Name: 공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 올리고엔드로시테 정제 및 컨디셔닝 배지 생성 방법을 통해 신경과학 연구에서 세포 분화와 미엘린화 메커니즘을 탐구하세요. 이 기술은 효율적인 공동 문화 실험을 가능하게 합니다.

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저자는 원고 편집에 대한 그의 현명한 조언에 대한 레미 론자노에게 감사드립니다. 이 작품은 ICM, INSERM, NSF에 ARSEP 재단 보조금, 부베 라브루예르 가격에 의해 지원되었다.

이 실험에서 쥐의 관리 및 사용은 기관 정책 및 지침 (UPMC, INSERM 및 유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)을 준수합니다. 다음 프로토콜은 12 개의 새끼의 표준 쓰레기에 대해 설정됩니다.
1. 플라스크 준비 (~5 분)
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 해부 전날 다음 단계를 수행하십시오.
<ol><li>폴리에틸렌민 5 mL(PEI, 100 mg/L, 보충 파일 1의프로토콜 참조)을 사용하여 필터 캡(2개 새끼용 플라스크 1개)으로 150 cm2 플라스크(T150)를 코팅합니다.</li>
	<li>플라스크를 밤새 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>해부 당일 멸균 증류수로 플라스크를 3회 헹구어 줍니다.</li>
</ol>2. 미디어 준비 (~10분)
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
<ol><li>500 mL의 배양 배지를 준비, DULbecco의 수정 된 독수리 매체로 구성 (DMEM) 보충 10% 태아 송아지 혈 청의 (FCS) 그리고 페니실린-스트렙토 마이신 (100 IU/mL).</li>
	<li>DMEM 20 mL, DNase 200 μL (50 μg/mL), 파페인 200 μL (30 U/mL) 및 L-시스테인 200 μL (0.24 mg/mL)으로 구성된 50 mL 튜브에서 효소 소화 배지 20.6 mL을 준비하십시오.</li>
	<li>0.22 μm 필터를 사용하여 매체를 필터 살균합니다.</li>
	<li>해부 될 때까지 상층 부류 후드에 매체를 실온 (RT)에서 유지합니다.</li>
</ol>3. 해부 준비 (~10 분)
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
<ol><li>칼슘과 마그네슘 (PBS; 1x)없이 인산염 완충 식염수 100 mL를 준비하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.</li>
	<li>45% 포도당의 750 μL로 보충된 얼음-차가운 1x PBS 용액 50 mL을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.</li>
	<li>100mm 페트리 접시에 청소 용 1x PBS와 3 개의 60mm 페트리 접시와 얼음차가운 PBS-포도당을 채취하십시오. 해부될 때까지 페트리 접시를 얼음위에 올려 놓습니다.</li>
</ol>4. 해부
참고 : 해부는 출생 후 날 (P) 2에서 남성과 여성의 위스타 쥐 새끼에서 수행됩니다.
<ol><li>멸균 환경을 제공하기 위해 100 % 에탄올로 벤치를 청소하십시오. 100 % 에탄올로 모든 수술 도구를 살균하십시오.</li>
	<li>70% 에탄올로 강아지의 목을 부드럽게 스프레이하세요.</li>
	<li>큰 수술 용 가위를 사용하여 동물을 참수하고 얼음 차가운 PBS -포도당이 들어있는 100mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다.</li>
	<li>구부러진 집게를 사용하여 동물의 머리를 눈 높이에서 유지합니다. 작은 수술 가위를 사용하여 두개골 의 기지에서 작은 절개를하고 뇌 중간선을 따라 두개골을 잘라냅니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 중간선에서 두개골의 두 부분을 부드럽게 벗깁니다.</li>
	<li>작은 수술 용 숟가락을 사용하여 머리 구멍에서 뇌를 제거하십시오. 얼음에 얼음 차가운 PBS-포도당을 포함하는 60mm 페트리 접시에 뇌를 넣습니다.</li>
	<li>스테로 현미경의 밑에 보기, 뇌반구에서 소뇌, 뇌간 및 후각 전구를 제거하기 위하여 정밀한 집게를 이용하십시오.</li>
	<li>미세 한 집게를 사용 하 여 두 대뇌 반구를 분리 합니다. 수막껍질을 벗기기 위해 미세한 포셉을 사용하십시오. 대뇌 피질 을 얼음에 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 참고: 얼음으로 차가운 PBS는 올바른 수막 제거에 매우 중요합니다.</li>
</ol>5. 조직 해리
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
<ol><li>날카로운 메스를 사용하여 대뇌 피신도를 잘게 자릅니다. 다진 조직을 효소 소화 배지를 함유하는 50 mL 튜브로 옮김.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2미만에서 가습된 인큐베이터에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>p1000 마이크로파이펫을 사용하여 피질 조직이 50 mL 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인하면서 효소 소화 매체를 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>p1000 마이크로파이펫을 사용하여 DMEM-10% FCS 1mL를 추가하고 조직을 부드럽게 삼분화하십시오.</li>
