Name: 글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 배우세요 글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작 방법을. 분자 모터를 활용한 자기조립으로 대규모 네트워크를 효율적으로 생성하고 상분리 거동을 연구합니다.

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이 작업은 미국 에너지부, 기본 에너지 과학 사무소, 재료 과학 및 엔지니어링 부서 (BES-MSE)의 지원을 받았습니다. Kinesin 합성 및 형광 현미경 검사는 미국 에너지부 (DOE) 과학 사무소에서 운영되는 과학 사용자 시설 인 통합 나노 기술 센터 (Center for Integrated Nanotechnologies)의 사용자 프로젝트 (ZIM)를 통해 수행되었습니다.

1. 재고 미세소관 용액의 제조
주의: 안전 고글, 장갑 및 실험실 코트는 항상 프로토콜 전체에서 착용해야 합니다.
<ol><li>5x BRB80 버퍼를 준비하십시오: 24.19 g의 파이프(피페라진-N,N'-비스[2-에탄설폰산])와 0.38g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스[β-아미노에틸 에테르]-N,N,N',N'-테트라아세트산)를 1L 유리 병에 넣으십시오. 1 mL의 1 MMgCl2 를 첨가하고, KOH로 pH를 6.9로 조정하였다. 탈이온수를 첨가하여 용액을 500 mL의 최종 부피로 가져온다.</li>
	<li>GTP 용액의 100 mM 스톡을 준비하십시오 : GTP 52mg을 칭량하고 증류수 1 mL에 현탁하십시오. 100 mM 용액을 20 μL 분취량으로 나누고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>GPEM 용액을 준비하십시오: 200 μL의 5x BRB80, 100 mM GTP 용액 10 μL, 100 μL의 100% 글리세롤 및 600 μL의 탈이온수를 혼합한다. GPEM 용액을 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에 보관한다.</li>
	<li>차가운 (4 °C) GPEM 용액에서 상업적으로 입수가능하고 동결 건조 된 튜불린 (비오티닐화, 형광 표지 및 비표지 된 바이알)의 바이알을 5 mg / mL의 스톡 농도로 재구성하여 미세 소관 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>4 μL의 비오티닐화 튜불린, 4 μL의 형광 표지된 튜불린 및 24 μL의 표지되지 않은 튜불린 (모두 5 mg/mL 농도에서)을 혼합하여 미세소관 중합을 수행하여 32 mL의 최종 부피에서 1:1:6의 비율을 생성한다. 얼음 위에 보관하십시오. 튜불린 혼합물을 2 μL 분취량으로 분할하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다. 참고: 효율적인 중합을 위해서는 튜불린의 농도가 임계 농도(5mg/mL)14 이상이어야 합니다. 여기서, 튜불린 비율의 선택은 스트렙타비딘 및 GUVs에 효율적으로 결합하기에 충분한 농도의 비오티닐화 튜불린뿐만 아니라 현미경적 특성화를 위한 형광 튜불린의 충분한 농도에 대해 최적화된다.</li>
</ol>2. 거대 유니라멜라 소포(GUV)의 제조
<ol><li>아가로스 필름 준비 참고: 이 프로토콜은 Greene et al.15에서 채택되었습니다.<ol>
<li>250 mL 삼각플라스크의 탈이온수 100 mL에 아가로스 1 g을 혼합하여 1% w/v 용액을 준비한다. 표준 전자 레인지를 사용하여 아가로스 용액을 1-2 분 동안 가열하십시오. 참고 : 아가로스가 완전히 용해되면 용액은 반투명 해집니다. 사용하기 전에 용액을 65-75 °C로 식히십시오.</li>
		<li>절단된 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 300-400μL의 아가로스 용액을 25mm x 25mm 유리 커버슬립에 피펫으로 만듭니다. 장갑을 낀 손가락으로 커버슬립의 가장자리를 잡고 있는 동안 또 다른 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 녹은 아가로스를 커버슬립 전체에 고르게 퍼뜨립니다. 참고: 아가로스를 65-75°C로 유지하면 커버슬립 표면에 효율적으로 퍼질 수 있습니다.</li>
		<li>아가로스 코팅된 커버슬립을 37°C 인큐베이터에서 적어도 2시간 동안 건조시키고, 이때 아가로스는 투명해질 것이다. 아가로스 코팅 표면을 위쪽을 향하도록 하여 커버슬립을 보풀이 없는 종이 또는 왁스계 필름과 같은 깨끗한 표면에 실온에서 보관하십시오(RT).</li>
	</ol></li>
	<li>지질 제형<ol>
