Name: 바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 배우세요 Bacillus anthracis 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석 방법을. 이 분석은 BSL-1 또는 BSL-2 실험실에서 안전하게 수행할 수 있으며 백신 효능과 상관관계가 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. 추아, D. 차봇, A. 프리들랜더는 원고에 설명된 절차를 설계했다. J. 추아와 T. 퍼트몬 테일러는 실험을 수행했다. D. Chabot은 데이터 분석을 수행했습니다. 제이 추아는 원고를 썼다.
저자는 우수한 기술 지원을 카일 J. Fitts 감사합니다.
이 작업은 국방 위협 감소 국 보조금 CBM에 의해 지원되었다. VAXBT.03.10.RD.015, 계획 번호 921175.
의견, 해석, 결론 및 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 이 출판물의 내용은 반드시 국방부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급은 미국 정부의 지지를 의미하지도 않습니다.

동물 복지법, 공중 보건 서비스 정책 및 동물과 관련된 기타 연방 법령 및 규정에 따라 여기에 설명 된 연구는 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구가 수행 된 시설은 국제 실험실 동물 관리협회의 인증을 받았으며 실험실 동물의 치료 및 사용 가이드, 국립 연구 위원회, 201124에명시된 원칙을 준수합니다.
1. 세포주 배양 및 유지 보수, RAW 264.7
참고: 무균 기술로 다음 절차를 수행해야 합니다.
<ol><li>56°C 수조에서 태아 소 혈청(FBS)을 30분 동안 가열하여 보완합니다. 참고: FBS가 56°C에 도달하면 30분의 비활성화 시간이 시작됩니다. 온도를 모니터링하려면 동일한 수조의 비커에 비슷한 양의 물을 가열합니다. 물이 56°C에 도달하면 FBS에 대한 30분 카운트다운을 시작합니다. 또는 열 비활성화된 FBS도 시판됩니다.</li>
	<li>90% DMEM과 높은 포도당 및 10% 열 비활성화 FBS(v/v)를 결합하여 RAW 264.7 세포에 대한 배지를 준비한다. L-글루타민을 6mM의 최종 농도에 추가합니다. 참고 : 높은 포도당DMEM은 4 mM L-글루타민으로 제조됩니다. L-글루타민을 6mM로 보충하는 것은 일관된 세포 성장을 촉진합니다. 100 U/mL 페니실린 과 100 μg/mL 연쇄 절제술은 오염을 방지하기 위해 첨가될 수 있다. 또 다른 일반적인 뮤린 세포주, J774A.1, 또한 사용 될 수 있으며 유사한 조건하에서 성장.</li>
	<li>37°C 수조에서 냉동 된 세포 유리병을 해동하고 녹자마자 욕조에서 제거하십시오. 원적 튜브에 5mL 완성 매체에 무균으로 내용을 추가합니다. 원추형 튜브를 두 번 반전시키고 300 x g에서 펠릿 세포까지 5분 동안 회전합니다.</li>
	<li>진공에 부착된 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 흡인 매체를 사용하여 동결제를 제거합니다. 신선한 배지의 5mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>플라스크 또는 접시를 치료한 조직 배양으로 현탁액을 옮기. 플라스크의 바닥을 완전히 덮고 세포를 균등하게 분배할 수 있는 충분한 매체를 추가합니다. "1"로 시작하는 통로 번호를 나타냅니다.</li>
	<li>37°C에서 세포를 배양하여 5% CO2의 존재와 습도가 95% ~ 100% 연결성에 도달한다. 인큐베이션의 둘째 날부터 현미경으로 매일 세포를 확인하십시오. 세포가 들어 올리고 죽게 하기 때문에 세포가 도달하도록 허용하지 마십시오.gt;100% 합류. 참고: 합류에 도달하는 데 필요한 시간은 얼마나 많은 라이브 세포가 도금되었는지, 플라스크의 성장 영역에 따라 달라집니다. 따라서, 매일 세포를 확인하는 것이 신중하다.</li>
	<li>스크레이핑 사이에 적어도 이틀간의 성장을 허용하는 신선한 배지에서 세포 육수를 긁고 희석하여 서브배양 세포. 각 하위 문화권에서 통로 수를 1로 늘립니다. 참고: 다음 날 통과되고 즉시 긁으면 시간이 지남에 따라 일반 셀 준수가 더 빨라집니다. RAW 264.7 셀은 대략 15항까지만 사용해야 한다.</li>
	<li>OAA 분석에 대 한 RAW 264.7 세포를 플레이트하려면, 신선한 매체로 교체 하 고 부드럽게 플라스크에서 세포를 긁어 세포 를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용 하 여. 파이펫을 위아래로 분해하여 세포 응고를 쉽게 만듭니다. 참고: RAW 264.7을 세분화하는 기존의 방법은 긁어내는 것입니다. 우리의 경험에서 트립신을 사용하면 RAW 264.7 셀이 긁는 것보다 시간이 지남에 따라 준수를 잃게됩니다.</li>
	<li>셀을 계산하려면 동일한 양의 셀과 trypan blue 용액을 희석합니다. 혈류계에 10 μL을 적재합니다. 10배 객관적렌즈를 사용하여 반전된 복합 현미경을 사용하여 염료를 배제하는 살아있는 세포의 수를 관찰하고 계산한다.</li>
	<li>플레이트 1.4 x 104 96 에서 잘 당 실행 가능한 셀 0.15 μm 두께의 유리 평면 바닥 플레이트 (플레이트 #1). 세포가 3일 동안 성장할 수 있도록 합니다. OAA를 수행하기 전에 하루 동안 소비된 매체를 교체하십시오. 참고: 3일 간의 인큐베이션 후 셀 수는 약5 x 10 4/well이어야 합니다.</li>
</ol>2. 세균 문화와 준비
참고 : 이 프로토콜에 사용되는 세균성 종은 캡슐화된 악성 균주, B. 탄트라시스 에임스입니다. 이 종과의 모든 조작은 적절한 생체 안전 및 보안 허가를 필요로하며 BSL-3 실험실에 위치한 클래스 II 또는 클래스 III 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-3 작업에 대한 제도적 운영 절차를 따르고 박테리아를 취급할 때 개인 보호 장비를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>1L물에 37g BHI 분말을 용해하고 15분 동안 121°C에서 오토클레이브하여 뇌 심장 주입(BHI) 국물을 준비합니다. 주변 온도에서 국물을 저장합니다.</li>
	<li>물에 8% 중탄산나트륨 용액을 준비하고 0.20 μm 필터 주사기를 사용하여 살균한다. 용액을 4°C로 저장하고 1일 이내에 사용하십시오.</li>
	<li>영양 국물 8g, 효모 추출물 3g, 15g의 한마고를 1L 물에 섞어 NBY 한천 판을 준비합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 페트리 접시에 붓고 굳어두는 다. 4 °C에서 접시를 보관하십시오. 참고: NBY 한천 플레이트는 중탄산나트륨 유무에 관계없이 만들 수 있습니다. 국물 및 한천 판에 중탄산나트륨을 첨가하여 캡슐화된 바실리로 구성된 점막 식민지의 성장을 유도한다. 액체 및 고체 매체 모두에서 중탄산나트륨의 최종 농도는 0.8%입니다.</li>
	<li>50% 오토클레이브 BHI 국물, 40% FBS 및 10% 중탄산나트륨 용액(v/v)을 혼합하여 B. 탄트라시스에 대한 배양 국물을 준비합니다. 참고 : 이 국물은 캡슐화된 바실리의 짧은 사슬을 생성하도록 제조되었습니다.</li>
	<li>물자에서 배양하기 하루 전에 포자 스톡에서 NBY 한천 접시에 절연을 위해 줄무늬로 B. 탄트라시스의 마스터 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 인큐베이션.</li>
	<li>B. 탄트라시스의여러 식민지와 환기 250 mL 플라스크에서 문화 국물의 30 mL 접종. 참고: 여기에 명시된 바와 같이 국물의 표면 비에 대한 특정 부피는 최대 캡슐화된 바실리를 생성하기 위해 필요합니다.</li>
	<li>국물 배양을 125rpm, 37°C에서 20% CO2, 습도 18-24h로 흔들어 주세요. 참고: 37°C 이상의 온도에서 B. 탄트라시스가 증가하여 캡슐 생산을 저해할 수 있습니다.</li>
	<li>충분한 캡슐화를 보장하기 위해 인도 잉크와 부정적인 염색을 사용하고 바실리가 고정하기 전에 짧은 사슬 (1-5 bacilli / 체인)에 있습니다 (섹션 3 참조).</li>
	<li>식민지 형성 단위 (CFU)를 결정하기 위해, 연속적으로 배양 100 μL을 희석 1:10 인산염 완충식 식염수 (PBS) 용액 및 양 혈액 천막 판에 플레이트 배양 희석. 37°C에서 12-18h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다. CfUs를 계산하고 문화의 mL 당 박테리아의 수를 결정합니다. 참고: 박테리아가 고정되면 현미경의 밑에 혈종계를 사용하여 계산은 또한 수행될 수 있습니다. 그러나, 이것은 바실리가 낮은 배율하에서 보기 어렵기 때문에 권장되지 않습니다.</li>
	<li>16% 파라포름알데히드(PF)를 세균 배양의 전체 부피에 4% PF의 최종 농도로 첨가하여 바실리를 고치게 한다. 7일 동안 주변 온도에서 셰이커를 천천히 동요합니다. 참고: 4% PF에서 7일간의 인큐베이션은 식물성 간균 을 고정하기 위한 USAMRIID 제도적 표준 운영 절차를 기반으로 합니다.</li>
	<li>멸균에 대한 고정 및 테스트를 제거하기 위해 50mL 원심관에서 고정 세균 서스펜션의 4mL(10% 부피)을 45분 동안 ≥3000 x g에서 원심분리하고 PBS로 30mL/wash를 사용한다. 나머지 샘플을 4°C에서 4% PF에 저장합니다. 참고 : 펠릿 후, 세균성 펠릿은 캡슐의 존재로 인해 푹신푹신합니다. 세탁 하는 동안 펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 실행 가능성 테스트를 방해하지 않도록 모든 고정을 제거해야합니다. 필요한 경우 세하 수를 늘립니다.</li>
	<li>생존성 검사를 위해, 4mL의 세척현탁액(국물량의 ≤ 10%)을 가진 세균성장 배지(예를 들어 BHI 국물)의 40mL를 접종하고 7일 동안 37°C에서 배양한다. 탁도를 측정하기 위해 7일 전후 600nm에서 광학 밀도를 확인합니다.</li>
	<li>국물 배양 7일 후, 접시≥100 μL의 국물을 한천판에 ≥ 7일 동안 배양한다. 탁도가 증가하지 않고 플레이트에 대한 성장이 보이지 않으면 원래 배양은 멸균으로 간주되며 BSL-2 실험실로 옮겨질 수 있습니다. 참고: 연방 선택 에이전트프로그램(22)은 불활성화된 B. 탄트라시스가 샘플의 완전한 멸균을 입증한 후에만 BSL-3 실험실에서 전송될 수 있음을 규정하고 있습니다. 불활성화 된 B. 탄트라시스에 대한 생존 성 테스트는 7 일 동안 국물에 있는 샘플의 10 %를 배양한 다음 7 일22,23일 다른 고체 배지에서 배양하는 것으로 구성됩니다. 불임이 확립되면 기관 지침을 따라 이전 승인을 받을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 캡슐화 및 간실리 사슬을 관찰하는 부정적인 염색 및 가벼운 현미경 검사법
<ol><li>5 μL 세균 현탁액을 현미경 슬라이드에 인도 잉크 2 μL과 혼합합니다. 거품을 만들지 않고 서스펜션 위에 1 또는 1.5 μm 두께의 커버 글래스를 놓습니다. 참고: 매니큐어는 커버 글래스를 슬라이드에 밀봉하는 데 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>가벼운 현미경에서 40x 에서 100x 오일 객관적 렌즈를 사용하여 세균 현탁액을 관찰하십시오. 각 박테리아를 둘러싼 클리어런스 영역(캡슐제외 인도 잉크)을 관찰하고 박테리아 사슬이 짧다는 것을 바실리가 캡슐화되었는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 박테리아의 FITC 라벨링
<ol><li>2 mg/mL의 농도로 디메틸 설프리산화물에 형광균 이소티오야네이트(FITC)를 용해하십시오.</li>
	<li>불활성화 된 세균 재고의 양을 측정합니다.</li>
	<li>PBS에서 스톡을 3배 세척하여 고정을 제거합니다.</li>
	<li>75 μg/mL의 최종 농도에서 FITC 솔루션을 추가합니다. 4°C에서 18-24h의 혼합물을 천천히 동요합니다.</li>
