Name: 빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 쥐 뇌에서 탄소섬유 미세전극을 이용한 전기생리학 기록으로 복부 테그멘탈 영역 수용체 조작이 어떻게 단위시간 도파민 방출을 조절하는지 확인하는 방법을. 이 기법은 중독 연구에 중요한 신경생물학적 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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작업은 엘리자베스 타운 대학 (R.J.W, M.L., 그리고 L.M.), NSF 대학원 펠로우십 (R.J.W.) 및 예일 의과 대학 (N.A.)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 엘리자베스 타운 대학과 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 CIS-FSCV를 활용하는 마취 된 쥐 준비에 특정합니다.
1. 외과 전 준비
<ol><li>전극 용액 준비<ol>
<li>전극 백필 용액을 만들기 위해 염화 16140mM 칼륨으로 아세테이트 4M의 용액을 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전극 준비<ol>
<li>진공 흡입을 사용하여 T-650 탄소 섬유 (직경 7 μm)를 borosilicate 유리 모세관 (길이 = 100mm, 직경 = 1.0mm, 내부 직경 = 0.5 mm)에 삽입하십시오.</li>
		<li>탄소 섬유가 유리 모세관 내부에 놓이면 유리 모세관을 수직 전극 풀러에 넣고 열 원소는 모세관 한가운데에 대략 배치합니다. 자석을 끄고 히터를 55로 설정합니다.</li>
		<li>모세관을 당긴 후, 전극의 끝이 가열 요소에 의해 포위되지 않도록 조심스럽게 상부 모세관 홀더를 올립니다.</li>
		<li>날카로운 가위를 사용하여 여전히 모세관의 두 조각을 연결하는 탄소 섬유를 잘라냅니다. 이로 인해 두 개의 분리된 탄소 섬유 미세 전극이 발생합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경하에서, 탄소 섬유가 유리 끝을 넘어 약 75-100 μm를 확장되도록 날카로운 메스로 노출된 탄소 섬유를 조심스럽게 잘라냅니다.</li>
		<li>가벼운 현미경을 사용하여 전극이 모세관을 따라 균열이 없는지 확인하십시오. 또한 탄소 섬유가 모세관을 빠져나가는 씰이 눈치채기 어렵고 균열이 없도록 하십시오. 참고: 좋은 씰은 녹음 중 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다. 보다 상세한프로토콜은17,18,19에 게재된 연구를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기준 전극 제조<ol>
<li>5cm 실버 와이어에 골드 핀을 납땜.</li>
		<li>양극을 금속 종이 클립 또는 다른 도체, 음극에 핀에 부착하고, 종이 클립과 실버 와이어가 0.1 M HCl에 침수되는 동안 전압(~2V)을 적용합니다.</li>
		<li>백색 코팅(AgCl)이 실버 와이어에 나타나면 전압을 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이식용 전극 준비<ol>
<li>얇은 절연 와이어에 금 핀을 납땜 (길이 10cm, <0.50 mm 직경).</li>
		<li>골드 핀 맞은편 와이어에서 절연 ~5cm를 제거합니다.</li>
		<li>전극 용액의 중간쯤에 전극을 채웁니다.</li>
		<li>절연 와이어를 전극에 삽입합니다. 참고: 와이어는 전극 내부의 탄소 섬유와 접촉해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전극 이식
<ol><li>성인, 남성, 스프라그 Dawley 쥐 (250-450 g) 멸균 식염수에 용해 된 0.5 g/mL 우레탄의 인트라피오네 주사(1.5 g/kg 또는 1mL/kg 부피)를 준다. 1.0-1.2 g/kg의 초기 우레탄 복용량으로 시작합니다. 동물이 우레탄 투여 후 20분 동안 유해 자극 테스트(tail pinch)에 여전히 반응하는 경우 총 용량 1.5g/kg의 요르탄을 추가로 투여하십시오. 참고: 0.5 g/mL 우레탄 용액을 준비하려면 식염수 10g(~10mL)에 우레탄 10g을 넣습니다. 우레탄은 발암 물질이며 주의해야 합니다. 우레탄은 케타민/자일라진 및 클로랄 수화물20,21과같은 다른 마취제와 마찬가지로 도파민의 수준을 변경하지 않기 때문에 중요한 마취제이다.</li>
	<li>동물이 심하게 마취되고 유해 성 자극 (예 : 발가락 핀치)에 반응하지 않는 경우, 스테레오 탁스 프레임에 놓습니다. 쥐의 각 눈에 안과 윤활유를 바르습니다. 참고 : 이것은 비 생존 수술이지만 좋은 무균 기술이 권장됩니다.</li>
