글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

이 프로토콜은 개별 나노튜브가 모 소포와 유사한 위상 분리 거동을 표시하는 대규모 지질 나노튜브 네트워크의 간단한 생성을 허용한다. 이 접근법의 주요 장점은 인간의 개입없이 지질 나노 튜브를 매우 평행 한 방식으로 자체 조립하기 위해 분자 모터가 수행 한 작업을 공동 선택한다는 것입니다. 글라이딩 운동성 분석을 설정하려면 먼저 다섯 밀리미터 떨어진 유리 슬라이드에 양면 테이프 스트립 세 세트를 부착하십시오.

커버 슬립을 테이프 위로 부드럽게 누르고 30 마이크로리터의 일마이크로몰 키네신 용액을 준비된 플로우 셀에 첨가한다. 5분 후, 30마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 마이크로소관 용액을 세포에 넣고 실험실을 눌러 유동 채널의 반대쪽 끝을 부드럽게 닦아내어 용액 교환을 용이하게 합니다. 또 다른 5분 인큐베이션 후, 30 마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 스트렙타비딘 용액을 유동 세포에 첨가하기 전에 세척당 50 마이크로리터의 실온 운동성 용액으로 세포를 1 내지 3회 세척한다.

10분 후, 30 마이크로리터의 10X GUV 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 100 밀리몰 AMP-PNP 용액 두 마이크로 리터를 추가하고 실란트로 챔버를 닫으십시오. 이미징을 위해 유동 챔버를 거꾸로 된 현미경으로 옮기고 적절한 필터 세트를 선택하십시오.

100X 오일 목표를 사용하여 관심 네트워크의 이미지를 얻기 전에 커버 슬립의 표면을 먼저 집중시킵니다. 그런 다음 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 색상 및 컴포지트를 클릭하여 빨강 및 녹색 채널을 오버레이하여 합성 이미지를 만듭니다. 이미징 후 관심 있는 이미지를 열고 분석 및 배율 설정을 클릭하여 현미경의 눈금을 보정합니다.

픽셀을 마이크로미터 변환 계수로 채우고 확인을 클릭합니다. 다중 포인트 라인 도구를 사용하여 부모 GUV에서 시작하는 나노 튜브를 추적하고 Control 및 M을 길게 눌러 길이를 측정하십시오. 이미지 처리 도구는 각각의 새로운 측정을 결과 창에 저장합니다. 모든 튜브가 측정되면 이미지, 조정 및 임계값을 선택하고 적용을 클릭하여 임계값을 적용합니다.

그런 다음 원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다. 영역의 집적 밀도를 측정하려면 분석 및 측정을 클릭하여 액체 나노튜브 노드의 지질 분할을 결정하고 선 도구를 사용하여 관심 노드 위에 선을 그리고 녹색과 빨간색 채널 모두에서 노드 강도를 측정합니다. 이 대표적인 분석에서, 액체 나노튜브 네트워크는 액체 무질서 및 순서화된 상뿐만 아니라 상-분리된 소포를 생성하는 것으로 입증된 바와 같이 제작되었다.

예를 들어, 45 %의 포화 지질 및 55 % 불포화 지질로 합성 된 소포는 공존하는 액체 무질서 및 고체상으로 분리되는 소포를 초래합니다. 그러나 콜레스테롤이 포함되면 액체 - 액체 공존이 관찰 될 수 있으며, 공존하는 액체 순서 및 액체 무질서 단계로 분리되는 GUV를 생성합니다. 더욱이, 노드는 상-분리된 혼합물 내에서 관찰될 수 있다.

기억해야 할 가장 중요한 것은 형광단을 광표백하지 않고 지질 나노튜브를 시각화할 수 있도록 적절한 노출 시간 및 ND 필터 세트를 선택하는 것이다. 지질 나노 튜브의 위상 거동 구성을 조정하면 최소한의 모델 시스템을 사용하여 세포를 연결하는 터널링 나노 튜브의 생물 물리학 연구를 시작할 수 있습니다.