	<li>세 번 ≥3000 x g, 45 분에서 펠릿과 30 mL PBS / 세척을 사용하여 과도한 FITC를 제거하여 박테리아를 씻으십시오. 푹신한 펠릿이 세탁 중에 방해받지 않도록 하십시오. 동일한 시작 볼륨에서 PBS에서 바실리를 다시 중단합니다.</li>
	<li>Aliquot 및 사용 전까지 -20°C의 마이크로튜브에 바실리를 저장합니다. 바실리가 캡슐을 잃을 수 있기 때문에 바실리를 여러 번 동결/해동하지 마십시오.</li>
</ol>5. 세균 성 편화
<ol><li>열은 열 블록에서 30 분 동안 56 °C에서 소량의 테스트 세라 (NHP에서)를 비활성화합니다.</li>
	<li>3-5 분 동안 15000 x g에서 펠릿하여 PBS 2x로 FITC 라벨박테리아를 해동하고 세척하십시오. PBS에서 동일한 시작 볼륨으로 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>96웰 원형 바닥 플레이트(플레이트 #2)에서, 세포 배지에서 연속적으로 테스트 세라를 희석시. 또 다른 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트 (플레이트 #3)에서 각 우물에 희석 된 테스트 세라 10 μL을 추가하십시오. 참고 : 모든 접시에서 PBS와 일반 원숭이 세라가 희석 된 테스트 세라 대신 에 포함되었습니다. 또한 하나의 테스트 세럼을 긍정적인 컨트롤로 선택하여 다른 날에 수행된 모든 분석방법을 정규화하는 표준 곡선을 생성했습니다. 양성 제어 테스트 혈청은 풍부했기 때문에 임의로 선택되었습니다.</li>
	<li>플레이트 #3 10 μL 갓 재구성된 아기 토끼 를 추가하십시오. 참고: 일단 재구성되면 남은 아기 토끼 를 폐기하십시오. 재고정 및 해동하지 마십시오.</li>
	<li>플레이트 #3, 1:20의 감염의 복합성에 대한 FITC 라벨 바실리의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어 5 x 104 x 20 바실리를 포함하는 부피를 5 x 104 세포에 추가합니다. 총 105 μL에 셀 배지의 적절한 부피와 #3 플레이트에서 각 우물을 위로. 참고: 세포를 포함하는 플레이트 #1, 빈 부피로 나머지 5 μL와 함께 공손화 된 박테리아의 100 μL을 수신합니다. 우리는 테스트 세라의 각 희석을 복제하여 테스트했습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 30분 동안 배양판이 #3 습도가 있는CO25%의 존재하여 바실리를 오손화한다.</li>
</ol>6. 포유류 세포의 준수 분석 및 형광 라벨링
<ol><li>사용하기 전에 모든 시약을 37 °C에서 유지하십시오.</li>
	<li>37°C 열 블록에 부착 셀이 포함된 플레이트 #1 놓습니다.</li>
	<li>멀티채널 피펫터를 사용하여 우물에서 소비된 매체를 제거하고 플레이트 #3 100 μL의 공진균으로 빠르게 교체하십시오. 파이펫팅 중에 우물에서 거품이 생성되지 않았는지 확인합니다. 인큐베이션 플레이트 #1는 37°C에서 5% CO2, 습도가 30분 동안 준수합니다.</li>
	<li>37°C 열 블록 위에 150 μL PBS로 각 우물 5배를 세척하여 부착되지 않은 바실리를 제거합니다. 참고: 세척 중에 셀이 실수로 분산되지 않도록 주의해야 합니다.</li>
	<li>PBS 1:4로 16% PF를 희석하여 4% PF를 만듭니다. 각 웰에 150 μL을 추가하여 1h에 4% PF로 셀을 수정합니다. PBS로 셀 2배 세척.</li>
	<li>10mL PBS에 2 μL HCS (고함량 스크리닝) 오렌지 셀 스테인을 혼합합니다. 이 염색 용액의 150 μL을 고정 된 세포에 추가하고 주변 온도에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>PBS로 우물 2배 세척.</li>
	<li>현미경 검사법까지 4 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>7. 현미경 검사법
참고: 일반적으로 고처리량 자동 형광 현미경은 OAA에 대한 이미징을 용이하게 합니다. 자동화 된 시스템을 사용할 수없는 경우, 부착 된 간실리의 형광 이미지는 수동으로 촬영 할 수있다21. 본연구에서는 20,부착된 바실리 및 세포 단층은 특수 장비를 갖춘 자이스 700 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하여 이미지화되었다; 우리의 시스템은 자동화 된 단계, 명확한 초점 모듈, 40 x NA 0.6 목표, 악시오 캠 HRc 카메라와 젠 2012 (블루 에디션) 소프트웨어가 장착 된 자이스 악시오 옵저버 Z1 반전 현미경으로 구성되었다. 획득한 이미지는 공초점 이미지가 아닌 와이드필드 이미지입니다. 다음 프로토콜은 다양한 자동화 된 현미경 시스템에 적용되는 기본 현미경 설정으로 설계되었습니다.
<ol><li>30 분 동안 주변 온도에서 #1 인큐베이션 플레이트. 현미경 및 관련 장비를 켭니다. 참고: 주변 온도에서 의적응하면 이미징 중에 유리 판에 응축이 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 온도 변화로 인한 디포커싱을 방지합니다.</li>
	<li>스테이지에 플레이트를 놓고 밝은 필드 또는 위상 대비를 사용하여 세포에 집중하십시오.</li>
	<li>플레이트 설정으로 96의 잘 포맷을 선택합니다. 채널 설정을 선택합니다. 참고: FITC의 피크 여기 및 방출 파장495/519 nm; HCS 오렌지 셀 얼룩은 556 및 572 nm입니다. 다른 형광은 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 사용될 수있다.</li>
	<li>타일 모드로 설정을 선택합니다. 획득할 이미지 수를 나타냅니다. 참고: 타일링 기능을 사용하면 샘플에서 여러 위치를 잘 캡처할 수 있으며 타일 또는 임의 형식으로 이미지를 획득하도록 설정할 수 있습니다. 우리는 잘 당 10 임의의 영역을 이미지.</li>
	<li>획득 모드를 "흑백" 또는 "흑백" 또는 비닝 ≥ 2x2로 변경합니다. 참고: 비닝을 1x1에서 2x2 또는 4x4로 설정하면 미세 검사 속도가 빨라지지만 이미지해상도도 낮아집니다. OAA의 경우, 분석이 대식세포와 부착박테리아를 모두 내포할 때 이러한 설정을 사용하기에 충분합니다.</li>
	<li>자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 조정 함수를 수행하는 빈도를 나타냅니다. 사용 가능한 경우 Z 스택 기능을 켭니다. 세포 단층 및 부착 된 바실리의 두께를 캡처 할 Z 스택의 수를 나타냅니다. 참고: 선택한 Z 스택의 수는 현미경 검사법을 증가하지만 각 Z 스택에서 올바른 초점을 가진 이미지를 촬영합니다.</li>
	<li>이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 자동화된 이미징 프로그램을 실행합니다.</li>
</ol>8. 데이터 수집 및 분석
<ol><li>이미지당 부착된 바실리 및 포유류 세포의 수를 계산합니다. 간균의 각 사슬을 하나의 박테리아로 계산합니다.</li>
	<li>적절한 통계 프로그램에서 표준 곡선을 생성하기 위해 양성 대조군 시험 혈청 및 티터(예를 들어, 1:10 희석은 10티터 단위)의 바실리/세포를 플롯한다.</li>
	<li>비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 양수 제어 테스트 세럼을 분석합니다. 그런 다음 양수 제어 테스트 혈청의 표준 곡선을 사용하여 나머지 샘플을 분석하여 해당 티터를 결정합니다. 참고: 일반적으로 티터를 결정할 때 표준 곡선의 중간 부근에 있는 샘플 희석을 선택하는 것이 가장 정확합니다.</li>
	<li>각 백신 그룹에서 샘플의 기하학적 평균을 계산합니다. ANOVA 분석의 가장 큰 차이로 로그 변환 된 티터의 P-값을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: a review.</a> CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).</li>
<li>Metschnikoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchurgen+uber+die+intracellulare+Verdauung%2C+bei+wirbellosen+Thieren%5BTitle%5D)+AND+%22Arbeiten+aus+dem+Zoologischen+Instituten+der+Universit%C3%A4t+Wien%22%5BJournal%5D)">Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren.</a> Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).</li>
<li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).</li>
<li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+evolved+to+discriminate+infectious+nonself+from+noninfectious+self%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self.</a> Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).</li>
<li>Kumagai, Y., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functions+of+pattern-recognition+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and functions of pattern-recognition receptors.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Candela, T., Fouet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly-gamma-glutamate+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Poly-gamma-glutamate in bacteria.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).</li>
<li>Kocianova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+poly-gamma-DL-glutamic+acid+in+immune+evasion+and+virulence+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).</li>
<li>Rothbard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+hyaluronidase+and+type-specific+anti-M+serum+on+experimental+group+A+Streptococcus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).</li>
<li>Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+capsular+polysaccharides+enable+Bacillus+cereus+G9241+to+cause+anthrax-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease.</a> Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).</li>
<li>Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effects+of+carrier+proteins+on+vaccine-induced+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response.</a> Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).</li>