	<li>2단 스크럽(즉, 요오도포비도 스크럽, 70% 에탄올 스크럽, 3주기 반복으로 수행)을 사용하여 쥐의 두피를 청소하십시오.</li>
	<li>멸균 된 바늘 코 핀셋과 수술 가위를 사용하여 두피 조직을 잘라냅니다. 아래에 설명된 다양한 이식을 위한 공간을 만들기 위해 상당한 양의 조직을 제거하십시오.</li>
	<li>살균 된 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골 표면을 부드럽게 청소하십시오. 그런 다음 과산화수소 3 %의 2-3 방울을 적용하여 람다와 브레그마를 식별하십시오.</li>
	<li>스테레오탁스 또는 핸드 드릴(1.0mm, ~20,000rpm)을 사용하여 1.5mm 직경의 구멍을 브레그마에 2.5mm 전방으로 드릴링하고 3.5mm 측면을 브레그마로 드릴링합니다. 이 구멍에 나사(1.59mm O.D., 3.2mm 길이)를 부분적으로 이식합니다( 중간 정도, 제자리에 단단히 고정될 때까지). 열 손상을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 관개멸식 식염수식을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>기준 전극의 경우, 1.0mm 직경 구멍 1.5mm 전방 및 3.5mm 측면을 왼쪽 반구의 bregma에 드릴링합니다.</li>
	<li>손으로, 이식 된 나사의 머리 주위에 및 머리 아래에 참조 와이어를 감싸면서,이 구멍에 기준 와이어의 ~ 2mm를 삽입합니다.</li>
	<li>나사를 완전히 이식하여 기준 전극을 제자리에 고정시합니다.</li>
	<li>오른쪽 반구에서, 1.5mm 직경 구멍 1.2 mm 전방 및 1.4 mm 측면 bregma에 드릴.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 듀라를 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>자극전극의 경우 5.2mm 후방을 중심으로 한 사각형 구멍(전방 후방 2mm, 내측 측측)을 드릴링하고 1.0mm 측면으로 브레그마에 배치합니다.</li>
	<li>스테레오전술 암 바를 사용하여 양극성 자극 전극/가이드 캐뉼라를 듀라 아래 5mm 아래로 낮춥춥시다. 전극이식 시 출혈이 있는 경우 멸균 면봉과 거즈를 사용하여 출혈을 최소화하십시오. 참고: 이 방법에 사용되는 양극성 자극 전극에는 가이드 캐뉼라(재료표)가미리 갖추어져 있습니다. 이 항목과 함께 사용되는 내부 캐뉼라는 가이드 캐뉼라에 완전히 삽입할 때 양극성 자극 전극의 갈래로 플러시되어야 합니다. 이렇게 하면 내부 캐뉼라가 약 1mm 떨어져 있는 자극제의 두 갈래 사이에 직접 앉을 수 있습니다. 유사한 프로토콜은 다른 곳에서설명된다 14.</li>
	<li>스테레오전술 암 바를 사용하여 듀라 아래 탄소 섬유 미세 전극을 4mm 낮춥춥시다. 이 위치는 줄무늬의 가장 등쪽 부분에 있습니다.</li>
	<li>레퍼런스 와이어와 탄소 섬유를 강력한 iostat에 연결합니다.</li>
	<li>60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분 동안 삼각형 파 형태(-0.4-1.3V, 400 V/s)를 적용합니다. 참고: 전형적으로, 뇌의 탄소 섬유 미세 전극에 파형을 적용할 때, 산화물 그룹은 탄소 섬유의 표면에 추가됩니다. 이 반응의 평형은 기록하기 전에 도달해야합니다; 그렇지 않으면 상당한 드리프트가발생합니다 19. 더 높은 주파수(60Hz)에서 전극을 사이클링하면 탄소 섬유가 평형을 더 빠르게 달성할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 탄소 섬유 최적화 및 자극 전극 /가이드 캐뉼라 위치
<ol><li>자극기를 설정하여 60Hz, 24펄스, 300 μA 전류 및 2ms/phase의 펄스 폭을 가진 양극성 전기 파형을 생성합니다.</li>
	<li>자극기를 5mm에서 7.8mm로 0.2mm 단위로 부드럽게 낮춥시다. 각 증분에서 VTA를 자극합니다. 참고: 더 많은 등쪽 깊이 (5-6 mm)에서 뇌의 자극은 일반적으로 (시간의 ~ 80 %)는 쥐의 수염을 트위치로 유발합니다. 더 깊이에서, 수염은 두라 아래 7.5-8.2 mm 사이에서 발생하는 경련을 중단합니다. 수염이 경련을 멈추면 자극하는 전극이 VTA 에 가깝거나 VTA에 있을 것입니다. 이것은 모든 쥐에서 발생하지 않으며, 수염 경련의 부족은 양극성 자극 전극 / 주입 캐뉼라가 잘못 배치되어 있다는 표시로 받아들여서는 안됩니다. 수염 경련은 모든 마취제(예: 이소플루란)에 대해 발생하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>자극이 탄소 섬유 미세 전기 전극 (현재 등쪽 줄무늬)에서 완화 DA 방출을 생성 할 때까지 양극성 자극 전극 / 가이드 캐뉼라를 계속 낮춥니다. 참고: 등쪽 조각의 DA 방출은 양극성 전극이 VTA에 이식되는 경우 항상 발생하는 것은 아니지만 VTA 자극시 등쪽 점막에서 DA 방출을 관찰하는 것은 일반적으로 NAc 코어에서 좋은 신호가 관찰될 것이라는 좋은 신호이다.</li>
