Name: RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 방법을 접촉 억제를 통해 유도하고 RNA-seq로 분자적 특성을 분석하는 기술을. 이 프로토콜은 피부 생물학 및 후성유전체 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 과학 연구를위한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO / ALW / MEERVOUD / 836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/오픈 대회/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); 라드부 드 대학 펠로우십 (H.Z.); 중국장학원 교부금 201406330059(J.Q.).

<ol><li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin%3A+from+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li>
<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
<li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li>
<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li>
<li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1%2FK10+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li>
<li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li>
<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
<li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li>
<li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).</li>
<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019).</li>
<li>Doyle, K. aM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+KaM+%22Protocols+and+applications+guide%22">Protocols and applications guide</a>. , Promega Corporation. Madison. (1996).</li>
<li>Roche. Hyperprep Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019).</li>
<li>Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOrilla%3A+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019).</li>
<li>Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 작품은 RNA-seq 분석을 사용하여 인간 각질 세포 분화 및 후속 특성화를 유도하는 방법을 설명합니다. 현재 문헌에서는, 인간 각질세포분화에 대한 많은 연구가 2,3,23의분화를 유도하는 방법으로높은 칼슘 농도 또는 혈청을 사용하는 두 가지 다른 방법을 사용한다. 이전 보고서는 이 세 가지 다른 방법3을 신중하게 비교하고 이러한 방법이 각질 세포 분화의 뚜렷한 생물학을 나타낼 수 있음을 보여 주었다. 이 같은 보고서에서, 저자는 혈청에 의해 유도된 분화세포가 건선 피부에서 발현되지만 정상 표피에서는 발현되지 않는 KRT16 및 SKALP/PI3와 같은 높은 증식 전위 및 발현 유전자를 가지고 있으며, 따라서 혈청 유도 분화 모델을 건선을 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다. 대조적으로, 접촉 억제 및 성장 인자...

인간의 피부에서 유래된 인간 1차 각질세포는 표피1,2,3,4의생물학을 연구하기 위해 세포 모델로 자주 사용된다. 표피의 계층화는 2D 침수 단층 패션 또는 3D 공기 리프트 organotypic 모델2,3,5,6,7에서각질 세포 분화에 의해 모델링 될 수 있습니다. 3D 모델은 표피 구조와 기능을 평가하는 것이 점점 더 중요해지고 있지만, 2D 분화 모델은 여전히 널리 사용되고 있습니다.
혈청, 고농도 칼슘, 저온 및 표피 성장 인자 수용체2,3의억제를 포함하여 2D에서 각질 세포 분화를 유도하는 다양한 조건이 적용되었다. 이들 각각의 방법은 다수의 각질 세포 분화 마커 유전자에 의해 검증되었으며 병리학적 조건 하에서 케라틴 세포 분화를 평가하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 유도 조건은 마커 유전자의 특정 패널이검사될때 그들의 분화 효율 및 운동학에 있는 다름을2,3를보여줍니다.
이러한 방법 중 하나는 배양 배지8에서성장 인자의 각질 세포 접촉 억제 및 고갈을 포함한다. 세포가 전체 밀도에 도달할 때 각질 세포가 자발적으로 분화할 수 있음을 보여주었습니다.  배양 배지의 성장 요인을 제외하면 차별화를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 접촉 억제 및 고갈성장 인자를 결합하는 방법은 여러 표피 마커3을사용할 때 정상 계층화 표피와 유사한 유전자 발현 패턴과 분화된 각질 세포체를 생성하는 것으로 나타났으며, 이 모델은 정상 각질 세포 분화를 연구하는 데 적합하다는 것을 시사한다. 최근에는 본 모델을 이용한 각질 세포 분화의 2개의 포괄적인 유전자 발현 분석이9,10으로보고되었다. 연구원은 분자 수준에서 이 모형을 확인하고 정상및 병은 각질 세포 분화를 공부하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.
이 프로토콜은 RNA-seq를 사용하여 분화 된 세포의 체외 분화 방법 및 분자 분석에 대한 절차를 설명합니다. 또한 분화일 0(증식 단계), 2일차, 4일, 7일(각각 조기, 중, 후기 분화)에 대한 세포의 전사의 특성화를 보여 준다. 분화 된 각질 세포가 표피 계층화 중에 세포를 크게 닮은 유전자 발현 패턴을 표시하는 것으로 나타났습니다. 이 방법이 피부 병리학을 연구하는 데 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 동일한 실험 및 분석 파이프 라인을 적용하여 방황, 이장 물 분비증 및 갈라진 입술 / 미각 증후군 (EEC) 증후군11,12를가진 환자로부터 파생된 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포를 조사했습니다. 이 프로토콜은 각질 세포의 체외 분화뿐만 아니라 RNA-seq의 후속 생물 정보 분석에 초점을 맞추고 있습니다. RNA 추출, RNA-seq 샘플 준비 및 라이브러리 구조와 같은 완전한 절차의 다른 단계는 잘 문서화되어 있으며 특히 일반적으로 사용되는 많은 상용 키트를 사용할 때 쉽게 따를 수 있습니다. 따라서 이러한 단계는 프로토콜에 간단히 설명됩니다. 데이터는 이 파이프라인이 건강하고 병에 걸린 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물 (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time system</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth factor (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Part of the bulletKit</td></tr><tr><td>에탄올 아민 >= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>고감도 DNA 칩</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit 부품</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>저농도 측정 키트</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase,</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq kit</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (model)</td><td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurement</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA 바코드 -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp long primers</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