	<li>70 μm 필터와 1 mL 주사기의 피스톤을 사용하여 피질 조직을 50 mL 튜브로 필터링하십시오. 참고 : 하나는 DMEM-10 % FCS로 내부 튜브 벽에 잔류 조직을 여러 번 헹구을 수 있습니다.</li>
	<li>DMEM-10% FCS로 50 mL 튜브를 채웁니다. RT에서 5분 동안 423 x g의 원심분리기를 조심스럽게 제거하고 DMEM-10% FCS 2 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>p1000 마이크로파이펫으로 세포 펠릿을 부드럽게 삼각측량한 다음 p200 마이크로파이펫을 사용하십시오. DMEM-10% FCS의 적절한 부피로 셀 현탁액을 희석합니다. 참고: 두 개의 뇌 = 하나의 T150 = DMEM-10% FCS의 5mL.</li>
	<li>1 x 105 셀 /cm2의밀도에서 T150에 셀 현탁액의 플레이트 5 mL. 각 T150에 따뜻한 DMEM-10% FCS 20mL를 추가합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.</li>
	<li>따뜻한 DMEM-10% FCS로 6일 간 체외(DIV) 후 배양 배지의 절반을 갱신한다.</li>
</ol>6. 떨기 준비
<ol><li>멸균 조건하에서 층류 후드에서 흔들기 전에 하루에 흔들리는 준비를 수행하십시오.</li>
	<li>신선한 따뜻한 배양 배지를 플라스크에 첨가하여 배양 배지의 절반을 갱신하고 5%CO2미만에서 37°C에서 배양한다.</li>
</ol>7. 흔들림
<ol><li>PEI와 세 100mm 페트리 접시를 코트. 밤새 4°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>플라스크 캡을 파라핀 필름으로 덮고 플라스크를 비닐 봉지에 넣습니다. 37°C에서 250 rpm에서 밤새 신경교 세포를 함유한 플라스크를 흔들어 주세요. 참고: 첫 번째 흔들림은 8 DIV에서 수행되며, 하나는 최대 세 개의 서로 다른 흔들림을 수행할 수 있습니다(타이밍은 그림 1 참조).</li>
</ol>8. OL 혈통 세포 수확 및 배양
참고: 이러한 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다.
<ol><li>흔들은 다음 날, 표 1에따라 보텐슈타인-사토(BS) 배지를 준비한다.</li>
	<li>멸균 증류수로 페트리 접시를 3회 헹구어 줍니다.</li>
	<li>수확 플라스크의 상급은 주로 OL 혈통 세포뿐만 아니라 일부 미세 교세포를 함유하고 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시에 접시. 참고 : 이 단계는 접시 표면에 차동 빠른 접착을 통해 미세 교세포의 제거를 할 수 있습니다.</li>
	<li>5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.</li>
	<li>각 T150 플라스크를 25 mL의 따뜻한 신선하게 제조된 배양 배지로 채우고 2차 흔들림까지 5%CO2 미만의 37°C에서 가습된 인큐베이터에 인큐베이터를 배양한다.</li>
	<li>페트리 접시에서 상류감을 새로운 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시로 옮겨 잔류 미세 교만 세포의 부착을 허용합니다.</li>
	<li>5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.</li>
	<li>부착되지 않은 OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 제거하고 50 mL 튜브로 옮김 (50 mL 튜브의 경우 2 페트리 접시에서 상판)으로 옮니다. 마이크로글리아로 도금된 페트리 접시를 버리십시오.</li>
	<li>423 x g에서5 분 동안 상급을 원심 분리기 . 조심스럽게 상류를 제거하고 BS 배지 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 일반적인 50 mL 튜브에 모든 펠릿을 풀하고 BS 배지로 볼륨을 10 mL로 조정합니다.</li>
	<li>현미경으로 세포 밀도 계수 세포를 결정합니다. 참고: 3 x 105/mL과 5 x 105/mL사이의 셀 밀도를 얻어야 합니다.</li>
	<li>셀 밀도가 4 x 10 5/mL보다 높거나30 mL의 최종 부피를 얻으려면 BS의 20 mL를 추가하거나 셀 밀도가 4 x 105/mL 미만인 경우 BS의 10 mL만 추가하여 최종 부피를 20 mL로 얻습니다.</li>
	<li>10 mL의 셀 서스펜션으로 미리 코팅 된 100mm 페트리 접시 2 개 또는 3 개 접시. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.</li>
	<li>나중에 BS 매체 2 시간 모두 를 상쾌하게하여 페트리 요리의 파편을 지웁히. 참고 : 세포 밀도와 파편 제거의 효율성을 확인하기 위해 클리어 전후 현미경으로 배양을 검사하십시오.</li>
	<li>BS 배지에서 37°C에서 5%CO2미만에서 2일 동안 배양한다. 참고 : 현미경으로 배양을 검사하십시오. 합류는 70 %에서 80 %여야합니다.</li>