	<li>탄소 섬유 미세 전극을 듀라 아래 6.0mm 이상 될 때까지 낮춥다. 이것은 NAc 코어의 가장 등쪽 부분입니다.</li>
	<li>VTA를 자극하고 DA 피크의 피크 진폭을 기록합니다.</li>
	<li>가장 큰 DA 방출을 생성하는 현장에서 탄소 섬유 마이크로 전극을 낮추거나 올립니다.</li>
	<li>DA 응답의 피크가 0.6V에서 명확한 산화 피크와 -0.2 V의 감소 피크인지 확인합니다. 이 피크는 DA를 나타냅니다.</li>
</ol>4. 조합 주입 및 자극 FSCV 기록
참고: 그림 1은 VTA 마이크로인퓨전 전후에 기록할 타임라인을 보여 줍니다.
<ol><li>탄소 섬유와 자극 전극/가이드 캐뉼라 위치가 최적화되면 ~ 20-30 분 동안 자극하십시오. 참고: 현재 자극 매개 변수에서 3분마다 한 번 이상 자극하지 말고,22를다시 로드할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>안정적인 기준선(<20% 변형)을 달성한 후, 양극성 자극기로 미리 장착된 가이드 캐뉼라에 손으로 내부 캐뉼라를 부드럽게 낮춥니다.</li>
	<li>캐뉼라 삽입 자체가 호출된 신호의 변화를 일으키지 않도록 추가2-3 기준 기록을 가져 가라. 경우에 따라 내부 캐뉼라를 삽입하고 제거하면 VTA가 손상될 수 있습니다. 이 기준 기간(>20%)에 걸쳐 신호가 크게 변경되면 기준선이 다시 안정될 때까지 추가로 3-4 레코딩을 수행합니다.</li>
	<li>주사기 펌프와 미세 주사기를 사용하여 0.5 μL의 용액(예: 0.9% 식염수, N-메틸-D-아스파르타트 [NMDA], (2R)-아미노-5-인포노발레산[AP5])을 VTA에 2분 동안 주입한다.</li>
	<li>사후, 제거하기 전에 적어도 1 분 동안 내부 캐뉼라를 둡니다. 참고: 일부 약물은 약물 역학에 따라 더 긴 시간 동안 내부 캐뉼라를 떠나야 할 수 있으며, 내부 캐뉼라를 제거하면 약물이 내부 캐뉼라를 통해 다시 이동하게 될 수 있습니다. 우려가 있는 경우, 녹음 전체를 안내서 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 남길 수 있습니다. 그렇지 않으면 이 1분 간격 후에 레코딩이 시작될 수 있습니다.</li>
	<li>3분마다 계속 기록하여 사후 효과를 측정합니다. 참고: 제어 솔루션을 주입하고 효과가 관찰되지 않으면 두 번째10을주입할 수 있습니다. 내부 캐뉼라 또는 식염수 주입을 삽입하여 발생하는 변경된 DA 방출이 있는 경우 신호는 일반적으로 30분 이내에 기준선으로 복구됩니다.</li>
</ol>5. 전극 배치의 조직학적 검증
<ol><li>실험이 끝나면 탄소 섬유 미세 전극을 사용하여 기록 현장에서 작은 병변을 생성합니다.<ol>
<li>전극을 실험 후 교정을 위해 보존해야하는 경우, 모세관 끝을 넘어 ~ 100 μm 돌출 유리 모세관에 배치 텅스텐 와이어를 사용합니다. 이 경우, 뇌에서 전극을 올리고, 기록 전극을 텅스텐 전극으로 대체하고, 동일한 등소벤트랄 좌표로 낮춥니까. 참고: 탄소 섬유는 뇌를 병변하는 데 사용될 수 있으며 기록 부위의 위치를 보다 정확하게 나타낼 수 있습니다. 그러나, 실험자는 이러한 전극을 보정하는 능력을 잃게됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레코딩 사이트를 병변하려면 전원 공급 장치를 사용하여 전압을 적용합니다. 1 V에서 시작하여 10V에 도달할 때까지 10초마다 1V씩 증가합니다.</li>
	<li>펜토바르비탈 (150 mg/kg)의 치명적인 복막 주사를 사용하여 동물을 안락사시킵니다.</li>
	<li>4% 포르말린 용액을 사용하여 쥐를 퍼퓨즈합니다.</li>
	<li>날카로운 기요틴을 사용하여 쥐에서 머리를 제거합니다.</li>
	<li>rongeurs를 사용 하 여, 뇌를 둘러싼 결합 조직과 두개골을 제거 하 고 부드럽게 나머지 조직에서 뇌를 제거.</li>
	<li>뇌를 1일 동안 4% 포르말린에 보관한 다음 30%의 자당으로 옮겨나세요. 참고 : 4 %의 포르말린을 가진 관류는 병변 부위를 볼 필요가 없지만 모범 사례로 병변 부위의 재건을 향상시킬 것입니다.</li>
	<li>저온을 사용하여 뇌의 30 μm 조각을 만듭니다.</li>
	<li>슬라이드에 슬라이스를 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.</li>
	<li>광 현미경을 사용하여 탄소 섬유 미세 전기 전하 병변 및 양극성 자극기 /주입 캐뉼라 위치의 위치를 나타냅니다.</li>
</ol>

