Name: 마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 마우스 부신 조직에서 멀티플렉스 면역 염색 기법을 활용하여 마이크로웨이브 항체 스트리핑과 플루오로포어 티라미드를 이용한 다중 단백질 검출 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 항체 교차 반응을 차단하여 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

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이 작품은 NIH R00 HD032636에 의해 지원됩니다.

1. 첫 번째 항체로 염색
<ol><li>제왁스와 다음 단계각각에 5분 할당된 FFPE 슬라이드를 재수화: 자일렌 또는 등가 시약 3x, 100% 에탄올 2x, 95% 에탄올 1x, 70% 에탄올 1x, 50% 에탄올 1x 및 증류수 2x. 참고: 슬라이드는 이 재수화 단계에서 최종 단계에서 장착될 때까지 촉촉한 상태를 유지해야 합니다.</li>
	<li>선택적 항원 회수의 경우, 슬라이드를 끓는 구연산나트륨 용액(10 mMM, pH = 6.0)의 275 mL에 8분 동안 놓습니다. 용액을 끓이게 하려면 슬라이드를 14 x 9.5 x 9cm3(W x L X H) 파이펫 팁 박스의 바닥에 평평하게 놓고 70% 전원을 70% 전원으로 70% 전원으로 700W 전자레인지에 8분간 돌리세요. 그런 다음 전자 레인지에서 파이펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 실온 (RT)에서 적어도 20 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>PBST를 포함하는 코플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다 (0.1 % 폴리 소르베이트 20/80와 인산완충 식염수). PBST로 5분 3x로 씻으소서. 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 몇 시간 동안 RT또는 4 °C에서 1-2 일 동안 코플린 항아리에 PBST와 함께이 단계에서 슬라이드를 저장합니다.</li>
	<li>차단 용액을 준비하기 위해 이차 항체의 숙주 종의 정상 혈청을 차단 시약으로서 사용한다. 다른 상업적 차단 시약도 사용될 수 있다. 본 연구에서 제시된 연구에 사용되는 정상 혈청을 사용하는 경우, PBST의 4.9 mL에 정상 당나귀 혈청 100 μL을 추가하십시오. 차단 용액은 최대 3일 동안 4°C에서 보관할 수 있다.</li>
	<li>차단을 위해 슬라이드에서 PBST를 흔들어 충분한 차단 솔루션으로 신속하게 덮습니다. 30 분 동안 가습 챔버에서 RT에서 슬라이드를 인큐베이션.</li>
	<li>원발성 항체를 원하는 농도로 희석시키기 위해 차단 용액을 사용하여 1차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500 μL)을 준비한다. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야합니다.<ol>
<li>3βHSD의 경우, 차단 용액의 498 μL에 3βHSD의 2 μL을 추가합니다.</li>
		<li>TH의 경우, TH 항체의 0.5 μL을 499 μL의 차단 용액에 넣습니다.</li>
		<li>β-카데닌의 경우, β-카데닌 항체 1μL을 차단 용액 499 μL에 넣습니다.</li>
		<li>20αHSD의 경우, 차단 용액의 499 μL에 20αHSD 항체의 1 μL을 추가합니다.</li>
		<li>CYP2F2의 경우 CYP2F2 항체 2μL을 498 μL의 차단 용액에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드에서 차단 용액을 흔들어 1 차 항체와 배양하고 충분한 원발성 항체 용액으로 신속하게 덮습니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 가습 챔버에 인큐베이션합니다. 배양 도중 슬라이드는 건조를 방지하기 위하여 파라핀 필름의 작은 조각에 의해 엄호될 수 있습니다.</li>
	<li>다음날 아침 5 분 3x에 대한 PBST로 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>이차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500 μL)을 차단 용액을 사용하여 생체측화된 이차 항체를 원하는 농도로 희석(예를 들어, 당나귀 항마우스 항체 또는 당나귀 항토끼 항체의 1 μL을 499μL로 차단함) 솔루션)을 참조하십시오. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야합니다.</li>
	<li>슬라이드에서 PBST를 떨고 충분한 이차 항체 용액으로 신속하게 덮음으로써 두 번째 항체와 배양합니다. RT에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오. 참고: 내인성 비오틴이 우려되는 경우, 생체연화된 이차 항체 대신 과산화공수이차전항체를 사용한다. 1.10단계에서 과산화아제-이차 항체를 사용하는 경우 1.14단계로 이동한다.</li>
