작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

환자 준수는 매우 도전적이고 약물 대사는 사람에게 사람을 다를 수 있으므로 약물 수준의 객관적인 측정은 결핵 치료 중 저항의 출현을 예방하는 데 중요한 것으로 입증 될 수 있습니다. 준수가 더 정확하고 쉽게 정량화 될 수 있다면, 의료 제공자는 약물 내성의 발달을 제한하는 치료 계획을 개발할 수 있습니다. 우리는 단일 분석에서 작은 모발 샘플 내에서 여러 결핵 약물에 대한 최초의 다중 분석 질량 분석 패널을 개발했습니다.

당사의 다중 약물 패널은 환자당 1개의 2밀리그램 샘플만 필요하며 고체 위상 추출 또는 필터링 단계를 사용하여 시료 부피손실을 방지합니다. 치료 과정에서 초기에 측정 된 약물 노출의 객관적인 측정은 잠재적으로 치료 요법에 있는 개별 적인 약에 있는 문제에 임상의를 경고할 수 있었습니다. 모발 샘플은 정확한 약물 농도 수준 측정을 위해 분석 당일 분쇄되어야 합니다.

모발 샘플을 채우려면 서면 동의를 얻은 후 얇은 라벨, 참가자 라벨 2개, 가위 한 켤레, 전개된 알루미늄 호일 조각, 알코올 닦기 및 비닐 봉지를 포함한 재료를 준비하십시오. 가위의 칼날을 알코올 닦아로 깨끗하게 닦습니다. 머리 뒤쪽으로 이동하여 원하는 경우 헤어 클립을 사용하여 머리카락의 상단 부분을 들어 올립니다.

머리 뒤쪽에서 30가닥의 머리카락을 모아 손으로 대가 를 분리합니다. 가위를 두피에 내리고 머리카락의 바탕을 자른다. 조심스럽게 알루미늄 호일에 머리의 바치를 배치합니다.

얇은 라벨을 머리 의 말단 위에 놓고 알루미늄 호일에 단단히 테이핑하십시오. 말단은 두피에서 가장 멀리 떨어진 측면입니다. 알루미늄 호일 조각을 머리 의 위에 접어 알루미늄 호일 위에 참가자 라벨을 놓습니다.

접힌 알루미늄 호일 조각을 비닐 봉지에 넣고 다른 참가자 라벨을 비닐 봉지 위에 놓습니다. 모발 샘플에서 약물 추출을 위해 각 모발 샘플2밀리그램을 개별적으로 표지된 비드 튜브에 넣고 빈 모발 샘플 2밀리그램을 16개의 추가 비드 튜브에 넣습니다. 계량 후 모든 비드 튜브를 비드 밀 균질화제에 넣고 매 사이클 사이에 15초의 휴식 기간을 가진 2개의 30초 주기 동안 초당 6.95미터의 속도로 샘플을 균질화합니다.

두 번째 균질화 후, 각 샘플에 적절한 내부 표준 믹스의 500 마이크로 리터를 추가하고 매트릭스 빈 튜브에 메탄올의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 테이블에 따라 적절한 참조 표준 믹스의 적절한 볼륨으로 교정 곡선 튜브를 스파이크하고 2 시간 동안 부드러운 흔들림과 37도 수조에 모든 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 비드 튜브의 상체를 새로운 라벨이 붙은 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 메탄올을 비드 튜브에 추가합니다.

비드 튜브를 소용돌이시키고 메탄올 세척을 해당 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 원심 분리시 샘플을 조심스럽게 머리 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 슈퍼 네이츠를 전송합니다. 튜브의 액체를 섭씨 32도에서 건조하게 증발시키고 고압 액체 크로마토그래피 등급 의 200 마이크로리터로 샘플을 1 %의 포름산으로 재구성합니다.