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CIS-FSCV는 Phasic DA 방출의 기본 VTA 수용체 메커니즘을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 적절한 레코딩을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 호출된 DA 신호에서 약간의 드리프트와 함께 안정적인 기준선 레코딩을 달성해야 합니다. 안정적인 레코딩을 구축할 가능성을 높이는 중요한 방법은 전극이 60Hz와 10Hz 모두에서 사이클링할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하는 것입니다(일반적으로 60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분). 탄소 섬유가 순환됨에 따라 탄소 섬유 자체가 산화되어 에칭되어 표면적을 감소시켰지만 도파민흡착(23)에대한 새로운 표면을 생성한다. 이로 인해 DA에 대한 민감도가 증가할 수 있습니다. 따라서, 하나는 이 증가 에칭으로 인해 실험에 시간이 지남에 자극 도파민 릴리스에 약간의 증가를 볼 수 있습니다. 또한 초기 마취의 90~120분 이내에 녹음을 시작하면 장시간 안정적인 레코딩이 발생할 가능성이 높아집니다. 이와 같이,...

Phasic 도파민 (DA) 복부 tegmental 지역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens에 (NAc) 보상 관련 행동에 중요 한 역할을 한다. VTA DA 뉴런은 토닉형 발사(3-8Hz)에서 폭발형 발사(>14Hz)1로전환하여 NAc에서 면세 DA 방출을 생성합니다. VTA는 토닉에서 버스트 발사2,3,4,5로의전환을 조절할 수 있는 다양한 소마토덴드리틱수용체를 표현한다. 이러한 수용체중 어느 수용체와 그들의 각각의 입력을 식별, 제어 Phasic DA 릴리스보상 관련 회로가 조직되는 방법에 대한 우리의 이해를 심화합니다. 여기에 설명된 방법론의 목적은, 빠른 스캔 순환 볼탐법(CIS-FSCV)과 결합된 주입 및 자극을 결합하여, Phasic DA 방출을 구동하는 VTA 수용체의 기능을 빠르고 강력하게 평가하는 것이다.
결합된 주입 및 자극(CIS)이라는 용어는 뉴런(여기 VTA) 그룹에 약리적으로 수용체를 조작하고 수용체의 기능을 연구하기 위해 그 뉴런을 자극하는 것을 말합니다. 마취 된 쥐에서, 우리는 빠른 스캔 순환 Voltammetry (FSCV)에 의해 측정된 바와 같이, NAc 코어에서 큰 면세 DA 신호 (1-2 μM)를 연상시키기 위해 VTA를 전기적으로 자극한다. 자극 부위에서 약리학 약물(즉, 수용체 작용제/길항제)의 주입은 해조 된 Phasic DA 방출의 후속 변화를 관찰하여 VTA 수용체의 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다. FSCV는 높은 공간(50-100 μm)과 측두구(10Hz) 해상도를 모두 즐기는 전기화학적 접근법으로 보상 관련, 면책 DA 이벤트6,7을측정하는 데 적합합니다. 이 분해능은 마이크로투아분해와 같은 생체 내 신경화학적 측정보다 더 미세합니다. 따라서, 함께, CIS-FSCV는 Phasic 도파민 방출의 VTA 수용체 조절을 평가하기에 적합합니다.
VTA 수용체 기능을 조사하는 한 가지 일반적인 방법은 이러한 수용체가 뉴런1,8의발사 속도를 변경하는 방법을 해결하는 전기 생리학적 접근법의 조합을 사용하는 것입니다. 이러한 연구는 어떤 수용 체 활성화 시 DA 발사 운전에 관여 이해에 매우 귀중 하다. 그러나, 이러한 연구는 축 하 말기에서 하류 발생할 수 있습니다 제안할 수 있습니다 (즉, 신경 전달 물질의 방출). CIS-FSCV는 VTA 버스트 발사, 면질 DA 방출의 출력이 VTA 점선 및 세포 체에 위치한 수용체에 의해 어떻게 조절되는지에 응답함으로써 이러한 전기 생리학적 연구를 기반으로 합니다. 따라서 CIS-FSCV는 이러한 전기 생리학 연구에 기반을 두는 데 적합합니다. 예를 들어, 니코틴 수용체 활성화는 VTA9에서버스트 발사를 유도할 수 있고, 마취쥐에서 CIS-FSCV는 VTA에서 니코틴아세틸콜린 수용체(nAChR) 활성화가 또한 NAc10,11에서의 phasic DA방출을제어한다는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
또한, Phasic DA 규정의 기계형 검사는 또한 일반적으로 약물의 목욕 응용 프로그램과 함께 슬라이스 준비를 사용하여 공부. 이러한 연구는 종종 세포 체가슬라이스12에서제거되기 때문에 도파민 말기에서 phasic DA 방출의 사전 시냅스 조절에 초점을 맞추고 있다. 이러한 준비는 도파민 터미널에 사전 시 냅 스 수용 체 효과 공부에 대 한 가치, CIS-FSCV 는 도파민 뉴런에 somatodendritic 수용 체 효과 연구에 더 적합 하는 반면, VTA에 사전 신냅스 입력 뿐만 아니라. 이러한 구별은 VTA에서 소마토덴디틱 수용체 활성화가 NAc 사전 시냅틱 수용체 활성화와 다른 효과를 가질 수 있기 때문에 중요합니다. 실제로, NAc에서 도파민제 전시냅틱 nAChRs를 차단하는 것은 버스트발사시 페이시브 도파민 방출을 상승시킬 수 있으며, 그 반대는 VTA 소마토덴드릭 nAChRs10,11에서사실이다.
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출을 조절하는 VTA 수용체의 능력을 연구하기위한 이상적인 방법입니다. 중요한 것은, 이 접근은 마취또는 자유로운 이동중 하나인 그대로 쥐에서 수행될 수 있습니다. 이러한 접근법은 급성 연구에 적합하여, 그기준상태(10,14)에서 수용체 기능을 연구할 뿐만 아니라 약물 노출 또는 행동 조작 후 수용체의 기능적 변화를 평가할 수 있는 장기연구(11,15)에적합하다.