	<li>PBST로 슬라이드를 5분 3x로 세척합니다.</li>
	<li>고추냉이 과옥시다아제(SA-HRP) 용액(SA-HRP) 용액(2개의 슬라이드에 500 μL)을 PS 499μL에 SA-HRP 0.5 μL을 추가하여 준비합니다. 최종 농도는 1 μg/mL입니다.</li>
	<li>SA-HRP 솔루션으로 인큐베이션합니다. 슬라이드에서 PBST를 흔들고 충분한 SA-HRP 솔루션으로 슬라이드를 빠르게 덮습니다. RT에서 0.5 시간 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.</li>
	<li>PBST로 슬라이드를 5분 3x로 세척합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 플루오로포폴-티라미드를 희석 완충액으로 희석하여 플루오로포레-티라미드 용액을 준비합니다(예: 플루오로폴로폴레 티라미드의 5 μL을 희석 버퍼의 496 μL로).</li>
	<li>슬라이드에서 PBST를 떨고 충분한 플루오로폴레 티라미드 용액으로 슬라이드를 빠르게 덮음으로써 플루오로폴레 티라미드로 신호 개발을 수행합니다. RT에서 1 분 동안 가습 챔버에서 배양하십시오. 배양 시간은 원하는 형광 강도를 얻기 위해 조정될 수 있다. 슬라이드를 PBST가 들어 있는 코플린 항아리로 옮겨 반응을 멈춥시다. PBST로 슬라이드를 3분 2x로 세척합니다.</li>
	<li>신호는 이 단계에서 결과를 확인하기 위하여 형광 현미경의 밑에 빨리 검사될 수 있습니다. 커버립을 사용하지 않는 경우, 각 섹션에 글리세롤:PBS(1:1) 한 방울을 발라 시료를 촉촉하게 유지하십시오. PBST로 슬라이드를 3분 2x로 세척합니다. 슬라이드는 다음 단계로 이동하기 전에 며칠 동안 4°C에서 PBST에 저장될 수 있다.</li>
</ol>2. 첫 번째 항체 를 제거
<ol><li>275 mL의 끓는 구연산나트륨 용액 (10 mMM, pH = 6.0)에 슬라이드를 놓고 적어도 8 분 동안 끓이십시오. 슬라이드를 14 x 9.5 x 9 cm3 (W x L X H) 파이펫 팁 상자의 바닥에 평평하게 놓고 70 0 분 동안 70 % 전력으로 용액을 마이크로 웨이브하십시오. 더 긴 스트리핑 시간이 바람직한 경우, 항상 완충액에 침지된 슬라이드를 유지하기 위해 끓는 구연산나트륨 용액을 사용하여 버퍼를 상부에 두어야 할 수도 있다. 전자 레인지에서 파이펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 RT에서 적어도 20 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>슬라이드를 PBST가 들어 있는 코플린 항아리에 옮김을 옮김을 넣습니다. PBST로 5분 3x로 씻으소서. 다음 단계가 즉시 수행되지 않으면, 슬라이드를 PBST가 있는 코플린 항아리에 몇 시간 동안 또는 1-2일 동안 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>3. 두 번째 항체로 얼룩
<ol><li>차단 단계부터 시작하여 1.5단계부터 1.14단계까지 동일한 절차를 따릅니다. 신호 개발 단계(단계 1.15 및 단계 1.16)에서, 다른 형광 스펙트럼에서 형광-티라미드를 사용한다. 참고: 이 방법을 사용하여 슬라이드를 여러 번 제거하여 멀티플렉스 얼룩을 허용할 수 있습니다. 마지막 항체는 리포터로서 형광포극-티라미드를 필요로 하지 않는다. 형광 공액 이차 항체는 마지막 1 차 항체로부터의 신호를 나타내기 위해 사용될 수 있다.</li>
	<li>핵 카운터 염색이 필요한 경우 RT에서 2 μg/mL 4', 6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI) 또는 Hoechst 용액을 1분 동안 인큐베이트합니다. 그런 다음 PBST로 슬라이드를 3 분 2x로 씻습니다.</li>
</ol>4. 신호를 검출하기 위하여 형광 현미경을 사용하여 화상 진찰
<ol><li>면역 형광에 적합한 장착 매체를 떨어 뜨려 커버 슬립을 장착하십시오.</li>
	<li>화상 진찰을 위해, 각 형광 채널의 신호를 검출하기 위하여 형광 현미경을 이용하십시오. 핵 염색(DAPI) 채널과 4x 렌즈로 시작하여 슬라이드에서 조직을 찾습니다.</li>
	<li>이미징을 위해 10x 렌즈로 전환합니다. 노출 시간(300ms)과 광원 강도(80% 강도)를 조정합니다. 신호가 너무 밝거나 너무 어둡으면 이러한 설정을 조정합니다. 무대를 이동하지 않고 각 채널의 사진을 촬영합니다. 각 채널에 대해 다시 초점을 맞추는 것이 필요할 수 있습니다. 현미경의 소프트웨어 또는 ImageJ (imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 각 채널의 이미지를 병합합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

