하에서 적색 형광으로 현장에서 테스트해야 합니다.</li>
		<li>동물을 마취하십시오.</li>
		<li>2.5-4 J/cm2의 총 선량에 대해 적절한 적색 광원(재료 표)으로 등 피부 전체를 조사합니다. 마우스가 완전히 회복 될 때까지 전기 담요에 마우스를 보관하고 1.1.3 단계에 설명 된대로 진행하십시오. 알림: 광원과 조직 사이의 거리를 조작하여 방사 조도를 조정하고 전력 에너지 미터(재료 표)를 사용하여 측정해야 합니다. 실험은 각 동물의 독립적인 면도 부위 중 어느 하나에서 완전한 모발 성장이 관찰될 때 완료된 것으로 간주된다. 전체 절차에는 단 한 번의 사진 처리가 포함됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2도 화상 병변의 치유 개선을 위해 일시적인 ROS 생산을 켜려면 섹션 1.2에 표시된 대로 동물을 준비하십시오.<ol><li>약 25mm의 인접 조직을 포함하는 화상 표면 전체에 국소 크림 형태로 ~4mg의 mALA를 바릅니다. 어둠 속에서 2.5 시간 동안 배양하고 PBS로 여분의 크림을 완전히 씻어 내십시오. 마취 깊이를 확인하려면 완전히 회복 될 때까지 10 분마다 동물을 모니터링하십시오.</li>
		<li>동물을 마취하십시오.</li>
		<li>2.5-4 J/cm2의 총 선량에 대해 적절한 적색 광원으로 등 피부 전체를 조사합니다. 마우스가 완전히 회복 될 때까지 전기 담요 위에 마우스를 보관하고 1.2.4 단계에 설명 된대로 진행하십시오. 참고: 각 동물에 대한 실험 절차는 완전한 화상 치유가 관찰되면 완료된 것으로 간주됩니다. 전체 절차에는 단 한 번의 사진 처리가 포함됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>꼬리 피부에서 일시적인 ROS 생성을 켜려면 섹션 1.3에 표시된 대로 마우스를 준비하고 등쪽 조직 영역 전체에 국소 크림 형태로 ~25mg의 mALA를 바르고 등 피부에 대해 섹션 2.1에 설명된 대로 진행합니다. 동물 안락사 24시간, 48시간 또는 72시간 전에 사진 처리 및 해당 조명 제어를 수행하고 꼬리 피부 전체 마운트를 추가로 추출합니다. 참고: 모든 실험 설계에서 항산화제 ROS 제거제를 사용하여 공정의 ROS 의존성을 분석합니다(예: mALA 치료 5일 전부터 PBS, pH 7.2에 20mg/mL 용액을 복강내 주사하여 100mg/kg 체중 N-아세틸-시스테인을 매일 접종하거나 50% 에탄올에 100mg/mL 아스코르브산을 2회 투여합니다. 30분 간격으로, mALA 치료와 적색광 조사 사이의 시간 간격으로 피부에 국소적으로 도포).</li>
</ol>3. 피부의 ROS 검출
<ol><li>하이드로에티딘을 이용한 광역학 치료 후 꼬리 피부에서 ROS 생산의 생체 외 평가 참고: 히드로에티딘은 ROS와 특이적으로 반응하여 형광 염료 2-하이드록시에티듐(hET)을 생성하는 비형광 분자입니다.<ol><li>섹션 1.3.3에 기재된 바와 같이 수득된 전체 꼬리 피부를 PBS 용액 (대조군 샘플) 중 5 mM EDTA 중에서 37°C에서 3시간 동안 또는 추가로 2 mM mALA (광역학 처리 샘플)를 함유하는 배양한다.</li>
		<li>모든 경우에 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 25mg/mL 스톡에서 최종 농도 3.2μM까지 하이드로에티딘을 추가하고 실온에서 암실에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>손가락 끝을 사용하여 유리 표면 위에 꼬리 피부 샘플을 늘리고 10J/cm2 플루언스에서 636nm 적색광을 조사합니다.</li>
		<li>즉시 진행하여 진피에서 표피를 분리하고 섹션 1.3.3에 설명된 대로 표피 시트를 고정합니다.</li>
		<li>녹색 여기광을 사용하여 형광/컨포칼 현미경으로 hET 적색 방출을 평가하고 고품질 이미지를 캡처하고 추가 분석을 진행합니다. 참고: 광역학 치료가 없는 상태에서 조직 샘플의 hET 염색을 hET 자가산화에 대한 음성 대조군으로 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>모발 성장 유도 및 화상 치유 후 광역학 치료 후 뒷피부에서 ROS 생성의 생체 내 검출 참고: 이 단계는 세포 내 에스테라제 효소에 의한 절단 후 ROS와 특이적으로 반응하여 2′,7′-디클로로플루오레세인(DCF) 형광 염료를 생성하는 세포 투과성 비형광 화합물인 2′,7′-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(DHF-DA)를 사용하여 수행됩니다.<ol><li>모발 성장 유도 (섹션 1.1) 또는 화상 치유 (섹션 1.2)를 위해 준비된 동물을 사용하십시오. 국소 mALA 크림 트리트먼트(섹션 2.1 및 2.2 참조) 직전에 모든 표적 대조군/처리된 피부 부위에 DHF-DA의 50% 에탄올에 1mg/mL 100μL를 국소적으로 분주하고 피부가 물질을 완전히 흡수하도록 하고 국소 mALA 크림 적용을 진행합니다.</li>
		<li>처리된 동물을 어두운 곳에서 4시간 동안 배양하고 국소 mALA 크림을 PBS로 피부에서 완전히 씻어내고 DHF-DA 용액 100μL의 두 번째 용량을 피부에 분배합니다. 마취 깊이를 확인하려면 완전히 회복 될 때까지 10 분마다 동물을 모니터링하십시오.</li>
		<li>처리된 동물을 어둠 속에서 50분 동안 배양하고, LED 램프를 사용하여 636nm 적색광의 2.5 내지 4 J/cm2 범위의 플루언스로 등 피부 전체를 마취시키고 조사한다.</li>
		<li>방사선 조사 직후, 생체 내 이미징 시스템(Table of Materials)을 사용하여 피부에서 생성된 ROS 수준을 평가한다. 445-490 nm 여기 및 515-575 nm 방출에 대한 필터 박스를 설정하고 고품질 이미지를 캡처하고 추가 분석을 진행합니다. 참고: DHF-DA 자가산화에 대한 음성 대조군으로 광역학 치료가 없는 상태에서 조직 샘플의 DHF-DA 염색을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