<table><tbody><tr><td>전극 충전 솔루션/용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF286-5 (28 게이지)</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Sigma</td><td>236497-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>전극 공급</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄소 섬유</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td>참고: 수평 풀러도 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>유리 모세관</td><td>A-M 시스템</td><td>626000</td><td></td></tr><tr><td>전극용 절연 전선</td><td>Weico Wire and Cable Incorporated</td><td>UL 1423</td><td>길이; 10 cm; 지름, 0.4mm; 맞춤 제작해야 합니다; 절연 재료는 덮어야 합니다. 와이어</td></tr><tr><td>광 현미경 5cm(전극 보기 및 절단용)</td><td>Fischer Scientific</td><td>M3700</td><td></td></tr><tr><td>Pin</td><td>Phoenix Enterprises</td><td>HWS1646</td><td>절연 전극 와이어 및 기준 전극에 납땜; 헤드스테이지</td></tr><tr><td>Putty</td><td>Alcolin</td><td><a target="_blank" href="https://www.dickblick.com/items/23922-1003/">23922-1003</a에 연결합니다></td><td>탄소 섬유를 절단하는 동안 전극을 배치하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Scalpal Blade</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>탄소 섬유를 적절한 길이로 절단하기 위해</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Sigma</td><td>327026-4G</td><td></td></tr><tr><td>FSCV Hardware/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>U-Line</td><td>H-3618 (36" x 24" x 42")</td><td></td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulating electrode</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>주문 시 받침대 아래 22mm 절단 TarHeel</td></tr><tr><td>HDCV Software</td><td>University of North Carolina-Chapel Hill</td><td>-</td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank"> 주문 정보 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a></td></tr><tr><td>UEI 브레이크아웃 박스</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> 주문 정보</td></tr><tr><td>UEI 전원 공급 장치</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> 주문 정보</td></tr><tr><td>Stimulator Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolog 자극 아이솔레이터</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS4</td><td>Neurolog 800A</td></tr><tr><td>주입/자극 용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>New Era 주사기 펌프</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>내부 캐뉼러</td><td>플라스틱One</td><td>C315I/SPC INTERNAL 33GA</td><td></td></tr><tr><td>마이크로리터 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td>플라스틱One</td><td>C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canulla Holder</td><td>Kopf Instruments</td><td>1776 P-1</td><td></td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>Vitality Medical</td><td>806</td><td></td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Kopf Instruments</td><td>1770</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0501</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오드</td><td>Vitality Medical</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>나사</td><td>Stoelting</td><td>Bone Anchor Screws/Pkg.of 100</td><td>1.59 mm O.D., 3.2 mm 길이</td></tr><tr><td>Silver Wire Reference with AgCl</td><td>InVivo Metric</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>Square Gauze</td><td>Vitality Medical</td><td>441408</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 902 (Dual Arm Bar)</td><td></td></tr><tr><td>Histological Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formulin</td><td>Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 미세 전극</td><td>MicroProbes</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td>Drugs for infusions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>((2R)-아미노-5-포스포노발레르산</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸-D-아스파르테이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>메카밀아민 염산염(M9020-5mg)</td><td>시그마 알드리치</td><td>M9020</td><td></td></tr><tr><td>스코폴라민 하이드로 브로마이드(S0929-1G)</td><td>시그마 알드리치</td><td>S0929</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른 스캔 순환 볼탐법 (cis-fscv)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