<li>클로로포름에 용해된 지질을 -20°C 냉동고에서 회수하여 RT에 도달할 때까지 화학 흄 후드에 넣는다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 제제에 필요한 각 성분 지질의 지질 스톡의 부피를 계산하십시오. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq1.jpg"> 여기서: V 지질은 사용할 지질의 부피, 몰 %는 지질 성분의 몰 백분율, n은 제형에 사용된 지질의 총 몰 수, M은 몰 단위의 지질의 농도이다. 참고: 예를 들어, 45 몰% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 12.72 mM의 원액 농도 및 제형 내의 총 지질의 1 마이크로몰을 함유하는 제형을 사용하는 경우, 제형에 사용된 DOPC 스톡의 부피는 다음과 같다: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq2.jpg">
</li>
		<li>화학 흄 후드의 유리 바이알에 계산 된 비율로 지질을 함께 혼합하십시오.</li>
		<li>30 μL의 지질 용액을 제형의 포화 지질 성분의 융점 이상으로 설정되는 예열된 핫플레이트 상의 아가로스 코팅된 커버슬립 상으로 피펫한다(예를 들어, 40°C의 Tm을 갖는 지질을 위한 50°C 핫플레이트).</li>
		<li>클로로포름이 증발하고 지질의 균일한 층이 형성될 때까지 18 G 바늘의 긴 가장자리를 사용하여 원형 운동으로 아가로스 필름을 가로질러 용액을 퍼뜨린다. 이 단계를 수행하는 동안 장갑을 낀 손가락으로 커버 슬립의 가장자리를 잡으십시오. 참고 : 바늘로 아가로스 층을 손상시키지 않도록주의해야합니다.</li>
		<li>아가로스 층과 지질 필름이 있는 커버슬립을 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에 넣고, 필름 면이 위쪽을 향하도록 하고, 페트리 접시를 진공 데시케이터에 2시간 이상 두어 잔류 용매를 제거한다.</li>
	</ol></li>
	<li>그 동안 수크로오스 1.92g을 탈이온수 10mL와 혼합하여 560mM 수크로오스 용액을 제조하였다. 참고: 수크로오스 용액의 농도는 GUVs가 희석되는 완충액의 삼투압에 의존한다. 전형적으로, 수크로오스 용액의 삼투압은 GUVs가 희석될 완충액, 구체적으로는 운동성 완충액보다 10% 이상 크지 않아야 한다(단계 3.11 참조).</li>
	<li>GUV 형성<ol>
<li>지질 필름이 위쪽을 향하도록 지질 코팅된 커버슬립 상에 접착 챔버를 부드럽게 가압하여 지질 필름으로 코팅된 커버슬립에 접착 챔버를 부착하여, 타이트한 밀봉이 형성되도록 한다.</li>
		<li>400 μL의 560 mM 수크로오스 용액 (단계 2.3에서 제조됨)을 챔버에 첨가한다.</li>
		<li>커버 슬립을 습도 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다.</li>
		<li>조습 챔버를 제형의 포화 지질 성분의 융점 위에 놓인 예열된 핫플레이트 상에 놓는다.</li>
		<li>회복하기 전에 소포가 ≥1 시간 동안 형성되도록하십시오. 참고: 베시클 형성은 40x 공기 대물 렌즈로 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 운동성 분석 스톡 및 시약의 제조
<ol><li>카제인 재고의 제조<ol>
<li>건조 카제인 3g을 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 넣은 다음 30mL의 1x BRB80을 넣고 용액이 점성이 될 때까지 회전시킨다. 튜브를 15,000 x g 에서 30분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 다른 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 펠렛을 버린다. 용액을 1 μm 시린지 필터를 통해 여과하고, 용액을 50 mL 원뿔형 바이알에 수집한다. 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 용액을 50 mL 원뿔형 바이알에 수집한다.</li>
		<li>UV-Vis 분광광도계 및 석영 큐벳을 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정한다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 mg/mL의 카제인 농도를 계산합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq3.jpg">
</li>
		<li>용액을 1x BRB80에서 20 mg/mL로 희석하고, 100 μL 분취량으로 분할하고, -20°C에서 저장한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>글루코스 옥시다아제 2mg과 1x BRB80 1mL를 혼합하여 글루코스 산화효소(2mg/mL) 원액을 준비합니다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>카탈라아제 0.8mg과 1x BRB80 1mL를 혼합하여 카탈라아제(0.8mg/mL) 원액을 준비합니다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>0.3 g의 D-글루코오스를 탈이온수 1 mL에 현탁시켜 2 M 글루코오스 용액을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>0.015 g의 DTT를 1 mL의 탈이온수에 현탁시켜 100 mM DTT 