이 작업에 설명된 절차의 모든 상업적 적용은 EC, MIC 및 JE가 저술하고 상업적 이용을 위해 Derma Innovate SL에 라이선스가 부여된 CSIC-UAM 특허(EP2932967A1)에 의해 보호됩니다. JE와 JJM은 Derma Innovate SL에서 자문 직책을 맡고 있습니다.

여기에서 우리는 생리학적 효과와 함께 마우스 피부에서 생체 내에서 내인성 ROS 생산의 일시적인 활성화를 허용하는 방법론을 제시합니다. 이 방법론은 내인성 광감작제 PpIX의 제어된 국소 자극을 유도하기 위한 광역학 절차를 기반으로 합니다(그림 1B). 이 실험적 접근 방식은 외부 ROS 소스(일반적으로 과산화수소)를 사용하고 조직/샘플에서 ROS의 제어된 국소 생산을 허용하는 방법론에 비해 상당한 발전을 구성하는 생체 내 실험 시스템에서 ROS 생물학을 연구하는 흥미로운 도구입니다.
아미노레불리네이트 기반 전구체가 세포 내 PpIX의 축적을 촉진하기 위해 과도하게 투여된다는 점을 감안할 때, 이 방법론의 중요한 단계는 손상 역치 미만이지만 강력한 자극 효과를 나타내는 조직에서 ROS 수준의 일시적인 생성을 유도하기 위해 적절한 광 용량을 설정하는 것입니다. 현재 세포와 조직에서 생성되는 모든 유형의 ROS의 정확한 양을 직접...