판면 도파민 (DA) 복부 테지멘트 영역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens 보상 처리 및 강화 학습에 중추적 인 역할을한다. VTA 제어 면질 DA 방출에 다양한 뉴런 입력이 보상 처리 및 보강 학습을 제어하는 회로의 더 나은 그림을 제공 할 수있는 방법을 이해. 여기서는 생체내 고속 스캔 순환 볼탐법(FSCV)에서 측정한 약리학 작용제 및 길항제의 인트라-VTA 캐뉼라 주입을 자극-황량한 Phasic DA 방출(결합된 주입 및 자극 또는 CIS)과 결합하는 방법을 설명합니다. 마취된 쥐에서 CIS-FSCV를 사용하여, 핵 accumbens 코어에서 기록하는 동안 캐뉼라가 장착된 양극성 전극으로 VTA를 전기적으로 자극함으로써 면학적 DA 반응을 불러질 수 있다. 약리학 작용제 또는 길항제는 특정 VTA 수용체의 역할을 조사하기 위해 자극 부위에 직접 주입될 수 있다. CIS-FSCV의 주요 장점은 VTA 수용체 기능이 생체 내에서 연구될 수 있다는 것입니다.

CIS-FSCV는 NAc 코어에서 phasic DA 방출을 구동하는 VTA N-메틸-D-아스파르타테 수용체(NMDAR), 니코티닉 아세틸콜린 수용체(nAChRs), 무스카리닉 아세틸콜린 수용체(mAChRs)의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 도 2는 음의 제어, 0.9% 식염수의 주입, 이전(기준선) 및 9분 후유혈(식염수)에 대한 대표적인 데이터를 나타낸다. 도 2는 y축, x축의 시간, z축의 시간 및 전류(거짓 색으로 표현됨)를 나타내는 색상 플롯을 나타내며, 현재 대 시간 추적(IvT)에, 그리고 피크에서 촬영한 순환 형 voltammogram은 DA에 해당한다는 것을 입증한다. 예상대로, 식염수 주입자극된 Phasic DA 방출을 변경하지 않았다.
...

이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.

빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...