스톡을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>0.055 g의 디소듐 ATP를 100 mMMgCl2의 용액 1 mL에 현탁시켜 100 mM Mg-ATP 스톡을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>0.055 g의 AMP-PNP를 100 mMMgCl2의 용액 1 mL에 현탁시켜 100 mM Mg-AMP-PNP 용액을 준비한 다음, 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>메탄올 1 mL에 25.03 mg의 트롤록스를 첨가하여 100 mM 트롤록스 용액을 제조하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>BRB80 100μL에 스트렙타비딘 1mg을 첨가하여 10mg/mL 스트렙타비딘 용액을 준비한 다음, 2μL 분취량으로 나누어 -80ۛ°C에서 보관한다.</li>
	<li>200 μL의 5x BRB80, 20 μL의 카제인 용액, 10 μL의 MgATP 용액, 10 μL의 트롤록스, 5 μL의 파클리탁셀 용액 및 765 μL의 DI 물을 혼합하여 BRB90CAT를 제조하였다. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>192 μL의 BRB80CAT, 2 μL의 D-글루코스 용액, 2 μL의 글루코스 옥시다제 용액, 2 μL의 DTT 용액 및 2 μL의 카탈라아제 용액을 혼합하여 운동성 용액을 제조하였다. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>BRB80CAT의 스톡 키네신 용액 (예를 들어, BRB80CAT의 98 μL 중의 50 mM 키네신 용액 2 μL)을 희석하여 1 μM 키네신 용액을 제조하고, 4°C에서 저장한다.</li>
	<li>10 μL의 안정화된 미세소관을 90 μL의 실온 BRB80CAT에 희석하여 10 μg/mL 미세소관 용액을 제조하였다. RT에 저장합니다.</li>
	<li>99.9 μL의 운동성 용액에 10 mg/mL 스트렙타비딘 용액 0.1 μL를 첨가하여 10 μg/mL 스트렙타비딘 용액을 준비한다. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>5 μL의 GUV 스톡을 55 μL의 운동성 용액으로 희석하여 12x GUV 용액을 제조하였다. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>미세 소관으로의 튜불린 중합<ol>
<li>미리 제조된 튜불린의 2 μL 분취량을 -80°C 냉동고(단계 1.5에서 제조)로부터 수집하고, 37°C 수조에 넣고 30분 동안 배치한다.</li>
		<li>무수 DMSO 1 mL에 1.71 mg의 파클리탁셀을 첨가하고, 10 μL 분취량으로 분할하고, -20°C에서 저장함으로써 2 mM 파클리탁셀 용액을 제조하였다.</li>
		<li>99.5 μL의 1x BRB80을 0.5 μL의 2 mM 파클리탁셀과 혼합하여 BRB80T를 신선하게 제조하였다.  100 μL의 BRB80T를 수조에서 37°C로 가온한다.</li>
		<li>30분 후, 100 μL의 BRB80T를 튜불린 분취량에 첨가하여 미세소관을 안정화시킨다. RT에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 글라이딩 운동성 분석 (GMA)
<ol><li>유리 슬라이드에 5mm로 분리된 양면 테이프 두 스트립을 부착하여 유동실을 준비합니다. 세 개의 테이프 레이어가 각 스트립을 구성할 때까지 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>커버슬립을 테이프 위에 놓은 다음 핀셋이나 펜으로 커버슬립/테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 충분한 접착력을 확보하십시오. 참고: 채널은 너비 5mm, 길이 25mm, 높이 300mm여야 합니다.</li>
	<li>1 mm 키네신 용액 (단계 3.12에서 제조됨) 30 μL를 피펫 유동 세포에 넣고 5분 동안 인큐베이션시킨다. 참고: 카제인은 커버슬립/유리 슬라이드의 표면에 이중층을 형성하고 키네신 꼬리를 표면에 쉽게 부착할 수 있습니다.</li>
	<li>10 μg/mL 미세소관 용액 (단계 3.13에서 준비됨) 중 30 μL를 유동 셀로 피펫하고, 실험실 와이프를 사용하여 유동 채널의 반대쪽 끝에 부드럽게 눌러서 용액 교환을 용이하게 한다. 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>유동 셀을 RT에서 1x 운동성 용액으로 1x-3x로 세척하십시오 (3.11 단계에서 준비). 참고: 이 시점에서 40x 공기 목표를 사용하는 형광 현미경을 사용하여 미세 소관 부착 및 운동성을 확인할 수 있습니다. 미세소관은 ~0.5μm/s에서 표면을 가로질러 이동(활공)하는 형광 필라멘트(길이 수십 미크론)로 나타납니다(그림 1).</li>
