Name: 성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 생쥐 심장에서 섬유 아세포와 근섬유 아세포를 고순도로 분리하는 방법을. 면역형광, RT-PCR, 형광 세포 분류술을 활용하여 상처 치유와 섬유증 연구에 필수적인 세포 특성을 분석합니다.

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저자는 αSMA-GFP 마우스에 대한 박사 이보 Kalajzic 감사하고 싶어. 이 간행물에 보고된 연구는 국립 보건원의 국립 의학 연구소에 의해 지원되었다 (NIH) 수상 번호 R01GM118300 (S.S.), NIH의 생물 의학 이미징 및 생명 공학의 국립 연구소 수상 번호 R21EB019509 (P.P.Y.) 및 수상 번호 17SDG33630187 (S.S.)에 따라 미국 심장 협회의 과학자 개발 보조금. 유세포 분석 분석은 밴더빌트 잉그람 암 센터(P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터(DK058404)가 지원하는 VUMC 유동 세포분석 공유 리소스에서 수행되었습니다.

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

섬유아세포는 다양한 마커 세트로 확인된 이종 세포 그룹입니다. 섬유아세포를 식별하는 데 사용된 단백질 마커는 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2), 피브로넥틴, 비멘틴, 콜라겐 I 및 III, 및 Thy115,,16,,17,,18,,19,,20이다. 비멘틴은 손상되지 않은 정지성 심장 섬유아세포, 섬유아세포 특이적 단백질 1, αSMA 및 페리오신을 식별하는 데 사용되어 왔지만, αSMA는 활성화된 섬유아세포6,,12,,2...