인간 1 차 각질 세포는 표피 분화 및 관련 질병에 대한 연구를위한 시험관 내 모델로 자주 사용됩니다. 다양한 유도 조건을 이용하여 2차원(2D) 침수 된 매너로 배양된 각질 세포의 체외 분화를 위한 방법이 보고되었다. 여기에 기재된 시험관내 각질 세포 분화 방법에 대한 절차는 RNA-seq에 의한 접촉 억제 및 후속 분자 특성화에 의한 것입니다. 간단히 말해서, 각질 세포는 완전히 수렴될 때까지 성장 요인으로 보충되는 정의된 각질 세포 배지에서 재배됩니다. 분화는 각질 세포 사이의 긴밀한 접촉에 의해 유도되고 매체에서 성장 인자를 배제함으로써 더욱 자극된다. RNA-seq 분석을 사용하여, 1) 분화된 각질 세포는 분화 도중 뚜렷한 분자 서명을 나타내고 2) 동적 유전자 발현 패턴은 표피 계층화 도중 세포를 크게 닮은 것으로 나타났다. 일반적인 각질 세포 분화에 비교하는 것과 관해서는, 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포는 그들의 분화 결함과 일치하여 변경된 형태학 및 분자 서명을 나타낸다. 결론적으로, 이 프로토콜은 RNA-seq 데이터의 생물정보 분석에 중점을 두고 2D 내 각질 세포 분화 및 분자 특성화를 위한 단계를 자세히 설명합니다. RNA 추출 및 RNA-seq 절차는 잘 문서화되었기 때문에, 이 프로토콜의 초점이 아닙니다. 체외 각막 세포 분화 및 생물 정보 분석 파이프 라인의 실험 절차는 건강하고 병이 있는 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

정상적인 각질 세포 분화 및 RNA-seq 분석 이 실험에서, 5명의 개인에게서 유래된 각질 세포 라인은 분화 및 RNA-seq 분석을 위해 사용되었다. 도 1은 분화 및 RNA-seq 분석 결과의 실험 적 절차를 요약한다. 분화 시 정상적인 각질 세포 및 세포 형태 변화의 체외 분화 절차의 개요는 도 1A에도시된다. 원리 성분 분석(PCA)은 분화를 겪고 있는 각질 세포가 연결되었지만 뚜렷한 전반적인 유전자 발현프로파일(도 1B)을보였다. 고가변 유전자는 분화(도1C)동안유전자 발현 역학 및 패턴을 시각화하기 위해 kmeans에 의해 클러스터되었다.
유전자의 각 클러스터는 각질 세포 분화 특징 유전자 (예를 들어, 증식을 위한 KR...