<li>Wang, T. T., Lucas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsule+of+Bacillus+anthracis+behaves+as+a+thymus-independent+type+2+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen.</a> Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).</li>
<li>Vogel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+flow+cytometric+analysis+of+opsonophagocytosis+and+killing+of+nonencapsulated+Haemophilus+influenzae+by+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).</li>
<li>Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Opsonophagocytic+Killing+Assay+Using+HL-60+Cells+for+Detection+of+Functional+Antibodies+against+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes.</a> mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Immunoprotective+Proteins+of+Streptococcus+pneumoniae+Identified+by+Opsonophagocytosis+Killing+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen.</a> Infection & Immunity. 86 (9), (2018).</li>
<li>Humphries, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+Antibody-Mediated%2C+Complement-Dependent+Opsonophagocytic+Activity+against+Neisseria+meningitidis+Serogroup+B+in+England%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).</li>
<li>List of Tier 1 BSAT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.selectagents.gov/ohp-app1.html">www.selectagents.gov/ohp-app1.html</a> (2017).</li>
<li>Jansen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+highly+encapsulated+Streptococcus+pneumoniae+strains+in+a+flow-cytometric+assay+for+assessment+of+the+phagocytic+capacity+of+serotype-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).</li>
<li>Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+opsonic+antibodies+to+the+gamma-D-glutamic+acid+capsule+of+Bacillus+anthracis+by+immunization+with+a+synthetic+peptide-carrier+protein+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).</li>
<li>Chabot, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+rhesus+macaques+against+inhalational+anthrax+with+a+Bacillus+anthracis+capsule+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine.</a> Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).</li>
<li>Chabot, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+capsule+conjugate+vaccine+against+inhalational+anthrax+in+rabbits+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys.</a> Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).</li>
<li>Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html">www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html</a> (2017).</li>
<li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+and+Glutaraldehyde+Inactivation+of+Bacterial+Tier+1+Select+Agents+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues.</a> Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).</li>
<li>Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf">https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf</a> (2011).</li>
<li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+pneumococcal+polysaccharide+conjugate+vaccine+%28conjugated+to+CRM197+carrier+protein%29+in+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults.</a> Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).</li>
<li>Adams, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+of+childhood+Haemophilus+influenzae+type+b+%28Hib%29+disease+in+the+Hib+vaccine+era%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era.</a> JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).</li>
<li>Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+meningococcal+C+conjugate+vaccine+in+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK.</a> Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+opsonophagocytic+killing+activity+with+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+human+immunodeficiency+virus-infected+Ugandan+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults.</a> Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).</li>
<li>Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+Killing+Assay+to+Assess+Immunological+Responses+Against+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).</li>
<li>Ezzell, J. W., Welkos, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsule+of+Bacillus+anthracis%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The capsule of Bacillus anthracis, a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).</li>
<li>Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+macrophages+in+anthrax%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academies+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On the role of macrophages in anthrax.</a> Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Chua, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+reprograms+waves+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+on+phagosomal+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).</li>
<li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Alkalinization+by+Chloroquine+Suppresses+Pathogenic+Burkholderia+Type+6+Secretion+System+1+and+Multinucleated+Giant+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells.</a> Infection & Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+promiscuity+for+antibody-FcRn+interactions+across+species%3A+implications+for+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies.</a> International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).</li>
<li>Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibodies+use+complement+to+regulate+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">How antibodies use complement to regulate antibody responses.</a> Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).</li>
<li>Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+routine+opsonophagocytosis+assay+to+predict+invasive+pneumococcal+disease+efficacy+of+conjugate+vaccine+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children.</a> Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).</li>
<li>Wolf, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolf%2C+JJ+%22Special+Considerations+for+the+Nonclinical+Safety+Assessment+of+Vaccines%22">Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines</a>. , Elsevier. 243-255 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 야기할 수 있는 상업적 또는 기타 협회가 없습니다.