멀티플렉스 면역염색은 2개 이상의 항원들의 세포 동국화를 검사하는데 유용하다. 이 널리 사용되는 기술은 1 차 항체가 다른 기자 (직접 염색)와 공액 될 때 설득력있는 동국화 결과를 제공합니다. 그러나, 직접 염색은 일반적으로 1 차적인 항체를 검출하기 위하여 공액한 이차 항체를 관련시키는 간접 염색에 비교된 더 약한 신호를 제공합니다. 간접 염색에서, 고품질 멀티플렉스 면역염색 결과는 이차 항체가 상이한 1차 항체를 구별할 수 있는지 여부에 의존한다. 가능한 항체 교차 반응성으로 인해, 간접 염색 방법을 활용한 멀티플렉스 염색은 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체로 보다 명확하게 볼 수 있다. 칼 과 다른 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 비공액 IgG F(ab) 단편을 사용하여프로토콜을 개발하였다 1. 유사한 전략은 조직에 있는 어떤 내인성 마우스 면역 글로불린검출에서 반대로 마우스 이차 항체를 방지하기 위하여 F(ab) monomeric 반대로 마우스 항체를 사용하는 "마우스 에 ...

멀티플렉스 면역 염색에서, 공액 된 1 차 항체를 사용하여 직접 염색은 유익한 결과를 제공 할 수 있습니다. 이차 항체를 사용하지 않고, 직접 염색 방법은 항체 교차 반응성으로부터거짓 동경화 신호의 위험이 낮다. 그러나, 1차 항체상에 공액된 리포터(플루오로폴레, 효소) 또는 비오틴은 향후 사용을 제한한다. 대안적으로, 간접 면역 염색은 일반적으로 표지된 이차 항체를 가진 비공액 1차 항체를 사용하여 더 강한 신호를 제공한다. 이상적으로, 멀티플렉스 면역염색에 사용되는 비conjugated 1 차 항체는 항체 교차 반응성을 피하기 위해 상이한 숙주 종으로부터 와야 한다. 그러나, 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다.
바람직하지 않은 1차 항체와 반응하는 이차 항체의 위험을 제거하기 위해 여러 가지 방법이 확립되었다. 한 가지 일반적인 방법은 제1 차 항체 1로 염색하기 전에 제1 차 항체 복합체에 대한 잔존 결합 에피토프를 차단하는 F(ab) 단일성 항체를 사용하는것이다. 서양 블롯 시트의 스트립 및 재프로브와 유사한 항체 스트리핑은 3,3'-다미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)2 및 형광 티라미드 증착3와같은 검출 가능한 리포터 분자의 증착을 제거하지 않고 이전에 염색된 항체 복합체를 제거한다. 이 방법을 사용하면 서로 다른 색상의 리포터 분자가 동일한 슬라이드에서 멀티플렉스 결과를 표시할 수 있습니다. 멀티플렉스 염색은 또한 이전에 증착된 항체층을 완전히 제거하고 다른 항체로부터 이후에 획득된 이미지의정렬에의해 달성된다4,5. 각 방법에는 한계가 있고 복잡한 절차 또는 특별한 이미징 시스템이 필요하지만 이러한 방법은 모두 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다.
본 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 완충제의 사용과 함께 항체 스트리핑 방법의 적용을 나타낸다. 