	<li>10 μg/mL 스트렙타비딘 용액 (단계 3.14에서 준비된) 30 μL를 실험실 세척을 사용하여 유동 셀에 넣고 용액 교환을 용이하게하기 위해 유동 채널의 반대쪽 끝에 부드럽게 압착하십시오. 10분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>30 μL의 12x GUV 용액(단계 3.15에서 제조됨)을 실험실 와이프를 사용하여 유동 채널 반대쪽 단부에 대해 부드럽게 압착하여 용액 교환을 용이하게 한다. 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>2 μL의 100 mM AMP-PNP 용액 (단계 3.7에서 제조됨)을 첨가하여 운동성을 정지시킨 다음, 챔버를 실란트로 밀봉하였다.</li>
</ol>5. LNT 네트워크 특성화
<ol><li>이미징을 위해 유동 챔버를 반전 현미경으로 옮깁니다.</li>
	<li>사용된 형광 지질 또는 튜불린의 파장에 따라 적절한 필터 세트를 선택하십시오. 예를 들어, 텍사스 레드 라벨이 붙은 지질을 사용하는 경우 560nm/25nm 여기 필터와 607nm/36nm 방출 필터를 사용합니다.</li>
	<li>100x 오일 대물렌즈를 사용하여 커버슬립 표면에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 LNT 네트워크를 이미지화합니다. 참고: LNT는 더 큰 소포에서 압출되는 선형 구조입니다. LNT는 GUV보다 훨씬 작고 형광 신호가 약합니다. 따라서 노출 및 대비는 이미지 LNT에 따라 조정되어야 합니다. 이러한 조정은 또한 GUV의 과다 노출로 이어지므로 GUV의 라멜라리티 및 상 분리를 독립적으로 특성화하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>현미경을 관심 네트워크에 초점을 맞추고 표준 또는 타일 이미지를 찍습니다.</li>
	<li>노출 시간과 중립 밀도 필터를 조정하여 LNT를 이미지화하고 GUV의 포화 노출을 최소화합니다. 빨간색과 녹색 채널에서 이미지를 모두 가져옵니다. 참고: 여기서 적색 채널은 텍사스-적색 지질의 시각화를 허용하는 반면, 녹색 채널은 미세소관(예: 오레곤 그린 지질 및 HiLyte488 염료)의 시각화를 허용합니다.</li>
	<li>빨강 및 녹색 채널을 오버레이하여 합성 이미지를 만듭니다(그림 1).</li>
	<li>LNT 길이 측정을 통한 LNT 네트워크의 특성화<ol>
<li>ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 엽니다.</li>
		<li>설정된 배율 피쳐를 사용하여 현미경의 배율을 보정하고 픽셀을 mm 변환 계수로 채운 다음 확인을 클릭합니다. 참고: 변환 계수는 현미경, 대물 렌즈 및 카메라에 따라 다르며 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 얻을 수 있습니다. 일반적으로 픽셀 / mm로 표현됩니다.</li>
		<li>멀티포인트 라인 도구를 사용하여 모 GUV에서 시작하는 나노튜브의 길이를 측정합니다. Ctrl+M을 눌러 길이를 측정합니다.</li>
		<li>위의 단계에 따라 개별 튜브의 길이를 계속 측정하십시오. 이미지 처리 도구는 각각의 새로운 측정을 결과 창에 저장합니다.</li>
		<li>각 선을 그린 후 Ctrl + D를 눌러 측정 된 튜브를 추적하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LNT 두께 측정(그림 2)<ol>
<li>ImageJ에서 이미지를 열고 이미지 탭에서 임계값 피쳐를 선택합니다.</li>
		<li>적용을 클릭하여 임계값을 적용합니다.</li>
		<li>원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다(검은색 픽셀의 값은 0이고 빨간색 픽셀의 값은 255임).</li>
		<li>영역의 통합 밀도를 측정합니다.</li>
		<li>밀도를 LNT의 길이(픽셀 단위)로 나누어 두께(픽셀 단위)를 구합니다. 참고: 두께 측정은 이미징 설정과 임계값이 동일하게 설정된 경우에만 이미지 간에 비교할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LNT 노드에서 지질 분할 결정(그림 3)<ol>
<li>ImageJ에서 이미지를 엽니다.</li>
		<li>선 도구를 사용하여 원하는 노드 위에 선을 그립니다.</li>
		<li>오레곤 그린 및 텍사스 레드 채널 모두에서 노드 강도를 측정합니다.</li>
		<li>라인을 LNT로 이동하고 오레곤 그린 및 텍사스 레드 채널 모두에서 LNT 강도를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Sandia National Laboratories는 DE-NA-0003525 계약에 따라 미국 DOE의 국가 핵 안보국을 위해 Honeywell International, Inc.의 전액 출자 자회사 인 Sandia, LLC.의 National Technology & Engineering Solutions가 관리하고 운영하는 다중 임무 실험실입니다. 이 백서에서는 객관적인 기술적 결과 및 분석에 대해 설명합니다. 논문에서 표현 될 수있는 주관적인 견해 나 의견이 반드시 미국 에너지부 또는 미국 정부의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