캡슐 계 백신은 수많은 세균 성 병원균에 대해 효과적인 것으로 나타났으며, 많은 사람들이 인간25,26,27에서사용하기 위해 허가된다. 이들 백신은 캡슐을 표적으로 하는 항체를 생성함으로써 작용하며 이들 연구의 대부분은 OPKA를 사용하여 항체13,14, 16,28,29의opsono-phagocytic 기능을 나타내고 있다. 생물 안전 문제와 작업 용이성으로 인해 B. 탄트라시스 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 동물의 항체를 평가하기 위한 OAA를 개발했습니다....

병원체의 인식, 준수, 내재화 및 분해는 1883년 일리아 메치니코프가 처음 기술한 숙주 인내 면역 반응에서 현저한 통로인식세포증1,3에 필수적이다. 면역 계통의 그밖 세포뿐만 아니라 식세포 백혈구는 표적의 그들의 선택에 있는 높게 차별적입니다; 그들은 패턴 인식 수용체 (PRR)4,5의레퍼토리에 의해 병원균 관련 분자 패턴을 통해 "전염성 비 자기"와 "비 감염성 자아"를 구별 할 수 있습니다. 병원체의 숙주 인식은 또한 보완 및 항체6과같은 숙주 opsonins의 결합으로 발생할 수 있다. opsonization에게 불린 이 프로세스는, phagocytic 세포에 opsonic 수용체 (예를 들면, 보충 및 Fc 수용체)에 결합시 내성을 강화하는 이 분자로 병원체를 코팅합니다6. 병원체가 식세포에 부착하려면, 그들의 cognate 리간드와 다중 수용체의 집단 결합이 필요하다. 그런 다음에야 내산화6을 시작하기 위해 호스트 셀 내부의 신호 캐스케이드를 트리거하고 유지할 수있습니다.
병원균의 허가와 감염 예방에 있는 phagocytosis의 중요성 때문에, 세포외 병원체는 그들의 생존을 연장하기 위하여 이 과정을 전복하는 수많은 쪽을 개발했습니다. 중요도의 한 가지 전략은 음이온 중합체(예를 들어, 다당류 또는 폴리아미노산) 캡슐의 생산으로, 그 전하에 의한 항식세포이며, 면역성이 좋지 않으며, PRRs6,7로부터세균용 봉투에 분자를 보호한다. Cryptococcus neoformans 및 연쇄상 구균 폐렴과 같은 병원체는 사카라이드 폴리머로 구성된 캡슐을 가지고 있는 반면, 황색포도상구균 표피증 및 일부 바실러스 종은 폴리 ɣ 글루타믹 산 (PGGA)7,8을생산한다. 그러나 그밖 병원체는 비 전염성 자기를 닮은 캡슐을 생성합니다. 예를 들어, 연쇄상구균 표겐과 B. 세레우스의 병원성 균주는 항식세포뿐만 아니라 면역계통9,10에의해 외국으로 인식되지 않을 수 있는 히알루론산 캡슐을 갖는다.
캡슐을 운반대 단백질로 유도하여 가난한 T-독립적인 항원에서 높은 혈청 항체 티터를 유도할 수 있는 면역성 T 의존성 항원으로 변환한다11,12. 이 전략은 S. 폐렴, 혈우병 인플루엔자, 니세리아 수막기티드11에대한 허가된 백신에 사용된다. 항체의 opsonic 활동은 일반적으로 opsono-phagocytic 살인 분석서(OPKA)13,14,15,16에의해 평가되었다. 이러한 작용성 항체가 식세포증을 유발하고14명을죽일 수 있는지 여부를 테스트합니다. 그러나, B. 탄트라시스17을포함하여 Tier 1 생물학 선택 에이전트 및 독소 (BSAT)와 같은 전염성 병원체를 가진 OPKA의 사용은 위험하고 보안 위험을 제시합니다; 이러한 에세이는 선택 에이전트의 광범위한 처리가 필요합니다. 선택 에이전트 처리는 제한된 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서만 수행 할 수 있습니다; 이러한 분야에서의 업무는 따라야 할 수많은 안전 및 보안 예방 조치로 인해 장기간 운영 절차를 요구합니다. BSL-3 실험실은 또한 현미경 및 세포계와 같은 OPKA 작업에 사용되는 특수 장비를 전형적으로 갖추지 않습니다. 따라서, 우리는 불활성화박테리아(18),19의사용에 기초하여 대안적 분석체를 개발하였다. 우리는 이것을 내면화와 살인에 의존하지 않는 opsono 준수 분석 (OAA)로 지칭합니다. 대신, 편화불활성 병원균의 준수는 식세포증의 지수로 사용된다. 기계적으로, OAA는 준수가 선견자를 발생하고 내재화 및 세포 내 살인과 밀접하게 얽혀 있기 때문에 적합한 대체품입니다. 생물안전적 관점에서, OAA는 전염하는 제제의 최소한의 취급이 필요하고, OPKA보다 더 짧은 지속 시간의 실험적이며, 불활성화 된 병원체의 재고가 생산및 옮겨진 후 BSL-2 실험실에서 수행 될 수 있기 때문에 선호된다.
우리는 캡슐 공주게이트로 예방 접종된 비인간 영장류(NHP)의 혈청에서 발견되는 항체의 opsonic 기능을 검사하기 위해 OAA의 활용을 입증한다[즉, B. 탄트라시스로부터 PGGA] 네이세리아 수막의외부 막 단백질 복합체(OMPC)에 공각]20. 혈청 협소화 된 바실리는 부착 된 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 배양되었다. 고정 후, 세포 단층 및 부착 된 바실리는 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 세균성 준수는 세균성 준수가 대조군혈청(20)에비해 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 NHPs로부터 혈청으로 배양되었을 때 증가하였다. 탄집 도전20,21의생존과 상관 관계가 있는 준수. 따라서, OAA의 사용은 항체항체의 기능을 특징으로 하고 백신 후보의 시험을 크게 촉진시켰다.