심장 섬유 아세포, 중간 엽 기원의 세포는 항상성 동안 심장 아키텍처의 유지 보수 이외에 심장의 전기 전도 및 기계적 힘을 유지하는 데 중요한 역할을합니다1. 상해 다음, 이 세포는 활성화, 확장, 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 생산2. 많은 전임상 연구는 부상당한 심혼의 구조적 무결성을 유지하는 중요한3 세포 조절제로서 섬유아세포를 밝혀3 뿐만 아니라 ECM 단백질의 확인되지 않은 생산 및 침착을 담당하는 주요 이펙터 세포, 뻣뻣한 흉터 형성 및 심부전의 결과로4. 섬유아세포는 세포의 이질적인 그룹으로, 프로 섬유성 부적응 특성으로부터 회복 기능을 해부하는 것이 어렵습니다. 최근, 심근 손상 에 따른 두 개의 뚜렷한 섬유아세포 아형의 기능적 이질성이 정의되어, 상이한 섬유아세포 아형을 분리하고 상처 치유에서 그들의 역할을 연구할 가능성을 나타낸다5.
순수한 섬유아세포 집단을 얻는 것은 수리및 섬유증에 있는 그들의 기능적인 역할을 delineating에서 결정적입니다. 그러나, 다른 세포 모형을 인식하는 다중 섬유아세포 마커의 존재는 실질적으로 순수한 섬유아세포 인구를 격리하는 것을 도전하게합니다 6. 몇몇 우아한 연구 결과는 부상과 부상당한 심근에서 심장 섬유아세포를 격리하는 영리한 쪽을 고안했습니다. 섬유아세포 농축의 가장 대중적이고 잘 확립된 방법은 효소 조직 소화7에따른 선택적 접착을 통해서이다.
부가적으로, 세포 표면 항원을 기초로 한 섬유아세포의 형광 활성화 세포 선별(FACS)은8에성공적으로 기술되었다. 연구에서, 효소 소화 에 이어, 중간 엽 세포는 계보 음성으로 분류되었다 (린 : Ter119-CD45-CD31-) 및 gp38 양성 (gp38+) 마우스 하트에서. Gp38+ve 세포는 col1α1 및 기타 중간엽 마커의 그들의 공동 발현에 기초하여 섬유아세포로 확인되었다. 대부분의 조직 소화는 페트리 접시에서 심실을 해부한 후에 완료되지만, 최근 연구는 섬유아세포9를포함하는 근세포 및 비근세포등을 분리하기 위해 좌심실의 직접 바늘 효소 관류의 사용을 조사하였다. 섬유아세포는 이 경우 선택적 부착에 의해 분리되었다.
이 프로토콜은 세 가지 방법을 사용하여 섬유아세포의 격리 및 농축을 설명합니다. 첫 번째는 효소 소화 다음 섬유 아세포의 선택적 접착을 포함 하는 이미 설립 된 방법. 두 번째 방법은 주로 근섬유 아세포를 발현하는 상해 유발 알파 평활근을 분리하는 데 사용된다. 세 번째 방법은 조혈 및 내피 세포의 효소 소화 심장 세포 현탁액의 순차적 자기 고갈을 포함한다. 고갈 다음, 섬유아세포/근섬유아세포는 자기 구슬을 사용하여 항원 MEFSK4의 존재에 기초하여 단리된다. 최근, MEFSK4는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지에 존재하는 항원으로서 기술되어 섬유아세포 식별 및 격리에 적합한 마커가 되고 있다. 당연히 여기에 설명된 모든 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 따라서 유량 분석, 면역 염색 및 반정량 적 실시간 PCR에 의해 단리된 세포 집단의 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 그러나, 이러한 방법론은 에 확장 될 수 있고, 추가 마커는 중요한 실험을 위한 섬유아세포 및 myofibroblast 인구를 이용하기 전에 그밖 오염인구를 제외하기 위하여 추가될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>항진균성(Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td></td><td></td><td></td>칼슘</tr><tr><td>구연산염 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 혼합물(Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI water</td><td></td><td></td><td></td></tr> Dnase I(20U/mL)BioRad 11330057 <tr><td></td><td></td> Ca2+ 및 Mg2+Gibco <td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr> FC 차단 <tr><td></td> 제(정제)가 없는 Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828 DI water <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM-F12</td> Life <td>기술</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD16 / CD32)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>생명 기술</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10 % 염소 혈청</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) Ca2 + 및 Mg2 +</td> <td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit 완충 분말</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td><td>Invital</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Slow-fade Mounting Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4 %)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Rat Collagen</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (stock : DMSO의 1 mg / mL 용액)</td> <td>분자 프로브</td><td>A1310</td><td>희석 = 1 : 1000; RRID =</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>희석 = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>희석 = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&알파; 1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>희석 = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>고스트 염료 바이올렛 510 (제형 : DMSO에서 1 uL / 테스트)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>희석 = 1 : 1000; RRID =</td></tr> <tr><td>염소 안티 마우스 Alexa Fluor 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11029</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 -Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 -FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>염소 항 쥐 Alexa Fluor 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11006</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>염소 항 쥐 Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>페리오스틴</td><td>산타 크루즈</td><td>SC67233</td><td>희석 = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>희석 = 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alpha;-평활근 액틴(&alpha;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>희석 = 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>섬유아세포 특이적 단백질 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>희석 = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 마그네틱 비드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 마그네틱 비드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>안티 피더 셀-APC (MEFSK4)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>희석 = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>anti-APC 비드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>희석 = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>당나귀 항 쥐 Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>희석 = 1:100</td></tr><tr><td>항 AN2 / NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>희석 = 1 : 11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td>기타 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 필터</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>로커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 가장자리 블레이드</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>외과 용 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&alpha; SMA 리포터 마우스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기 자기장</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리 컬럼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen Rneasy 미니 키트</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G Needle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Laser Flow 세포 분석 기계 (BD FACSAria III)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유동 데이터 수집 소프트웨어 (BD FACSDiva 소프트웨어 v8.0a)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유동 데이터 분석 소프트웨어 (FlowJo 소프트웨어)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

상해에 응하여 심장 섬유증은 상처 치유에 생리적인 반응입니다. 섬유증을 완화하는 섬유아세포 아류형을 연구하고 표적으로 하기 위한 노력이 이루어졌다. 그러나, 섬유아세포 연구는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지를 확인하기 위해 보편적으로 허용되는 섬유아세포 마커의 부족으로 인해 방해받고 있다. 섬유아세포는 이질적인 세포 집단으로, 분리하고 특성화하기 가 어렵습니다. 제시된 프로토콜은 부상과 부상당한 마우스 하트에서 섬유 아세포와 근섬유 아세포를 풍부하게하는 세 가지 방법을 설명합니다. 섬유아세포를 분리하기 위해 표준적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용하면 항상성 및 섬유변조에서의 역할에 대한 연구가 가능해질 것입니다.

αSMA-GFP 리포터 마우스를 사용하여 근섬유아세포 격리를 입증하는 유동 게이팅 방식 αSMA-GFP 리포터 마우스 모델에서 부상당한 하트는 검출 가능한GFP+ 세포를 나타내지 않았다; 따라서, 이들은 GFP 채널 사후 보상의 배경 신호에 대한 게이트를 확립하는 데사용되었다(그림 2). αSMA+ 세포는 MI 다음 10일 후 부상당한 좌심실으로부터의 GFP 발현의 존재에 기초하여 분류되었다. 내피의 작은 비율 (GFP +/CD31+ 세포; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) 및 조혈 (GFP +/CD45+ 세포; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) 세포는 또한 부상당한 αSMA-GFP 마우스 하트에서 GFP를 발현하였다(도2A). 그러나, GFP+/CD31-/CD45-세포는 AN2, peri...