활성 산소종(ROS)은 분자 산소가 화학적으로 환원되어 물을 형성한 결과이며 일중항 산소, 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 하이드록실 라디칼 1,2,3을 포함합니다. ROS는 화학적 반응성이 매우 높기 때문에 수명이 매우 짧습니다. 호기성 유기체에서 ROS는 미토콘드리아에서 호기성 호흡(전자 수송 사슬)의 주요 누출 부산물로서 세포 내부에 부수적으로 형성됩니다. 세포에 높은 수준의 ROS가 일시적으로 축적되면 단백질, 지질 및 당의 돌이킬 수 없는 비활성화와 DNA 분자 2,3,4,5에 돌연변이가 도입될 수 있는 산화 스트레스 상태가 발생합니다. 세포, 조직 및 전체 유기체에서 산화적 손상의 점진적인 축적은 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하며 세포 사멸 프로그램의 유도, 여러 병리 및 노화 과정과 관련이 있다 2,3,4,6.
호기성 유기체는 세포와 조직의 과도한 ROS 축적을 해결하기 위해 효율적인 분자 메커니즘을 꾸준히 발전시켜 왔습니다. 이러한 메커니즘에는 슈퍼옥사이드 라디칼 분해를 분자 산소 및 과산화수소로 촉매하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 단백질 패밀리의 구성원과 항산화 풀(글루타티온, NADPH, 퍼옥시레독신, 티오레독신 7,8)을 사용하여 과산화수소가 물 및 분자 산소로 전환되는 것을 촉매하는 다양한 카탈라아제 및 과산화효소가 포함됩니다.
그러나 여러 보고서는 증식, 분화 및 이동성을 포함하여 중요한 세포 기능을 조절하는 분자 회로의 핵심 구성 요소로서 ROS의 역할을 지지합니다 2,3,4. 이 개념은 리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 및 NADPH 산화효소 9,10을 포함한 호기성 유기체에서 전용 ROS 생성 메커니즘의 초기 식별 및 특성화에 의해 추가로 뒷받침됩니다. 이러한 의미에서 ROS는 척추동물 배아 발달 동안 적극적인 역할을 나타내며 11,12,13 특정 생체 내 생리학적 기능의 조절에서 이러한 분자의 핵심 역할은 초파리14의 조혈 전구체의 분화 프로그램, 제브라피쉬의 치유 유도 또는 제노푸스 올챙이 15의 꼬리 재생을 포함한 다양한 실험 시스템에서 보고되었습니다 . 포유류에서 ROS는 신경구 모델16에서 신경 줄기 세포의 자가 재생/분화 잠재력과 대장암 개시17 동안 장 줄기 세포 기능의 조절 완화에 관여했습니다. 피부에서, ROS 신호전달은 표피 분화 및 피부 줄기 세포 틈새 및 모낭 성장 주기의 조절과 관련이 있다18,19.
이러한 관점에서, 정상 또는 병리학적 조건 모두에서 생물학적 시스템에서 ROS의 생리학적 역할을 결정하기 위한 주요 실험적 한계는 세포와 조직에서 이러한 분자의 제어된 생산을 유도하기 위한 적절한 실험 도구가 부족하다는 것입니다. 현재 대부분의 실험적 접근법은 대부분 과산화수소 형태의 외인성 ROS를 투여하는 것입니다. 우리는 최근 내인성 광감작제 프로토포르피린 IX(PpIX; 예: 아미노라에불린산 또는 그 메틸 유도체 메틸아미노레불리네이트)의 전구체 투여를 기반으로 마우스 피부에서 내인성 ROS의 일시적이고 치명적이지 않은 생체 내 생산을 전환하고 세포 내 분자 산소로부터 ROS의 현장 형성을 유도하기 위해 샘플에 적색광을 추가로 조사하는 실험적 접근 방식을 구현했습니다(그림 1). 이러한 광역학 절차는 상주하는 줄기 세포 틈새를 자극하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 따라서 조직(19,20)의 재생 프로그램을 활성화하고 피부 재생 의학에서 새로운 치료 양식을 위한 길을 열어줍니다. 여기에서는 모낭의 팽창 영역에서 장기 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU) 표지 유지 세포(LRC)의 수의 증가로 측정된 줄기 세포 틈새 자극의 대표적인 예를 보여주는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제시합니다19,21, 및 일시적인 현상에 의해 유도된 재생 프로그램의 후속 활성화(모발 성장 및 화상 치유 과정의 가속화), C57Bl6 마우스 균주의 피부에서 치명적이지 않은 ROS 생성.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorofluorescin diacetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deoxiuridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory cream (e.g., Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo 이미징 시스템(예: 국소 크림 형태의 IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA, 예: METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전력 에너지 미터(예: ThorLabs 모델 PM100D)</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적색 광원(예: 636nm Aktilite LED 램프</td><td>광경화 ASA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin ix 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