<table><tbody><tr><td>0.20 & 마이크로; m 주사기 필터 (25mm, 재생 셀룰로오스)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기 (Luer-Lok tip)</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15&micro; 96 well black plates (plate #1 for imaging)</td><td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>75cm sq. 조직 배양 처리 플라스크</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>한천 (분말)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Baby Rabbit Complement</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract BD</td><td>, Sparks, MD</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td> <td>BD, Sparks, MD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Blood Agar (TSA with Sheep Blood) 플레이트</td><td>Remel, Lenexa, KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Sarstedt, Newton, NC</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 웰 세포 배양 플레이트 (희석용 플레이트 #2 & 3)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Broth</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고혈당</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11965-092</td><td>에는 4500mg/L 포도당, 4mM L-글루타민, 페놀 레드</td></tr><tr><td>EVOS FL 자동 세포 이미징 시스템(형광 현미경)</td>이 포함되어 있습니다.<td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>감마선 조사되지 않음, 열 불활성화</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS 세포 마스크 주황색 세포 염색</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>혈구계(Improved Neubauer)</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>인도 잉크 솔루션</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루타민 (200 mM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td><td>25030081</td><td>추가 2mM L- 글루타민</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U (도립 복합 현미경)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 칼슘 또는 마그네슘 없음</td><td>Lonza, Walkersville, MD</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 솔루션, 100x</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(100 x 15mm)</td><td>Falcon, Corning, Durham, NC</td><td>351029</td><td>한천 플레이트용</td></tr><tr><td>RAW 264.7 대식 세포 세포주(Tib47)</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope)</td><td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 opsono-준수 분석