이 프로토콜은 동일한 숙주 종으로부터 2개의 표지되지 않은 1차 항체를 가진 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편에서 다중 면역형광 염색을 수행하는데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated 당나귀 안티 마우스</td><td>잭슨Immuno</td><td>715-066-151</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Biotinylated 당나귀 안티 토끼</td><td>잭슨Immuno</td><td>711-066-152</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 &mu; g/mL in distilled</td></tr> water <tr><td>형광 현미경</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>전자레인지, 700W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>마우스 anti-TH</td><td>산타크루즈</td><td>SC-25269</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>잭슨이뮤노</td><td>017-000-121</td><td>PBST</td></tr><tr><td>래빗 안티-20&알파 2% 세럼; HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>토끼 안티 3&베타; HSD</td><td>TransGenic</td><td>KO607</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>Rabbit anti-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&beta;-catenin</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>TSA 플루오레세인 티라미드</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>1:100 희석</td></tr></tbody></table>

마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

면역 염색은 주어진 단백질의 세포 발현 패턴을 보여주기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용된다. 멀티플렉스 면역 염색은 다중 1 차적인 항체를 사용하여 표지를 허용합니다. 항체 교차 반응성을 최소화하기 위해, 간접 염색을 이용한 멀티플렉스 면역 염색은 다른 숙주 종으로부터의 표지되지 않은 1차 항체를 필요로 한다. 그러나, 상이한 종 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편상에 대한 다중 면역형광에 대해 동일한 숙주 종(예를 들어, 두 항체가 토끼로부터)으로부터 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 항원 회수 단계에서 사용되는 동일한 절차 및 시약을 사용하여 이전에 염색된 1차 항체 복합체의 활성을 제거한다. 슬라이드는 일반적인 면역 염색 프로토콜을 사용하여 제1 차 항체로 염색하고 생체면역이차 항체를 이용한 결합 단계를 따랐다. 이어서, 아비딘-비오틴-과산화증 신호 개발 방법을 기질로서 불소-티라미드와 함께 사용하였다. 제1 차 항체 복합체의 면역활성을 전자레인지에 침지하여 8분 동안 구연산나트륨 용액을 제거하였다. 불용성 형광부-티라미드 증착은 샘플에 남아 있었고, 이는 슬라이드가 다른 1차 항체로 염색될 수 있게 하였다. 이 방법은 대부분의 거짓 양성 신호를 제거하지만, 항체 교차 반응성에서 일부 배경은 남아있을 수 있습니다. 시료가 내인성 비오틴으로 농축되는 경우, 과산화공소 이차 항체는 회수된 내인성 비오틴으로부터 거짓 양성을 피하기 위해 생체연화된 이차 항체를 대체하는데 사용될 수 있다.