LNT 네트워크는 막횡단 단백질과 같은 생체분자의 특성 및 수송에 대한 시험관내 연구에 유용한 도구이다. 또한, LNT 네트워크를 제조하기 위해 복잡한 지질 제제를 사용하는 것은 생물학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 한다. 다른 제조 연구는 1) 단순 지질 제제 및 다중 라멜라 소포 또는 2) 복잡한 지질 제형으로 구성된 GUV의 네트워크를 제조하기 위해보다 성가신 운동성 기술을 사용했습니다. 여기에 설명 된 방법은 복잡한 지질 제제 및 GUV에서 대규모 LNT 네트워크를 효율적으로 제작하고 저렴한 시약 및 장비를 사용하여 가능하게합니다. 따라서이 방법론은 상 분리 및 막 단백질 수송을 포함한 다양한 생물학적 과정을 연구 할 수있는 능력을 제공합니다. 상기 프로토콜은 LNT들의 조성이 그들의 생물학적 유사체들(예를 들어, 골지 장치)에 근사하도록 최적으로 조정될 수 있는 시험관내 모델을 사용한다.
여기에 설명된 방법에서 LNT 네트워크의 형성은 수많은 이점을 갖는다. 예...

지질 나노튜브(LNT) 네트워크의 제작은 비평형 지질 구조 1,2,3의 시험관내 검사에 대한 관심이 증가하고 있다. 세포는 단백질(4)과 핵산(5)의 확산 수송뿐만 아니라 세포-세포간 통신(6,7)을 위해 지질 세관을 사용한다. 소포체 및 골지 장치는 특히 흥미로운데, 이러한 막-결합된 소기관은 지질 및 단백질 합성을 위한 주요 위치일 뿐만 아니라 세포의 세포질 내에서 이들 필수적인 생체분자의 수송을 위한 주요 위치이기 때문이다8,9. 이들 소기관의 막은 궁극적으로 그들의 기능을 정의하는 데 도움이 되는 스핑고지질, 콜레스테롤 및 인지질(10)을 포함하는 다수의 지질 종으로 구성된다. 따라서, 이들 소기관을 보다 밀접하게 복제하고 연구하기 위해, 시험관내 LNT는 점점 더 복잡한 지질 제형(11)을 갖는 소포로부터 제조되어야 한다.
거대 유니라멜라 소포(GUVs)는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜이노시톨(PI)12,13을 포함하는 복잡한 제형으로 안정적으로 합성될 수 있기 때문에 지질막 거동을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 여기에 설명 된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을 사용하여 다양한 지질 제형을 가진 GUVs에서 LNT를 제조하는 방법이며, LNT는 GUV에 작용하는 키네신 모터 및 미세 소관 필라멘트에 의해 수행 된 작업을 기반으로 압출됩니다. 이 시스템에서, 표면에 흡착된 키네신 모터 단백질은 비오티닐화된 미세소관을 추진하여, ATP의 가수분해로부터 화학 에너지를 유용한 작업(특히, 비오티닐화 소포로부터 LNT의 압출)으로 변환한다11. 생성된 LNT 네트워크는 LNT 형태학의 변화에 대한 지질 위상의 차이의 영향을 연구하기 위한 모델 플랫폼을 제공한다.
간략하게, 키네신 모터 단백질은 카제인을 함유하는 용액의 유동 챔버 내로 도입되며, 이는 챔버의 유리 표면 상으로의 모터의 흡착을 가능하게 한다. 다음으로, ATP를 함유하는 용액 중의 비오티닐화된 미세소관은 챔버를 통해 유동하고 키네신 모터에 결합하고 운동성을 시작하도록 허용된다. 그런 다음 스트렙타비딘 용액을 챔버 내로 도입하고 미세 소관에 비공유적으로 결합하도록 허용한다. 마지막으로, 비오티닐화 지질을 함유하는 GUVs를 챔버 내로 도입하고 스트렙타비딘 코팅된 미세소관에 결합시킨 다음, LNT를 압출하여 15-30분 동안 대규모 네트워크를 형성한다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시약을 사용하여 대규모 분기 LNT 네트워크를 저렴한 비용으로 생산합니다11.