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

opsono 준수 분석법은 전문 식세포에 세균성 병원체의 부착을 열거하는 기능성 분석입니다. 준수는 phagocytosis와 살인에 필수이기 때문에, 분석법은 opsono-phagocytic 살인 분석의 대안 방법입니다. opsono 준수 분석의 장점은 여러 실험에 걸쳐 표준화를 허용하는 불활성화 된 병원체 및 포유류 세포주를 사용하는 옵션입니다. 분석에서 불활성화 된 병원체의 사용은 또한 생물 안전 수준 3 전염성 요원 및 기타 악성 병원균과 함께 작동을 용이하게합니다. 우리의 작업에서, opsono 준수 분석체는 탄저병 캡슐 기지를 둔 백신으로 면역화된 동물의 세라로부터 항체의 기능적 능력을 평가하기 위해 사용되었으며, 고정 된 바실러스 탄트라시스의 부착을 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 유도하는 데 사용되었습니다. 자동 형광 현미경 검사는 대식세포에 고부딩하는 바실리의 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 증가된 준수는 혈청에 있는 항체 항체의 존재와 상관관계가 있었다. 높은 혈청 항체 항체 농도를 전시한 비인간 영장류는 탄탈병 도전으로부터 보호되었다. 따라서, opsono-준수 분석체는 세라에서 항원 특이적 항체의 생물학적 기능을 해명하고, 백신 후보 및 기타 치료제의 효능을 평가하고, 면역의 가능한 상관관계로서 작용할 수 있다.

이 섹션은 OAA가 항체의 생물학적 기능을 검사하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 결과와 함께 OAA 실험 중에 수집된 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 여기서, 분석은 탄집병 백신 후보의 효능을 평가하기 위해 성공적으로 사용되었다. 캡슐화가 거의 또는 전혀 캡슐화되지 않아 숙주 세포를 고수하여 높은 배경을 생성하는 바실리에 캡슐화 상태를 확인하는 것이 중요합니다. 도 1은 캡슐화를 검사하기 위해 인도 잉크로 부정적으로 염색한 B. 탄트라시스 에임스의 이미지입니다. OAA는 여러 개의 인접 한 시야 필드를 조명하고 공초점 현미경 검사를 사용하는 경우 여러 스택 또는 단면을 필요로합니다. 따라서, 바실리가 너무 어둡거나 사진 표백제도 너무 빨리 인지 확인해야 합니다. 도 2는 FITC로 표시된 바실리의 이미지입니다. 도 3은 세포 단층층에 부착된 ...

opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.