</ol>9. OCM 생산
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 이러한 단계를 수행합니다.
<ol><li>표 2에따라 NB-B27low 배지를 준비합니다.</li>
	<li>따뜻한 NB-B27low 배지 10 mL로 배양 배지를 리뉴얼합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 2 일 동안 배양하십시오.</li>
	<li>OCM, 즉 OL 분비 인자를 포함하는 상급자를 수확합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 OCM을 필터 살균합니다. 참고: OCM을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.</li>
</ol>10. OCM 추가
참고: 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다. OCM은 다음프로토콜(14)에따라 제조된 정제된 해마 뉴런 배양물을 첨가할 수 있으며, 격리 후 24시간, 항-미소토액제 uridine 및 5-플루오로데옥시우리딘(5 μM)을 36시간 동안 첨가하여 수득하였다.
<ol><li>3 DIV에서, 항 유사분열제를 함유하는 모든 뉴런 배양 배지를 제거하고 신선한 따뜻한 OCM 500 μL을 첨가한다.</li>
	<li>3일마다 중간 크기의 절반을 신선하게 만든 따뜻한 NB-B27로 리뉴얼합니다. 참고: 이러한 문화권은 최대 21DIV까지 유지할 수 있습니다.</li>
</ol>11. 정제된 해마 뉴런 배양에 OL 첨가
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 올Ls는 전술한 바와 같은 방식으로 수득된 정제된 해마 배양물을 첨가할 수 있다.
<ol><li>표 3에따라 공동 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>70% ~ 80% 합류에서 OL 배양을 검색합니다. 따뜻한 1x PBS 2 mL로 헹굽니다.</li>
	<li>세포를 분리하려면 0.25% 트립신 2mL를 100mm 페트리 접시에 넣습니다.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>효소 반응을 차단하기 위해 DMEM-10% FCS 2mL를 추가합니다. OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 수확합니다.</li>
	<li>RT에서 5 분 동안 423 x g의 원심 분리기를 조심스럽게 상류를 제거하고 따뜻한 공동 배양 배지에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하여 1.25 x 105 세포 / mL의 농도를 얻습니다.</li>
	<li>24웰 플레이트의 200 μL의 뉴런 배양 배지를 제거하고 웰당 200 μL의 세포 현탁액(2.5 x 104 세포/웰)을 추가하여 정제된 해마 뉴런 배양에 OL을 첨가하였다.</li>
	<li>2-3일마다 공동 배양 배지의 절반을 새로 고칩니다. 참고: 공동 문화권은 최대 24DIV까지 유지할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li>
<li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li>
<li>Frühbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).</li>
<li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).</li>
<li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222(2015).</li>
<li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+in+the+Central+Nervous+System%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li>
<li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte%2C+Astrocyte%2C+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development%2C+Damage%2C+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).</li>
<li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li>
<li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573(2019).</li>
<li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li>
<li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression%3A+in+vitro+models+of+proliferation%2C+differentiation+and+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li>
<li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li>
<li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li>
</ol>