여기에 제시된 RNA-seq 분석에 의한 분자 수준에서의 특성화에 의해 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포의 체외 분화를 위한 단계별 절차이다.

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

이 프로토콜에서는 두 부분을 포함하는 절차를 설명합니다. 먼저, 접촉 억제에 의한 시험관 내 단층 2D 각질 세포 분화 방법. 둘째, RNA-seq에 의한 분자 특성.2D 시험관 내 분화 방법은 간단하고 수행하기 쉽습니다. 특히 많은 수의 세포가 필요한 경우 표피 분화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 전도 분석에서.상세한 RNA-seq 분석 파이프라인은 기본적인 생물정보학 기술을 가진 연구자에게 명확하고 투명하며, 모든 벌크 RNA-seq 분석에 사용할 수 있습니다. 처음으로 분화 프로토콜을 수행할 때 시드 밀도가 까다로울 수 있습니다. 셀라인에 가장 적합한 시드 밀도를 알아보십시오.원고 방향에 따라 각질 세포 성장 매체 또는 KGM 및 500 밀리리터 각각의 증식 배지 및 분화 매체를 준비하는 것으로 시작합니다. 5~20, 000세포의 밀도로 1차 각질세포를 제곱하고 세포를 덮을 수 있는 충분한 증식 배지를 추가한다. 파종 후 2일 후, 증식 배지로 세포를 새로 고칩니다.현미경으로 세포를 정기적으로 확인하고 격일로 매체를 새로 고칩니다. 세포가 90%에 도달하면 배지를 분화 배지로 변경하여 분화를 유도한다. 추가 RNA 분석을 위해 세포를 수집하려면 DPBS로 세포를 두 번 세척한 다음 용해 버퍼를 추가합니다.분화일 0, 2, 4, 7일에 세포를 수집합니다. RNA 격리 후 이중 좌초 된 cDNA가 변환되고 RNA-seq 라이브러리는 차세대 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 시퀀싱 후, 시퀀스 판독은 인간 게놈에 다운로드되고 매핑됩니다.R 패키지를 다운로드하고 설치한 후 readspergene.out에서 계정 테이블을 생성합니다. 파일을 탭하고 모든 파일 이름, 차별화 일 및 기타 관련 샘플 데이터가 포함된 샘플 데이터 파일을 작성합니다. 예를 들어 추가 코딩 파일을 참조하십시오.그런 다음 카운트 테이블과 샘플 데이터를 사용하여 카운트 가능한 데이터와 샘플 데이터를 모두 포함하는 deseq2 개체를 생성합니다. 유전자 발현 정규화를 위해 deseq2RLD 또는 VST 정규화를 사용하여 deseq2 개체의 카운트 테이블을 정규화합니다. RLD 정규화를 선호하지만 VST 정규화는 훨씬 빠릅니다.R에서 dist 함수를 사용하여 정규화된 읽기 수 강도에 따라 샘플 거리를 플롯한 다음 샘플 거리에 따라 hclust 클러스터링을 수행합니다. 다음으로, pheatmap 함수를 사용하여 열지도를 플롯합니다. 마지막

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

이 비디오는 in ovo electroporation으로 transfection 후 절개된 병아리 배아 척수 샘플에 대해 전체 전사체 분석을 수행하기 위한 기본 단계를 보여줍니다.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한...

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

학습하세요 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 방법을 접촉 억제를 통해 유도하고 RNA-seq로 분자적 특성을 분석하는 기술을. 이 프로토콜은 피부 생물학 및 후성유전체 연구에 활용됩니다.

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

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