바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Opsono-Adherence Assay는 백신 접종 후 동물에서 생성된 기능성 오포손 항체의 존재를 분석하며, 이는 허가된 여러 인간 백신의 효능과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이 분석은 생물학적 선별 제제 및 기타 감염성 병원체와 함께 사용하는 것이 바람직하며 비활성화된 BSL-3 제제가 전달된 후 BSL-1 또는 BSL-2 실험실에서 수행할 수 있습니다. 바실러스 탄저병 캡슐(Bacillus anthracis capsule)을 포함한 박테리아 캡슐에 대한 항체는 감염 동물 모델에서 효과적인 것으로 입증되었습니다.Opsono-Adherence 분석은 동물을 감염시키지 않고 항체를 기능적으로 평가합니다. 캡슐화된 악성 탄저균 균주를 작업할 때 모든 기관의 안전 및 보안 절차를 따르십시오. 이 비디오에서는 생물 안전성 레벨 2 조건에서 비활성화된 균주를 사용하고 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RAW 264.7 세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. opsono-adherence 분석을 위해 세포를 플레이트링하려면 플라스크를 새 배지로 교체하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 피펫을 위아래로 사용하여 세포 덩어리를 분해하여 세포 계수를 더 쉽게 할 수 있습니다.플레이트 14, 96 웰 0.15 미크론 두께의 유리 평면 바닥 플레이트에 웰 당 000 셀. 세포가 3일 동안 성장하도록 하고 OAA를 수행하기 하루 전에 사용한 배지를 교체합니다. 외피의 3 일 후에, 세포의 수는 대략 50, 우물 당 000의 세포이어야 한다.분석을 시작하려면 NBY 한천 플레이트에서 분리를 위해 줄무늬를 만들어 포자 스톡에서 Bacillus anthracis의 마스터 플레이트를 준비합니다. 시연을 위해 양 혈액 한천 플레이트가 사용되었습니다. 육수에서 배양하기 전에 섭씨 37도에서 하루 동안 배양하십시오.그런 다음 통풍이 잘되는 250ml 플라스크에 30ml의 배양 육수를 여러 군데의 간균 콜로니와 함께 접종합니다. 배양액을 125RPM, 섭씨 37도, 20%CO2, 습도 20-24시간 동안 흔듭니다. 충분한 캡슐화를 보장하기 위해 인도 잉크로 네거티브 염색을 사용하고 Bacilli가 고정 전에 짧은 사슬에 있는지 확인하십시오.이렇게 하려면 현미경 슬라이드에서 5마이크로리터의 박테리아 현탁액과 2마이크로리터의 인도 잉크를 혼합합니다. 그런 다음 기포가 생성되지 않도록 서스펜션 위에 1 또는 1.5 미크론 두께의 커버 유리를 놓습니다. 광학 현미경에서 40배에서 100배의 오일 대물 렌즈를 사용하여 박테리아 현탁액을 관찰합니다.두꺼운 캡슐에는 인도 잉크가 포함되지 않습니다. 각 박테리아를 둘러싼 클리어런스 영역을 관찰하여 Bacilli가 캡슐화되었는지 확인합니다. 또한 간균 사슬이 짧은지 확인하십시오.Colony Forming Units 또는 CFU를 결정하려면 PBS 용액에서 100마이크로리터의 배양을 1에서 10까지 연속적으로 희석하고 양 혈액 한천 플레이트에 플레이트 배양 희석액을 입력합니다. 섭씨 37도에서 12-18시간 동안 배양합니다. CFU를 세고 배양 밀리리터당 박테리아 수를 계산합니다.간균이 충분히 캡슐화, 희석 및 플레이팅되었는지 확인한 후 최종 농도 4%파라포름알데히드 4%에서 배양액 30ml에 16%파라포름알데히드 10ml를 추가하여 남아 있는 박테리아 배양액을 고정합니다. 볼륨을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 상온에서 7일 동안 셰이커에서 천천히 저어줍니다.무균 상태를 테스트하려면 4ml 또는 10% 용량의 고정 박테리아 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. PBS를 첨가하여 현탁액을 세척하고 최소 3000G에서 45분 동안 펠릿화합니다. 그런 다음 상등액을 제거하여 푹신한 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.이 세척을 최소 2회 반복한 후 고정된 샘플을 4ml PBS에 재현탁합니다. 세척 중에 고정제가 생존력 테스트를 방해하지 않도록 모든 고정제를 제거해야 합니다. 필요한 경우 세탁 횟수를 늘리십시오.생존력 테스트를 위해 40ml의 박테리아 성장 배지에 세척된 현탁액 4ml를 접종하고 섭씨 37도에서 7일 동안 배양합니다. 탁도를 측정하기 위해 7일 전후에 분광 광도계에서 600나노미터의 광학 밀도를 확인하십시오. 육수 배양에서 7일 동안 배양한 후, 최소 100마이크로리터의 육수를 한천 플레이트에 플레이트하고 다시 7일 동안 배양합니다.탁도가 증가하지 않고 플레이트에서 성장이 보이지 않으면 원래 배양액은 무균으로 간주되며 BSL-2 실험실로 옮겨질 수 있습니다. 이전 승인에 대한 기관 지침을 따릅니다. 불활성화한 박테리아 스톡을 PBS에서 세 번 세척하여 고정액을 제거합니다.FITC 용액을 최종 농도 75마이크로그램/밀리리터로 첨가합니다. 섭씨 4도에서 18-24시간 동안 혼합물을 천천히 저어줍니다. 이전과 같이 박테리아를 세척하여 과도한 FITC를 제거합니다.최종 세척 후 동일한 시작 볼륨의 PBS에 Bacilli를 다시 현탁시킵니다.Bacilli를 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 인간이 아닌 영장류의 소량의 테스트 혈청을 섭씨 56도에서 열 블록 또는 PCR 기계에서 30분 동안 가열하여 비활성화합니다.FITC로 표지된 박테리아를 PBS로 2회 세척하여 15, 000회 G에서 3-5분 동안 펠릿화합니다. 동일한 시작 볼륨의 PBS에서 다시 일시 중단합니다. 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 테스트 혈청을 세포 배지에서 연속적으로 희석합니다.또 다른 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 각 웰에 10마이크로리터의 희석된 테스트 혈청을 추가합니다. 그런 다음 갓 재구성한 아기 토끼 10마이크로리터를 추가합니다. 플레이트 3에 20의 감염 다수에 대해 적절한 부피의 FITC 표지 바실리를 추가합니다.예를 들면, 50, 000 곱하기 50 당 20 간균, 000의 세포를 포함하는 양에. 플레이트 3의 각 웰을 적절한 부피의 셀 배지로 총 105마이크로리터로 채웁니다. 3번 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 5%CO2의 습도와 함께 배양하여 Bacilli를 옵소니화합니다.부착 셀이 들어 있는 플레이트 번호 1을 섭씨 37도의 열 블록에 놓습니다. 멀티채널 피펫터를 사용하여 웰에서 사용한 배지를 제거하고 플레이트 번호 3에서 100마이크로리터의 opsonize 박테리아로 신속하게 교체하여 피펫팅 중에 웰에 기포가 생성되지 않도록 합니다. 세포 단층을 방해하지 않으려면 웰 측면에 부피를 추가하십시오.1번 플레이트를 섭씨 37도에서 5%CO2와 습도로 30분 동안 배양하여 접착시킵니다. 섭씨 37도의 열 블록 위에 150마이크로리터의 PBS로 각 웰을 5번 세척하여 부착되지 않은 간균을 제거합니다. 세척 중에 세포가 우발적으로 분산되지 않도록 우물 측면에 피펫을 넣습니다.각 웰에 150마이크로리터의 4%파라포름알데히드를 넣고 1시간 동안 세포를 고정합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후 10ml의 PBS에 2마이크로리터의 고함량 스크리닝 오렌지 세포 염색을 혼합합니다. 그런 다음 이 염색 용액 150마이크로리터를 첨가하여 세포를 고정하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.스테이지에 플레이트 1번을 놓고 명시야 또는 위상차를 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. Acquisition 탭에서 플레이트 설정으로 96-well format을 선택합니다. 그런 다음 채널 설정을 선택합니다.그런 다음 타일 모드 설정을 선택합니다. 획득할 이미지의 수를 나타냅니다. 획득 모드를 흑백 또는 단색으로 변경하고 Binning을 최소 2x2로 설정합니다.자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 기능을 얼마나 자주 수행해야 하는지 표시합니다. 그런 다음 사용 가능한 경우 Z-Stack 기능을 켭니다.세포 단층과 부착 간균의 두께를 캡처할 Z-Stack의 수를 표시합니다. 이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 이제 자동 이미징 프로그램을 실행합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 수집 및 분석을 수행합니다. Bacillus anthracis의 Ames 균주는 캡슐화를 검사하기 위해 인도 잉크로 음성 염색되었습니다. 캡슐화 상태가 확인되어야 하며, 캡슐화가 거의 또는 전혀 없으면 항체가 없는 숙주 세포에 부착되어 높은 백그라운드를 생성하게 됩니다.Bacilli의 형광 강도 및 광 표백 특성은 컨포칼 현미경을 사용하여 조사했습니다. 간균의 형광이 시간이 지남에 따라 크게 퇴색되지 않는지 확인하는 것이 중요한데, 이는 간균이 이미징 중에 빛에 장시간 노출되기 때문입니다. 세포 단층에 부착된 Bacillus anthracis의 최대 투영 이미지는 다음과 같습니다.이는 opsono-adherence assay를 위해 계산되고 점수가 매겨진 대표적인 시야입니다. 캡슐 접합체 항혈청과 함께 배양된 바실러스의 부착 증가는 바실러스를 옵소니화한 항캡슐 항체의 존재 때문입니다. 10 및 50 μg의 캡슐 접합체를 접종한 비인간 영장류의 혈청 역가는 접합체 및 캡슐 단독의 역가보다 유의하게 높습니다.우리는 유세포 분석법과 비부착 세포인 인간 호중구를 사용하여 옵소닉 활성을 측정하고 박테리아 표면의 캡슐을 정량화하는 유사한 분석을 개발하고 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 opsono-adherence assay에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. BSL-3 병원체와 함께 일하는 것은 매우 위험하다는 것을 잊지 마십시오.제도적 지침과 안전 예방 조치를 엄격히 준수해야 합니다.