<table><tbody><tr><td>100x/1.4 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td>1-U2B836</td><td>올림푸스 UPlanSApo 100x/1.40 오일 대물렌즈 무한대 보정, RMS 스레드 작동 거리 0.12mm</td></tr><tr><td>3.0 ND 필터</td><td>올림푸스</td><td></td><td>중성 밀도 필터</td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2647</td><td>(&베타;,&감마;-이미도아데노신 5&프라임;-트리포스페이트)</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물 BioXtra</td></tr><tr><td>Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 필터 세트</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td><td> BrightLine Pinkel 필터 세트, DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 및 기타 LED 기반 광원으로 조명되는 형광단</td></tr> 카제<tr><td>인</td><td>시그마-알드리치</td><td>22090</td><td>미생물학용 카세인 가수분해물</td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>C9322</td><td>소의 카탈라제</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>288306</td><td>클로로포름 무수 안정제로 0.5-1.0% 에탄올 함유</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>아반티</td><td>700000P</td><td>콜레스테롤 (양모, >98 %) (분말)</td></tr> <tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>D-(+) - 포도당 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합, 곤충 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375C</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (클로로포름)</td></tr><tr><td>DOPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870282C</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td></tr><tr><td>DPPC</td><td>Avanti</td><td>850355P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (분말)</td></tr><tr><td>DPPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870285P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>DL-Dithiothreitol 용액 1 M</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td>Aspergillus niger 유형 II에서 포도당 산화효소, &ge; 10,000 units/g 고체(산소 첨가 제외)</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>G33</td><td>글리세롤(ACS 인증), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>구아노신 5&prime;-triphosphate sodium salt hydrate</td></tr><tr><td>IX-81 Olympus 현미경</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>IX81 Olympus</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1050121000</td><td>Potassium 수산화물</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1028</td><td>1.00 M 염화마그네슘 용액</td></tr><tr><td>오르카 플래시 4.0 디지털 카메라</td><td>하마마츠</td><td>C13440-20CU</td><td>ORCA-플래시 4.0 V3 디지털 CMOS 카메라</td></tr><tr><td>오레곤 그린-DHPE</td><td>인비트로젠</td><td>O12650</td><td>오레곤 그린 488 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민</td></tr><tr><td>파클리탁셀</td><td>써모피셔</td><td>P3456</td><td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - 연구 전용으로 사용</td></tr><tr><td></td><td>PIPES Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td></tr><tr><td>Texas Red-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>T1395MP</td><td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>시그마-알드리치</td><td>238813</td><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td></tr><tr><td>Tubulin, Biotin</td><td>Cytoskeleton</td><td>T333P</td><td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td></tr><tr><td>Tubulin, Hy-Lite 488</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL488M</td><td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td></tr><tr><td>Tubulin, Unlabeled</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>Tubulin protein porcine brain</td></tr></tbody></table>