결과는 항원 회수 단계 1.2를 포함하는 기재된 모든 단계로 처리된 샘플로부터 수득되었다. 여기에서 사용된 모든 이차 항체는 생체화되었다. 플루오로포레-티라미드는 제1 차 및 제1차 항체로부터의 신호를 개발하기 위해 사용되었다. 이미지는 FITC 큐브(녹색 형광의 경우), TxRED 큐브(Cy3용), DAPI 큐브(DAPI용)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 캡처되었습니다.
마이크로 웨이브 매개 스트리핑은 교차 반응성을 제거합니다. 마우스 FFPE 부신 절편은 2차 토끼 항체를 사용하여 염색되었다. 스트리핑(도1A-C)을제거하지 않고, TH에 대한 이차 항체는 3βHSD(+) 부위를 포착하고 부신 피질에서 적색 신호를 주었다(도<strong cl...

동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

면역 염색은 관심있는 단백질의 위치를 확인하기 위해 생체 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 멀티플렉스 면역스테인링은 상이한 1차 항체를 사용하여 동일한 샘플에서 여러 표적을 검출할 수 있다. 이 방법의 장점은 항체 교차 반응성을 제거하기 위해 일반적으로 이용 가능한 완충제의 사용으로 동일한 숙주 종으로부터 두 개 이상의 라벨이 없는 1차 항체를 사용하여 면역스테인링을 허용하는 것이다.이 절차를 시연하는 것은 대학원생인 소피아 정과 제 연구실방문학자 인 치옹시아 루(Qiongxia Lyu)가 될 것입니다. 염색하기 전에, 탈왁스및 각 솔루션에 5분 몰입이 있는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 슬라이드를 재수화합니다. 두 번째 증류수 침수 후, 슬라이딩을 뚜껑이 있는 파이펫 팁 박스 바닥에 끓는 나트륨 구연산용액 275밀리리터에 넣고 8분 동안 75%의 전력으로 상자를 700와트 마이크로파에 넣습니다.치료가 끝나면 뚜껑을 열고 코플린 항아리에 신선한 PBST 3 분 세척으로 슬라이드를 세척하기 전에 용액을 실온으로 식힙니다. 비특이적 결합 부위를 차단하려면 마지막 세척 후 각 슬라이드에서 초과 PBST를 흔들고 적절한 차단 솔루션의 충분한 부피로 슬라이드를 덮습니다. 가습 챔버에서 실온에서 30 분 후, 각 슬라이드에서 초과 차단 용액을 흔들고 각 샘플에 관심의 첫 번째 기본 항체의 250 마이크로 리터를 추가합니다.샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 슬라이드는 파라핀 필름조각으로 덮여 있을 수 있습니다. 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복 후, 세척 당 5 분 동안 신선한 PBST로 슬라이드를 세 번 세척하십시오. 여분의 PBST를 흔들어 서 면 신속 하 게 실온에서 가습 챔버에서 1 시간 배양에 대 한 적절 한 이차 항체 용액의 250 마이크로 리터와 각 슬라이드를 커버.인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 새로 준비된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 250 마이크로리터를 각 슬라이드에 추가합니다. 실온에서 30분 후, 신선한 PBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 그런 다음 초과 PBST를 흔들어 고 새로 준비 된 플루오로포레 티라미드 용액의 250 마이크로 리터로 각 슬라이드를 덮습니다.1분 후, 신선한 PBST에 슬라이드를 잠수한 다음 신선한 PBST에서 3 개의 2 분 세차재가 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 섹션에 일대일 글리세롤 - PBS 용액의 몇 방울을 적용하고 형광 현미경 검사에 의해 형광 신호의 존재를 확인합니다. 첫 번째 항체 복합체를 제거하기 위해, 입증된 바와 같이, 구연산나트륨 용액의 275 밀리리터에 항체 라벨 슬라이드를 배치한다.치료가 끝나면 뚜껑을 열고 PBST로 슬라이드를 세 번 세척하기 전에 실온으로 용액을 식힙니다. 관심있는 제 2 표적 단백질에 대한 얼룩을 위해, 입증 된 바와 같이 비특이적 결합을 차단 한 후, 각 샘플을 4섭씨에서 관심있는 제 2 차 항체의 마이크로리터로 라벨을 밤새 섭씨 4도로 표시하십시오. 다음 날 아침, 슬라이드를 세척당 신선한 PBST로 5분간 3회 세척한 후 각 슬라이드를 실온에서 1시간 배양할 수 있는 적절한 이차 항체 용액 250마이크로리터로 덮습니다.