opsono-adherence-assay-to-evaluate-functional-antibodies-vaccine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 인간 호중구와 폐렴구균의 공동 배양을 사용한 체외 oponophagocytic killing assay를 보여줍니다. 항체와 보체 단백질은 박테리아의 옵슨화를 촉진하여 호중구가 박테리아를 인식하고 죽일 수 있도록 하여 성공적인 호중구 옵소노식세포 활성을 보여줍니다.

박테리아 병원체에 대한 Opsonophagocytic Killing Activity 평가

이 비디오는 옵소니화된 박테리아와 면역 세포 간의 상호 작용을 조사하기 위한 옵소노 준수 분석을 보여줍니다. 항캡슐 항체가 포함된 테스트 혈청으로 처리된 형광 표지 박테리아는 대식세포로 배양됩니다. 대식세포를 형광으로 염색한 후, 대식세포 표면에 부착된 박테리아를 시각화를 위해 현미경으로 관찰합니다.

안티 캡슐 항체에 의한 캡슐화된 박테리아의 옵소니화를 평가하기 위한 Opsono-Adherence Assay

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

이 opsonophagocytic 죽이 분석 결과 응답 하 고 다른 치료 조건에 기반 하는 박테리아를 죽 일 phagocytic 면역 세포의 기능을 비교 하는 데 사용 됩니다. 고아 하 게,이 분석 결과 opsonin로 박테리아에 대하여 제기 하는 항 체의 효과 기 기능을 평가 하기 위한 황금 표준 역할을 합니다.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

마이코플라스마 폐렴 감염에서 혈청 검사는 좋은 결과를 생성할 수 있지만 면역학적 교차 반응으로 인해 특이도가 낮습니다. 이 논문에 설명된 사내 항원 포획 ELISA는 높은 종 특이성을 보장하며 M. pneumoniae의 정확한 진단을 위한 신뢰할 수 있는 선별 검사로 나타났습니다.

마이코플라스마 폐렴의 특이적 검출을 위한 항원-포획 효소 결합 면역흡착 분석

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(RA)을 개발했습니다. FDA 승인 RA를 나노에멀젼에 첨가함으로써, 나노에멀젼의 근육 주사 후 질과 소장에서 항원 특이적 sIgA를 촉진시켰다.

OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

배우세요 Bacillus anthracis 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석 방법을. 이 분석은 BSL-1 또는 BSL-2 실험실에서 안전하게 수행할 수 있으며 백신 효능과 상관관계가 있습니다.

바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석

더 많은 동영상 탐색