여기에서 우리는 마우스 피부에서 내인성 활성 산소 종(ROS)의 전환 가능한 생체 내 광생성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. ROS의 이러한 일시적인 현장 생산은 줄기 세포 틈새에서 세포 증식을 효율적으로 활성화하고 화상 치유 및 모낭 성장 과정의 가속화를 통해 강력하게 나타나는 조직 재생을 자극합니다. 이 프로토콜은 내인성 감광제인 프로토포르피린 IX의 전구체로 조직을 치료하고 엄격하게 제어되는 물리화학적 매개변수 하에서 조직에 적색광을 추가로 조사하는 조절 가능한 광역학 치료를 기반으로 합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 ROS 생물학을 분석하는 흥미로운 실험 도구를 구성합니다.

마우스 등 및 꼬리 피부에 mALA 전구체를 국소 투여하면 청색광(407nm) 여기 하에서 이 화합물의 적분홍색 형광에 의해 입증된 바와 같이 전체 조직과 눈에 띄게 모낭에 PpIX가 상당히 축적됩니다(그림 2A, C). 2.5-4 J/cm2 의 플루언스에서 적색광(636nm)으로 처리된 조직을 연속적으로 조사하면 조직, 특히 모낭의 돌출 영역에서 ROS의 일시적인 생성이 촉진됩니다(그림 2B, D).
생체 내 마우스 피부에서 치명적이지 않은 ROS 생산을 켜면 사진 처리 이틀 후 모낭의 돌출 영역에서 체세포 줄기 세포로 분류되는 LRC 수의 상당한 증가가 촉진됩니다(그림 3, 왼쪽 패널). 특히, LRC 수의 증가는 일시적이며 치료 6일 후...