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

지질 나노튜브(LNT) 네트워크는 진핵 세포에서 발견되는 유비쿼터스 지질 세관과 관련성이 있는 분자 수송 및 지질 생물물리학을 연구하기 위한 시험관내 모델 시스템을 나타낸다. 그러나 생체 내 LNT는 화학 에너지와 분자 모터를 조립, 유지 및 재구성해야하는 매우 비평형 구조입니다. 또한, 생체내 LNTs의 조성은 다수의 상이한 지질 종들로 구성된 복합체이다. LNT를 압출하는 일반적인 방법은 시간과 노동 집약적이며, 거대한 지질 소포에서 나노 튜브를 강제로 끌어 오기 위해 광학 핀셋, 마이크로 비드 및 마이크로 피펫이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을위한 프로토콜이며, 대규모 LNT 네트워크는 키네신 구동 미세 소관 운동성을 사용하여 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)에서 빠르게 생성됩니다. 이 방법을 사용하여, LNT 네트워크는 생물학적 LNT의 복잡성을 모방하는 광범위한 지질 제형으로 형성되어, 지질 생물물리학 및 막 관련 수송의 시험관내 연구에 점점 더 유용하게 된다. 또한이 방법은 일반적으로 사용되는 실험실 장비를 사용하여 단시간 (<30 분) 내에 LNT 네트워크를 안정적으로 생산할 수 있습니다. 길이, 폭 및 지질 분할과 같은 LNT 네트워크 특성도 네트워크 제조에 사용되는 GUV의 지질 구성을 변경하여 조정할 수 있습니다.

LNT 네트워크(그림 4)는 GUV로부터 LNT를 밀어내기 위해 미세소관의 키네신 수송에 의해 수행된 작업을 사용하는 설명된 프로토콜을 사용하여 제작되었다. 간략하게, GUVs는 수크로오스 용액을 사용하여 재수화된 아가로스 겔을 사용하여 제조되었고, 미세소관은 GPEM 용액에서 중합되고 BRB80T에서 안정화되었다. 다음으로, kinesin 모터를 유동 셀에 도입하여 커버슬립 표면에 모터의 활성 층을 형성했습니다. 그런 다음 미세소관을 도입하고 스트렙타비딘 용액을 첨가하여 비오티닐화 지질과 GUV (이후 도입됨) 간의 결합을 촉진시켰다.
유동 전지에 존재하는 모든 성분들과 함께, LNT들은 30분 동안 형성되도록 허용되었고, 이 시점에서 AMP-PNP는 운동성을 멈추기 위해 도입되었다. 이어서, LNTs를 100x 오일 목표를 사용하여 에피형광 현미경으로 이미지화하였다. LNT는 상당히 클 수 있습니다. 따라서, 더 낮은 동력...