이 접근법은 측좌핵에서 특정 복부 피개 영역, 체성 수지상 수용체 및 위상 도파민 방출의 역할을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 위상 도파민 방출에 대한 수용체 기능 제어에 대한 질문을 온전한 뇌에서 해결할 수 있다는 것입니다. 탄소 섬유 미세 전극 및 양극성 자극기 위치를 최적화하는 것은 어려울 수 있으며, 초보자를 위한 몇 가지 조언은 등쪽 선조체에서 기록을 시작하는 것입니다.기록, 참조 및 자극 전극을 포함한 여러 유형의 전극의 사용 및 조작으로 인해 이러한 전극이 이식되는 시기와 위치에 대한 시각적 가이드가 유용할 것입니다. 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후, 마취된 쥐의 두피를 3회 연속 요오드포비돈과 70% 에탄올 스크럽으로 세척합니다. 마지막 스크럽 후에는 멸균된 바늘 코 핀셋과 수술용 가위를 사용하여 이식된 전극을 위한 공간을 만들기 위해 두피 조직을 충분히 잘라냅니다.멸균된 면 팁 어플리케이터로 노출된 두개골 표면을 부드럽게 청소한 후 3% 과산화수소를 2-3방울 떨어뜨려 람다와 브레그마를 식별하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 분당 약 20, 000 회전으로 설정된 1 밀리미터 드릴 비트를 사용하여 1.5 밀리미터 직경의 구멍, 2.5 밀리미터 전방 및 3.5 밀리미터 브레그마 옆 구멍을 만듭니다. 나사가 제자리에 단단히 고정될 때까지 외경 1.59mm, 길이 3.2mm 크기의 나사를 구멍의 절반 정도에 삽입합니다.다음으로, 브레그마 옆으로 1.5mm, 3.5mm 떨어진 좌반구에 직경 1mm의 기준 전극 구멍을 뚫습니다. 약 2mm의 기준 와이어를 구멍에 삽입하면서 이식된 나사의 머리 주위와 아래에 와이어를 감습니다. 그런 다음 나사를 완전히 삽입하고 기준 전극을 제자리에 고정합니다.우반구에서 브레그마 직경 1.5mm, 전방 1.2mm, 측면 1.4mm의 구멍을 뚫고 핀셋을 사용하여 경막을 조심스럽게 제거합니다. 자극 전극의 경우 브레그마에서 5.2mm, 측면 1mm를 중심으로 전후 2mm, 내측 5mm의 정사각형 구멍을 뚫습니다. 정위 암 바를 사용하여 양극성 자극 전극 가이드 캐뉼라를 경막 아래로 5mm 낮춥니다.정위 암 바를 사용하여 선조체의 가장 등쪽 부분에서 경막 아래 4mm 높이의 탄소 섬유 미세 전극을 낮추고 기준 와이어와 탄소 섬유를 전위차 조절기에 연결합니다. 그런 다음 마이너스 0.4-1.4볼트, 초당 400볼트의 삼각형 파형을 60Hz에서 15분 동안 적용한 다음 10Hz에서 10분 자극을 적용합니다. 자극 전극 위치를 최적화하려면 60헤르츠 주파수, 24개 펄스, 300마이크로암페어 전류 및 위상 펄스 폭당 2밀리초의 바이폴라 전기 파형을 생성하도록 자극기를 설정합니다.경막 아래 5mm에서 7.8mm까지 0.2mm씩 자극기를 부드럽게 낮추고 각 증가에서 VTA를 자극합니다. 자극이 등쪽 선조체 내의 탄소 섬유 미세 전극에서 위상 도파민 방출을 생성할 때까지 양극성 자극 전극 가이드 캐뉼라를 계속 내립니다. 도파민 방출이 관찰되면 경막보다 최소 6mm 아래에 있을 때까지 탄소 섬유 미세 전극을 측좌핵의 가장 등쪽 부분으로 낮춥니다.전극이 제 위치에 있을 때, VTA를 자극하고 도파민 첨단의 최고 진폭을 기록하고, 그 후에 도파민 반응의 첨단이 0.6 볼트에 명확한 산화 첨단 및 마이너스 0.2 볼트에 환원 첨단으로 표현된다는 것을 확인하, 가장 큰 도파민 방출을 일으키는 위치에 탄소 섬유 microelectrode를 낮추거나 올리십시오. 탄소 섬유와 자극 전극 가이드 캐뉼러 위치가 최적화되면 20-30분 동안 3분마다 동물을 자극합니다. 안정적인 기준선을 달성한 후, 바이폴라 자극기에 미리 장착된 가이드 캐뉼라에 손으로 내부 캐뉼라를 부드럽게 내리고 추가로 2-3개의 기준선 기록을 얻어 캐뉼라 삽입이 유발된 신호의 변화를 일으키지 않았는지 확인합니다.기준선 반응이 확립되면 주사기 펌프와 마이크로 주사기를 사용하여 2분 동안 0.5마이크로리터의 관심 약물 용액을 VTA에 주입합니다. 주입 후 제거하기 전에 최소 1분 동안 내부 캐뉼라를 제자리에 두고 주입 후 효과를 측정하기 위해 3분마다 반응을 계속 기록합니다. 이러한 대표적인 색상 플롯에서 입증된 바와 같이, 식염수 주입은 자극된 위상 도파민 방출을 변경하지 않습니다.NMDA의 주입은 자극된 위상 도파민 방출을 강력하게 증가시키는 반면, NMDA 수용체 경쟁 길항제인 AP5는 강력한 감소를 생성합니다. 비경쟁적 니코틴성 아세틸콜린 수용체 길항제 메카밀아민과 비선택적 경쟁성 무스카린성 아세틸콜린 수용체 길항제 스코폴라민은 모두 자극된 위상 도파민 방출을 크게 감소시킵니다. 이 그래프에서는 시간 경과에 따른 테스트된 약물의 효과에 대한 요약을 관찰할 수 있습니다.주입 캐뉼러는 양극성 자극 전극에 조심스럽게 삽입해야 합니다. 그렇지 않으면 과도한 손상이 발생하여 위상 도파민 방출의 인공적 변화로 이어질 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 위상 도파민 방출이 생체 내에서 조절되는 특정 수용체 메커니즘을 보다 미세하게 다룰 수 있었습니다.