저자 들 중 어느 누구도 경쟁적인 이해관계나 상충하는 이해관계가 없습니다.

여기서, 우리는 혼합 신경교 배양으로부터 고도로 농축된 올리고덴드로글리알 계보 세포 배양체를 얻기 위한 상세한 프로토콜을 제공하며, 이전에 발표된 방법16으로부터적응하고, OL-컨디셔닝 배지의 후속 생산을 제공한다. 이러한 흔들림 기술은 비용이 많이 들이지 않고, 3회 반복될 수 있으며, PDGFα를 함유하는 보텐슈타인-사토(BS) 배지에서 배양된 세포로서 다량의 정제된 올을 얻는 것이 최적이다. 신경교 세포는 P2에서 위스타 래트의 대뇌 피질 로 제조되며, 이는 올리고덴드로글리알 혈통 세포의 대다수가 NG2 및 O415를발현하는 프리올리고덴드로시트인 시점이다. 참고로, OL 혈통 성숙은 마우스 및 래트에서 P2에서 유사하며, 이 프로토콜은 또한 마우스 프리-올리고벤드로시트(17)를 분리하는데 사용될 수 있다.
혼합 된 신경교 세포 배양을 흔들어 후, ...

올리고엔드로시트(OLs)는 축삭 주위의 미엘린을 생성하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포이다. 올Ls는 배아 CNS의 심실 영역 내에서 증식한 후 완전히 성숙한 올(즉, 미엘린 형성 세포)로 이동하고 분화하는 올리고엔드로시테 전구체 세포(OPCs)에서 유래합니다1. OPCs는 초기 발달 도중 풍부합니다, 그러나 또한 중요한 증식 세포 인구를 대표하는 성인 두뇌에서 지속합니다2. 하나의 OL은 흥분되지 않는 단면(즉, 인터노드)에서 다중 축삭을 ensheathes하고, 각 myelin 루프의 가장자리는 미엘린1,3의절연 특성에 중요한 편집증 도메인을 형성하는 축삭에 부착된다. 파라노드 사이에는 Ranvier의 노드라고 불리는 작은 미수화 된 간격이 있습니다. 이러한 노드는 전압 게이트 나트륨 채널 (Nav)이 풍부하여 염전도4를통해 작용 전위를 재생하고 신속하게 전파 할 수 있습니다. 이 단단한 상호 작용은 또한 OLs5,6에서젖산의 신경 관내 섭취를 통해 축축한 에너지 지원을 가능하게 합니다.
올리고드로글리알 혈통 세포와 수레화 과정의 성숙은 뉴런과의 상호 작용에 의해 엄격하게 조절된다7. 실제로, NG2 세포라고도 불리는 OPC와 OPCs는 신경 전달 물질에 대한 수용체의 배열을 발현하고, 흥분성 및 억제 뉴런으로부터 입력을 수신할 수 있어, 이들의 증식 및/또는 분화 세포를 분화시킬 수 있는 뉴런 활동을 감지할 수 있도록2. 차례로, OPCs/OLs는 마이크로소포스와 단백질을 세포외 공간으로 분비하며 이는 단독으로 또는 상승적으로 신경조절 및 신경보호 기능을8,9,10,11,12. 그러나, oligodendroglial 혈통 세포와 뉴런 사이 상호 작용의 다중 모드를 통제하는 분자 기계장치는 아직 완전히 해독될 수 있습니다.
더욱이, 몇몇 CNS 병리학 적인 조건에서, 올은 주로 영향을 받습니다, 따라서 뉴런과의 상호 작용을 방해하. 예를 들면, 다발성 경화증에서 (MS), 신경 기능 장애는 축삭 손상 및 관련 무력 축적으로 이끌어 낼 수 있는 CNC에 있는 초점 탈수아비, 이차 적인 OLs 손실에 기인합니다. 레미엘리네이션은 대부분의 경우13. 면역 요법의 발달로 인해 지난 10 년 동안의 진전은 재발률을 감소시키지만 재수elination을 촉진하는 것은 충족되지 않은 필요성으로 남아 있습니다. 이와 같이, OLs 역할, 기능 및 영향의 더 나은 이해는 CNS 조건의 넓은 스펙트럼을 위한 새로운 치료의 발달에 특히 관심있습니다.
여기서, 우리는 올스 정제 및 배양의 방법을 설명합니다. 이를 통해 개발 및 생물학을 규제하는 본질적인 메커니즘을 정밀하게 검사할 수 있습니다. 또한, 이러한 고농축 된 올스 배양은 뉴런 생리학 및 연결에 대한 OLs 분비 요인의 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 정제 된 뉴런 문화에 추가 할 수있는 oligodendrocyte 컨디셔닝 배지 (OCM)의 생산을 허용합니다. 또한, 우리는 정제 된 올리고 엔드 로시테와 뉴런이 함께 결합되어 조절 되는 메커니즘을 해결할 수있는 체외 공동 배양 시스템을 구현하는 방법을 설명합니다 (재)myelination.