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

이 프로토콜은 개별 나노튜브가 모 소포와 유사한 위상 분리 거동을 표시하는 대규모 지질 나노튜브 네트워크의 간단한 생성을 허용한다. 이 접근법의 주요 장점은 인간의 개입없이 지질 나노 튜브를 매우 평행 한 방식으로 자체 조립하기 위해 분자 모터가 수행 한 작업을 공동 선택한다는 것입니다. 글라이딩 운동성 분석을 설정하려면 먼저 다섯 밀리미터 떨어진 유리 슬라이드에 양면 테이프 스트립 세 세트를 부착하십시오.커버 슬립을 테이프 위로 부드럽게 누르고 30 마이크로리터의 일마이크로몰 키네신 용액을 준비된 플로우 셀에 첨가한다. 5분 후, 30마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 마이크로소관 용액을 세포에 넣고 실험실을 눌러 유동 채널의 반대쪽 끝을 부드럽게 닦아내어 용액 교환을 용이하게 합니다. 또 다른 5분 인큐베이션 후, 30 마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 스트렙타비딘 용액을 유동 세포에 첨가하기 전에 세척당 50 마이크로리터의 실온 운동성 용액으로 세포를 1 내지 3회 세척한다.10분 후, 30 마이크로리터의 10X GUV 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 100 밀리몰 AMP-PNP 용액 두 마이크로 리터를 추가하고 실란트로 챔버를 닫으십시오. 이미징을 위해 유동 챔버를 거꾸로 된 현미경으로 옮기고 적절한 필터 세트를 선택하십시오.100X 오일 목표를 사용하여 관심 네트워크의 이미지를 얻기 전에 커버 슬립의 표면을 먼저 집중시킵니다. 그런 다음 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 색상 및 컴포지트를 클릭하여 빨강 및 녹색 채널을 오버레이하여 합성 이미지를 만듭니다. 이미징 후 관심 있는 이미지를 열고 분석 및 배율 설정을 클릭하여 현미경의 눈금을 보정합니다.픽셀을 마이크로미터 변환 계수로 채우고 확인을 클릭합니다. 다중 포인트 라인 도구를 사용하여 부모 GUV에서 시작하는 나노 튜브를 추적하고 Control 및 M을 길게 눌러 길이를 측정하십시오. 이미지 처리 도구는 각각의 새로운 측정을 결과 창에 저장합니다. 모든 튜브가 측정되면 이미지, 조정 및 임계값을 선택하고 적용을 클릭하여 임계값을 적용합니다.그런 다음 원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다. 영역의 집적 밀도를 측정하려면 분석 및 측정을 클릭하여 액체 나노튜브 노드의 지질 분할을 결정하고 선 도구를 사용하여 관심 노드 위에 선을 그리고 녹색과 빨간색 채널 모두에서 노드 강도를 측정합니다. 이 대표적인 분석에서, 액체 나노튜브 네트워크는 액체 무질서 및 순서화된 상뿐만 아니라 상-분리된 소포를 생성하는 것으로 입증된 바와 같이 제작되었다.예를 들어, 45 %의 포화 지질 및 55 % 불포화 지질로 합성 된 소포는 공존하는 액체 무질서 및 고체상으로 분리되는 소포를 초래합니다. 그러나 콜레스테롤이 포함되면 액체 - 액체 공존이 관찰 될 수 있으며, 공존하는 액체 순서 및 액체 무질서 단계로 분리되는 GUV를 생성합니다. 더욱이, 노드는 상-분리된 혼합물 내에서 관찰될 수 있다.기억해야 할 가장 중요한 것은 형광단을 광표백하지 않고 지질 나노튜브를 시각화할 수 있도록 적절한 노출 시간 및 ND 필터 세트를 선택하는 것이다. 지질 나노 튜브의 위상 거동 구성을 조정하면 최소한의 모델 시스템을 사용하여 세포를 연결하는 터널링 나노 튜브의 생물 물리학 연구를 시작할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

이 비디오에서는 액틴-미오신 상호작용을 분석하기 위해 체외 운동성 분석을 수행합니다. 고정된 미오신 분자에 대한 액틴 필라멘트의 활공 운동은 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

Gliding Actin Filament Assay: 고정된 Myosins에 대한 Actin 필라멘트의 전좌를 연구하기 위한 In Vitro Motility Assay

지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

우리는 코어에 자체 조립 나노 구조를 포함하는 지질 입자의 운동 안정화를 위한 탄소 나노튜브의 스마트 응용에 대해 보고합니다. 지질 입자의 준비에는 약물 전달과 같은 생물 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 다소 낮은 농도의 탄소 나노튜브가 필요합니다.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

배우세요 글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작 방법을. 분자 모터를 활용한 자기조립으로 대규모 네트워크를 효율적으로 생성하고 상분리 거동을 연구합니다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

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