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

이 프로토콜은 우리가 중요한 순도로 정지와 상해 유도한 활성화된 섬유아세포 인구를 둘 다 격리할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 즉흥연주를 위한 유연성입니다. 유동뿐만 아니라 비드 기반 절연의 경우, 오염된 세포에 대한 항체를 통합하여 격리된 표적 세포에서 제외할 수 있다.이 기술은 주로 심장 섬유아세포 격리에 사용됩니다. 그러나, 그것은 다른 조직에서 섬유 아 세포를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 학부 인턴인 Meiling Melzer와 제 실험실의 연구 조교인 데이비드 비어(David Beier)가 될 것입니다.해부 동안 6개의 하트를 보관할 수 있는 6웰 플레이트를 준비하려면 차가운 KHB 2밀리리터를 각 우물에 분배하고 접시를 얼음 위에 놓습니다. 몸에 70%에탄올을 뿌림합니다. 복부 면이 실험자에게 직면할 수 있도록 방향을 지정합니다.간섭을 방지하기 위해 부속물을 고정합니다. 간을 관통하지 않고 복부 피부와 근육을 잘라냅니다. 흉골을 향해 수직으로 자르고 심장을 관통하지 않고 흉부를 조심스럽게 열어 주세요.다음으로 흉곽을 계속 잘라 서 심장을 노출합니다. 집게를 사용하여 심장을 가슴 밖으로 부드럽게 들어 올려 심장 바깥쪽에 부착된 폐 또는 과잉 조직을 잘라냅니다. 왼쪽 심실을 분리합니다.각 해부에 대해, 6 웰 플레이트의 별도의 우물에 심실을 배치합니다. 첫째, 집게를 사용하여 KHB의 심실을 반복적으로 짜내고 동요하여 과도한 혈액을 제거하십시오. 심실을 깨끗하고 멸균된 10센티미터 평방 플레이트로 옮기습니다.다음으로, 단날 블레이드를 사용하여 심실을 작은 조각으로 빠르게 다진다. 콜라게나아제 소화 칵테일 1밀리리터를 넣고 계속 다진 다듬습니다. 조각이 1 밀리리터 마이크로 파이프로 전송할 만큼 작을 때 50 밀리리터 원뿔 튜브로 옮기십시오.두 밀리리터의 칵테일로 접시를 두 번 씻고 세척을 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 30분 동안 배양하고, 5밀리리터 파이펫을 사용하여 원고에 설명된 바와 같이 세포를 재보선한다. 초기 재서스펜션 후, 세포를 15분 동안 배양하고 10밀리리터 파이펫을 사용하여 다시 다시 중단합니다.그런 다음 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 새로운 50밀리리터 원뿔 튜브 위에 놓고 KHB의 1~2밀리리터로 습식하여 스트레이너를 프라임합니다. 소화 현탁액에 25 밀리리터의 KHB를 추가하고 다시 중단합니다. 여과기를 통해 서스펜션을 필터링하고 필요에 따라 여과기를 교체합니다.10 분 동안 400 배 g와 섭씨 4도에서 여과물을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 심장 당 5 밀리리터를 사용하여 1x RBC 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 분리합니다. 실온에서 2분 동안 서스펜션을 배양한 후 실온에서 10분 동안 서스펜션을 400배 g로 원심분리합니다.상체를 제거한 다음 KHB의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 그런 다음 서스펜션에 KHB의 9 밀리리터를 추가합니다. 40마이크로미터 의 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 새로운 50밀리리터 원유형 튜브로 필터링합니다.원심 분리는 실온에서 10 분 동안 400 배 g에서 원심 튜브를 분리합니다. 마지막으로, 상체를 제거하고 섬유아세포 미디어 또는 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리한다. 세포 수가 결정된 후, 섬유아세포는 원고에 기재된 세 가지 다른 방법에 의해 현탁액으로부터 분리될 수 있다.차동 도금에 의한 격리를 시작하려면 각 웰에 섬유아세포 미디어 2밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트를 준비합니다. 접시를 소용돌이치고 잘 바닥을 덮습니다. 마우스 심장 세포가 PBS에서 중단되는 경우에, 원심분리기 및 심혼 당 섬유아세포 매체의 1 밀리리터에서 그(것)들을 재중단합니다.각 웰에 한 심장에 해당하는 세포 현탁액 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이어 세포를 균등하게 분배합니다. 잘 당 최대 4 밀리리터의 총 볼륨에 대한 섬유 아세포 미디어의 1 ~ 2 밀리리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하세요. 