combined-infusion-stimulation-with-fast-scan-cyclic-voltammetry-cis

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

새로운 형광 도파민의 analogs를 사용하여 광학 neurotransmission을 측정하는 것을 의미합니다.

개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각

striatal 뇌 조각의 전기적 evoked presynaptic 도파민의 역학을 측정하는 빠른 스캔 순환 voltammetry를 사용하여.

빠른 스캔 순환 Voltammetry와 Striatal 뇌 조각의 Presynaptic 도파민 역학

이 비디오는 마취된 쥐에 전극과 캐뉼라를 이식하여 전위차점 측좌핵의 도파민 방출을 측정하고 복부 피개 영역의 도파민 활성을 조절하기 위한 약물 주입을 보여줍니다.

VTA 도파민 뉴런 수용체 조작을 사용한 쥐 모델에서 도파민 방출 모니터링

세포외 도파민(DA)의 급격한 변동은 포유류의 보상 처리와 동기 부여 행동을 모두 중재합니다. 이 원고는 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐에서 타스탄트가 빠른 도파민 방출을 어떻게 변경하는지 결정하기 위해 FSCV(Fast Scan Cyclic Volammetry)와 구강 내 타스탄트 투여의 조합을 설명합니다.

깨어 쥐의 구강 내 Tastant 관리하는 동안 빠른 스캔 순환 전압 전류 법으로 빠른 도파민 역학 시험

빠른 스캔 순환 voltammetry 약물, 질병 및 기타 실험 조작의 맥락 에서 생체 내 도파민 신경 전달을 모니터링 할 수 있습니다. 이 연구는 도파민 방출 및 재 흡수 역학의 평가를 정량화하기위한 양적 신경 생물학 모델에 따라 전기 자극 된 도파민 반응을 모델링하는 소프트웨어 인 QNsim1.0의 구현을 설명합니다.

QNsim1.0을 이용한 전기 자극 도파민 신경 전달 데이터의 고속 스캔 순환 전압 측정 데이터 모델링

이 문서에서는, 우리는 기본 네트워크에 뇌 자극의 효과를 조사하기 위해 TMS와 fMRI의 조합과 관련된 방법론과 고려 사항을 검토하십시오.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

이 문서에서는, 우리는 연약한 X 증후군과 자폐증 스펙트럼에서 개인의 고통 개인의 대뇌 피질의 소성에 세타 - 버스트 TMS의 자극의 효과를 검사합니다.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

신경 기록 전극의 전극 - 조직 인터페이스는 전기 임피던스 분광법 (EIS)과 순환의 voltammetry (CV)로 특성화 할 수 있습니다. 전압 변화에게 전극 - 조직 인터페이스의 전기 특성을 바이어스 및 향상시킬 수있는 녹음 기능의 응용. 전압 바이어스, EIS, CV, 그리고 신경 녹음 보완 있습니다.

신경 인터페이스 전압 바이어스, 순환 Voltammetry, &amp; 전기 임피던스 분광학

amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의​​ 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

배우세요 쥐 뇌에서 탄소섬유 미세전극을 이용한 전기생리학 기록으로 복부 테그멘탈 영역 수용체 조작이 어떻게 단위시간 도파민 방출을 조절하는지 확인하는 방법을. 이 기법은 중독 연구에 중요한 신경생물학적 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

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