이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

당사의 방법론은 in vivo 조직에서 내인성 반응성 산소 종 또는 ROS 생성의 일시적인 활성화를 유도하는 신뢰할 수 있는 실험 도구를 제공하는 최초의 방법론입니다. 당사의 방법론은 기본적으로 적색 광원을 사용하여 피부에서 생리학적 자극 ROS 수준을 일관되게 생성하는 강력하고 사용자 친화적이며 비침습적인 절차를 제공합니다. 피부에 있는 ROS의 생리적인 감응작용이 조직 줄기 필요를 달성하는 때, 우리는 좋은 치유 및 머리 성장을 포함하여 피부 재생 치료를 위한 우리의 방법론을 더 적용했습니다.ROS 생물학 및 신호전달은 현재 연구 핫팟입니다. 생체 내에서 ROS 기능을 조사하는 데 있어 가장 큰 한계는 제어된 내인성 ROS 생산을 유도할 수 있는 적절한 도구가 없다는 것입니다. 당사의 방법론은 사용자 친화적이고 쉽지만 램프, IV, IS 등 모든 장치를 적절하게 보정해야 합니다.중요한 화학적 전구체는 신선해야 하며 모든 단계 또는 프로토콜을 엄격하게 따라야 합니다. 두 번째 휴지기 쥐의 등쪽 피부에서 모발 성장을 유도하기 위해 약 50일째 되는 날에 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후 출생 후 깔짚 메이트 C57 블랙 식스 마우스, 면도기와 제모 크림을 사용하여 각 마우스의 뒤쪽에서 나란히 있는 두 개의 독립적인 피부 부위를 제거합니다. 몇 분 후, PBS로 크림을 제거하고 각 동물의 대조군 및 처리된 등쪽 피부 영역의 고해상도 이미지를 매일 획득하여 모낭 성장을 기록합니다.두 번째 휴지기 마우스의 등 피부에 2도 화상 병변이 생성되도록 유도하려면 마우스 뒤쪽의 털을 제거합니다. 단면 1cm의 황동 막대를 끓는 물에 섭씨 95도로 예열하고 막대를 마우스 피부의 중앙 부분에 5초 동안 바릅니다. 화상 발생 직후, 탈수를 예방하고 치료를 진행하기 전에 마우스가 24시간 동안 회복할 수 있도록 동물에게 1ml의 생리학적 용액을 복강내 주사합니다.BrdU 표지 보유 세포 또는 LRC의 생성을 위해, 10일 또는 14일 된 새끼 짝을 하루에 한 번 4일 연속으로 복강내 주사하고 체중 1kg당 50mg의 BrdU를 PBS로 주입합니다. 라벨링 단계 후, 트리트먼트를 적용하기 전에 50-60일 동안 마우스가 발달하도록 합니다. 모발 성장 분석을 위해 마우스 피부에서 치명적이지 않은 활성 산소 종 또는 ROS 수준의 일시적인 생성을 유도하기 위해 기본 모발 성장 이미지를 획득한 후 오른쪽 면도 피부 부위에 약 25mg의 mALA 크림을 국소적으로 바르고 동물을 2.5시간 동안 어두운 곳에 둡니다.광감작제 치료 기간이 끝나면 PBS가 함유 된 여분의 크림을 철저히 제거하고 청색광 여기 하에서 적색 형광 발현으로 PP9 생산을 확인한 다음 평방 센티미터당 2.5-4 줄의 총 선량으로 적절한 적색 광원을 뒷 피부 전체에 조사합니다. 그런 다음 쥐가 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 전기 담요에서 회복하도록 한 후 동물을 우리로 되돌려 보냅니다. 2도 화상 치유를 위해 일시적인 ROS 생산을 켜려면 오른쪽 화상 표면을 따라 약 25mg의 mALA 크림을 바르고 약 4mm의 인접 조직을 바르고 시연된 대로 동물을 2.5시간 동안 어둠 속에 두십시오.크림을 제거한 후 등 피부 전체에 방사선을 조사하고 시연된 바와 같이 모니터링을 통해 마우스가 회복할 수 있도록 합니다. 꼬리 피부에서 일시적인 ROS 생성을 유도하기 위해, BrdU 처리된 마우스의 등쪽 조직 부위를 따라 약 25mg의 mALA 크림을 바르고 시연된 바와 같이 꼬리의 등쪽 피부를 조사합니다. 생쥐를 안락사시킨 후 BrdU 검출을 위해 꼬리 피부를 수확합니다.메스를 사용하여 각 동물의 꼬리를 채취한 다음 곧게 세로로 절개하고 등뼈에서 한 조각으로 전체 피부를 벗겨냅니다. 껍질을 벗긴 피부 조각을 5밀리몰 EDTA 및 PBS와 5밀리리터 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하여 겸자로 진피에서 온전한 표피 시트를 조심스럽게 분리할 수 있습니다. 분리된 조직을 4%포름알데히드와 PBS로 실온에서 최소 72시간 동안 고정합니다.