인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 새로 준비된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 250 마이크로리터를 각 슬라이드에 추가합니다. 관심있는 제 2 표적 단백질에 대한 신호를 개발하기 위해, 세 개의 PBST 세차제 후, 다른 형광 스펙트럼에서 플루오로포어 컨쥬게이드 티라미드로 슬라이드를 치료한다. 티라미드 신호 개발을 중지하려면 슬라이드를 PBST에 잠급니다.그런 다음 적절한 핵 염료로 샘플을 얼룩지게합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 이미징을 위해 각 핵 염료 표지 슬라이드에 적절한 장착 매체를 커버슬립에 장착하십시오. 슬라이드에서 조직을 찾기 위해 4X 목표를 사용합니다.이미징을 위한 10X 목표로 전환하고 광원으로 40~80% 강도로 노출 시간을 100~400밀리초로 조정합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하지 않고 각 채널에서 이미지를 가져옵니다. 각 채널의 이미지를 병합하여 멀티플렉스 형광 이미지를 형성할 수 있습니다.제1 및 이차 항체 염색 사이에 제거하지 않고, 티로신 하이드록실라제에 대한 제2 염색은 부신 피질 내의 이 샘플에서 예를 들어, 거짓 양성 티로신 하이드록실라제 염색의 결과로 관심있는 첫 번째 표적 단백질로부터 신호를 포착합니다. 첫 번째 면역 스테인닝에서 고추냉이 과산화제에서 항체 교차 반응성을 제거하기 위해 1 분 및 8 분 마이크로파 매개 스트립이 수행되어 깨끗한 이중 염색 결과를 초래할 수 있습니다. 음의 제어 샘플에서는 중요한 신호가 포착되지 않습니다.끓는 구연산 완충에서 8 분 스트립은 또한 부신에 일반적으로 사용되는 많은 항체에 대한 항체 교차 반응성을 제거하기에 충분하다. 어떤 경우에는 약한 거짓 양성 신호가 여전히 검출가능하지만, 마이크로파 처리로 20분 증가해도 항체 교차 반응성을 완전히 제거하지 못할 수 있다. 형광 이미징 동안 채널을 전환 할 때 단계를 이동하지 않는 것이 중요합니다.그러나 각 채널의 선명한 이미지를 얻기 위해 초점을 재조정해야 할 수도 있습니다. 각 채널에 대해 노출 시간을 조정하여 이미지가 노출되지 않은 픽셀이나 영역없이 신호가 적절하게 노출되도록 해야 합니다. 염색 절차 동안, 탈 왁싱에서 수화 슬라이드를 유지하는 것이 중요하며 멀티 플렉스 염색을 허용하기 위해 동일한 스트리핑 방법을 여러 번 사용하여 슬라이드를 제거 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 동일한 숙주 종의 1차 항체를 사용하여 다중 면역염색을 수행하는 분석을 보여줍니다. 이 방법에서는 부신 조직 절편이 2단계 면역염색 과정을 거칩니다. 처음에는 피질의 마커에 특이적인 항체로 절편을 염색한 다음, 결합된 항체를 벗겨내고 수질의 마커에 특이적인 항체로 다시 염색합니다.

동일 숙주 종의 1차 항체를 이용한 멀티플렉스 면역염색 방법

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

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멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기 우리는 마우스에서 아드레날린을 분리, 조직, 그들, 섹션 고치고 면역 형광 염색 법을 수행 하는 방법을 제시.

절연, 고정, 및 마우스 아드레날린의 면역 형광 이미징

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

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Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

배우세요 마우스 부신 조직에서 멀티플렉스 면역 염색 기법을 활용하여 마이크로웨이브 항체 스트리핑과 플루오로포어 티라미드를 이용한 다중 단백질 검출 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 항체 교차 반응을 차단하여 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여

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