섬유아세포는 우물을 선택적으로 고수하기 때문에 미디어를 제거하고 폐기하여 격리될 수 있습니다. 나머지 부착된 세포를 PBS 2밀리리터로 세척한 다음, 잘 하면 멸균 섬유아세포 미디어 2~4밀리리터를 첨가합니다.37도에서 컨서적 일 때까지 배양하여 2 ~4 일마다 미디어를 변경합니다. CD45 양성 조혈 세포의 자기 라벨링 및 분리를 시작하려면 5 분 동안 500 배 g에서 마우스 심장 세포의 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 평형 버퍼의 1 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 분리합니다.혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 다시 원심분리한 후, 세포 펠릿을 평형 버퍼로 재보페킹한다. CD45 양성 자성 구슬을 추가하고 잘 섞습니다.섭씨 4도에서 최소 15분 동안 배양하세요. 평형 버퍼를 추가하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 500 배 g에서 원심 분리를 추가하여 세포를 씻으하십시오. 상체를 제거하고 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.평형 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 40마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 전달하여 세포 집계가 분리 열을 막히는 것을 방지합니다. 다음으로, 적절한 분리기의 자기장에 분리 열을 배치하고, PBS의 적어도 3 밀리리터로 컬럼을 상형화한다.컬럼을 통해 세포 현탁액을 붓고, 15밀리리터 원내 튜브에 표지되지 않은 세포를 포함하는 흐름을 수집한다. 평형 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 세 번 세척하고 세척을 흐름 통과와 결합합니다. 분리기에서 컬럼을 제거하고 15밀리리터 원판 튜브에 컬럼을 놓습니다.표시된 CD45 양성 셀을 elute하려면 평형 버퍼5 밀리리터를 열에 넣고 열을 단단히 급락시합니다. 원심 분리는 용액의 튜브와 500 배 g에서 유동 튜브를 유량 관통합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.격리를 완료하려면 CD31 양성 내피 세포 및 MEFSK4 양성 섬유아세포에 대한 원고의 프로토콜을 따르십시오. 형광 활성화 세포 분류는 심근 경색 다음 알파-SMA-GFP 마우스 심혼으로부터 분리된 단일 세포에서 수행되었다. 대표적인 게이팅 방식은 CD31, CD45 또는 AN2를 공동 발현하는 GFP 양성 세포를 시연한다.부상당한 마우스 심혼에서, 내피 세포및 조혈 세포의 작은 백분율은 GFP를 표현했습니다. 그러나, GFP 양성/CD31-음수/CD45-음수 세포는 AN2, pericyte 마커를 발현하지 않았다. GFP 양성 세포는 알파-SMA, 콜라겐 1알파1, 페리오틴 및 비멘틴을 발현하였다.선택적 접착력에 의해 분리된 부상되지 않은 섬유아세포는 비멘틴을 표현했지만 알파-SMA, periostin 또는 콜라겐 1알파1의 발현을 보여주지 않았다. 부상되지 않은 섬유아세포와 활성 섬유아세포 는 모두 MEFSK4 항원으로 표현되었습니다. 선택적 접착력에 의해 분리된 부상하지 않은 섬유아세포와 알파-SMA-GFP 마우스에서 분리및 정렬된 근섬유아세포는 콜라겐을 계약하는 능력을 입증했습니다.배양 하기 전에 조직을 완전히 다진 것이 중요 하다. 비드 계 분리 전에, 세포 응집을 방지하기 위해 40 마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 통과하는 것이 중요하다. 이 방법에 의해 정제된 세포는 높은 수준의 순도를 보장하기 위해 pericyte 특이적 항체와 관련된 자기 비드를 사용하여 더욱 정제될 수 있었다.새로운 비드-컨쥬게이드 항체뿐만 아니라 리포터 형질성 마우스의 가용성으로, 하나는 섬유 아세포뿐만 아니라 뚜렷한 세포 집단을 격리하고 연구하기 위해 이러한 기술을 활용할 수 있습니다.

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

배우세요 생쥐 심장에서 섬유 아세포와 근섬유 아세포를 고순도로 분리하는 방법을. 면역형광, RT-PCR, 형광 세포 분류술을 활용하여 상처 치유와 섬유증 연구에 필수적인 세포 특성을 분석합니다.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

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