소용돌이 후 액체 샘플을 250 마이크로리터 인서트가 있는 호박색 바이알로 옮킨다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법의 경우 먼저 2.5 마이크로미터 입자 크기와 100 개의 앙스트롬 모공 크기로 2 ~ 100 밀리미터 컬럼을 설치하여 다공성 실리카로 완전히 만들어진 극성 끝 에톨 비드가 컬럼 구획에 완전히 만들어졌습니다. 컬럼에 제조업체가 권장하는 가드 카트리지가 설치되어 있는지 확인합니다.

MDR-TB LCMS 메서드 전환에 포함된 화합물 정보를 복사하여 붙여넣습니다. 질량 사양 창의 상자에 csv 파일. 스프레드시트에서 교정 곡선, 품질 제어, 환자 샘플, 교정 곡선, 품질 제어, 환자 샘플, 교정 곡선 및 품질 제어의 배치 시퀀스를 만듭니다.

캘리브레이션 곡선, 품질 제어 및 환자 샘플 전후뿐만 아니라 실행의 시작과 끝에 용매 빈 주사를 추가합니다. 그런 다음 적어도 8개의 용매 블랭크 주사를 교정 곡선및 고품질 관리 바이알에 주사하여 해석물 이월을 감소시킵니다. 일괄 처리가 완료되면 수량 소프트웨어를 엽니다.

전환을 스크롤하여 자동으로 선택한 보존 시간이 정확한지 확인하고 Gaussian 스무딩이 1.5로 설정되어 있는지 확인합니다. 다음으로 보정 곡선과 회귀를 표시하고 대기 유형을 x 이상으로 설정합니다. 확인을 클릭하고 교정 곡선 및 품질 관리 샘플을 확인하여 배치가 성공적으로 실행되었는지 확인합니다.

각 정량화 참조 별술에 대해 교정 점의 3분의 2 이상이 80-120% 내에 정확도를 가져야 하며 교정 곡선 위에 표시된 R 값이 0.975보다 크다는 것을 확인합니다. 위의 모든 조건이 충족되면 일괄 처리가 통과되고 샘플을 정량화할 수 있습니다. 도구 모음에서 편집을 클릭하고 전체 테이블 복사를 클릭합니다.

그런 다음 테이블을 스프레드시트에 붙여 넣고 두 샘플 주사의 계산된 농도의 평균을 사용하여 각 샘플의 보고된 농도를 결정합니다. 여기에 모든 시험 11 약물 내성 결핵 약물의 확인 된 수준을 가진 크로마토그램의 그림을 보여 주었다. 이러한 수치에서, 캘리브레이터 중 하나에서 하나의 특정 약물에 대한 추출된 이온 크로마토그램을 관찰할 수 있다.

정량화 및 한정자 전환은 정량화기의 영역과 한정자 영역 사이의 비율이 샘플 전반에 걸쳐 일정하게 유지됨에 따라 약물의 존재를 질적으로 확인하는 데 사용됩니다. 또한 내부 표준은 각 샘플 주입이 정규화되었는지 확인하기 위해 모니터링됩니다. 본 분석에서, 웨스턴 케이프에서 직접 관찰된 치료 조건하에서 약물 내성 결핵 약물을 복용하는 96명의 환자 중 15명의 모발 샘플의 편리한 샘플을 평가했으며, 남아프리카 공화국은 각 분석기마다 가장 낮고 가장 높은 수준의 약물 내성 결핵 약물의 대표적인 수준을 결정하는 것으로 평가되었다.

고체 상 추출 또는 필터링 단계가 없는 경우, 상류체를 증발 튜브로 옮길 때 주의하십시오. 튜브로 옮겨진 모든 것은 컬럼에 주입될 수 있습니다. 비드 랩터의 로터가 단단히 나사또는 잠겨 있지 않으면 날아갈 수 있기 때문에 작동하기 전에 로터를 다시 확인하십시오.

HIV 분야의 항레트로바이러스와는 대조적으로, 결핵 약물 역학, 준수 및 임상 결과 사이의 관계는 크게 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리는 일부 결핵 약물이 모발에 잘 축적되지 않는다는 가설을 가지고 있습니다. 이 약의 대사 산물을 표적으로 하는 것은 참을성 있는 준수의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.