그런 다음 각 실험 조건에서 LRC를 식별하고 정량화하기 위해 표준 프로토콜에 따라 형광 컨포칼 현미경 검사로 조직을 시각화하기 전에 관심 있는 형광 접합 항체로 고정 조직에 레이블을 지정합니다. ROS 생산의 생체 외 평가를 위해 시연된 바와 같이 쥐 꼬리 피부 조각을 수확한 후 대조군 미처리 조직과 5밀리몰 EDTA 및 PBS만 배양하고 2밀리몰 mALA를 보충한 EDTA의 광역학 처리 샘플을 배양합니다. 다음으로, 각 조직 세트에 3.2 마이크로몰 최종 농도로 하이드로에티딘을 추가하고 모든 샘플을 어두운 실온에서 1시간 동안 배양합니다.배양이 끝나면 손가락 끝을 사용하여 꼬리 피부 샘플을 유리 표면 위로 늘리고 처리된 조직에 제곱센티미터당 10줄의 플루언스로 636나노미터의 적색광을 조사합니다. 처리가 끝나면 즉시 진피에서 표피를 분리하고 상온에서 최소 72시간 동안 4%포름알데히드 및 PBS로 표피 시트를 고정합니다. 고정이 끝나면 녹색 여기광을 사용하여 형광 현미경으로 적색 2-하이드록시에티듐 방출을 평가하여 고품질 이미지를 획득할 수 있습니다.등쪽 피부에서 ROS 생성을 생체 내에서 검출하기 위해 적색광 조사 직후 모든 표적 제어 및 처리된 피부 부위에 1밀리리터당 1밀리그램 DH-FDA와 50% 에탄올 100마이크로리터를 도포합니다. mALA 전구체를 마우스의 등과 꼬리 피부에 국소적으로 투여하면 전체 조직과 모낭에 프로토포르피린 IX가 현저하게 축적되며, 이는 청색광 여기 하에서 이 화합물의 적분홍색 형광에 의해 입증됩니다. 이후에 처리된 조직에 적색광을 조사하면 조직 내에서, 특히 모낭의 돌출 영역에서 ROS의 일시적인 생성이 촉진됩니다.생체 내 마우스 피부에서 치명적이지 않은 ROS 생산을 켜면 광역학 치료 2일 후 모낭의 돌출 부위에서 LRC 수가 크게 증가합니다. 특히 LRC 수치의 증가는 일시적이며, 치료 6일 후 정상 수준으로 회복됩니다. 일시적인 ROS 생성은 2도 화상 후 피부 치유를 가속화합니다.손상된 피부의 점진적인 감소를 정량화하면 상처 치유 가속 과정 조직의 견고성과 통계적 유의성을 입증할 수 있습니다. 마찬가지로, 치명적이지 않은 ROS 수치는 면도 후 모발 성장을 강력하게 촉진하는데, 이 휴지기 현상은 모낭이 성장 자극에 반응하지 않는 단계이다. 또한 광처리 후 ROS 생성도 항산화 화합물의 적용으로 크게 감소합니다.청색광 여기(blue light excitation) 하에서 적색 형광 발현에 의한 PP IX in situ 생산은 주의 깊게 확인해야 합니다. ROS 생산을 유도하려면 적색 광원의 방사 조도를 올바르게 설정해야 합니다. 조직 및 총 광 선량에 대하여.ROS 유도 후 현재의 생화학 및 세포 및 분자 생물학 기술을 사용하여 수집된 샘플을 분석하고 조직의 동적 생리학적 반응을 평가할 수 있습니다. 당사의 방법론은 in vivo 조직에서 내인성 ROS의 일시적인 생성의 생리학적 효과를 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이것은 ROS 신호 전달 분야의 연구자에게 매우 유용할 수 있는 새로운 실험 접근 방식입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 논문의 목표는 표피 각질세포와 활력을 잃은 인간 진피로부터 유전적으로 변형된 인간 유기형 피부를 생성하는 방법에 대한 포괄적이고 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

이 프로토콜은 피부 구조 및 기능을 복제하기 위해 평면, 생리학적으로 관련된 공기-액체 계면 배양 시스템을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 모낭을 포함하는 피부 오가노이드를 생산하는 방법을 간략하게 설명합니다.

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

학습하세요 마우스 피부에서 mALA 크림과 적색광을 이용한 활성 산소 종(ROS) 유도 방법으로 조직 재생 및 모발 성장을 촉진하는 기전을 탐구하는 실험 기법입니다.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

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