<table><tbody><tr><td>5-플루오로데옥시우리딘</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스 용액</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100% </td><td>시그마</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>VWR 화학 물질</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>파파인</td><td>워딩턴</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher</td><td>칼슘</td> 및 마그네슘 미함유 15140122 <td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>테트라보레이트 데카하이드레이트</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Sigma</td><td>Sigma 유리</td><td></td></tr><tr><td>딘</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (소 혈청 알부민)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher 31966021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신 디하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨염)</td><td>시그마</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-티록신)</td><td>시그마</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td>Co-culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (소 혈청 알부민)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>세룰로플라스민</td><td>시그마</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 변형 이글 배지</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td></td><td>Sigma I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>써모피셔</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 CNTF</td><td>시그마</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염)</td><td>시그마</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>비타민 B12</td><td>시그마</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 필터</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 디쉬</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 페트리 디쉬</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & 마이크로; m 필터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술 용 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>소형 수술용 스푼</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 플라스크 필터 캡 포함</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar 쥐</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

중추 신경계에서 올리고엔드로시트는 축삭 수초화에서 자신의 역할로 잘 알려져 있으며, 이는 염전을 통해 행동 잠재력의 전파를 가속화합니다. 더욱이, 보고의 증가 수는 oligodendrocytes가 특히 가용성 요인의 분비를 통해, myelination를 넘어 뉴런과 상호 작용한다는 것을 건의합니다. 여기에서, 우리는 또한 성상 세포 및 microglial 세포를 포함하는 신경교 세포 배양에서 oligodendroglial 계보 세포의 정제를 허용하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 37 °C에서 하룻밤 흔들림에 의존, 이는 오버 리올리고겐드로글리알 세포와 미세 교만 세포의 선택적 분리를 허용, 차등 접착에 의해 미세 글리아의 제거. 그런 다음 올리고엔드로시트의 문화와 올리고엔드로시테(oligodendrocyte) 조절 배지(OCM)의 생산을 설명합니다. 우리는 또한 공동 문화 실험에서 정제 된 해마 뉴런에 추가 된 OCM 치료 또는 올리고 덴 드 로시테의 역학을 제공, 올리고 덴 드 로시테 - 뉴런 상호 작용을 연구.

이 프로토콜에서, OL 혈통 세포는 성상 세포 및 마이크로 글리아를 흔들어 신경교 배양물로부터 정제된다. OL 배양물의 순도 및 자형질 검사는 신경교 마커15로면역 염색함으로써 평가될 수 있다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, OL 배양액은O4+세포의 90% ±4%, 85% ±7%NG2+ 세포, 4.7% ±2.1%PLP+ 세포의 경우, 7.2% ±2.5%의 세포가GFAP+ 성상세포(평균 ±S.D., n;3;3)를 가진 것으로 나타났다. 그림 2). 또한, 4.6% ±0.7% 세포의 CD11b+ 미세교세포(평균±S.D., 도시되지 않음)를 하였다.
이러한 배양물로부터 생...

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

우리는 올리고렌드로글리알 계보 세포 정화 및 문화의 효율적인 방법을 설명합니다. 이것은 골수화 과정 도중 oligodendrocytes 분화 및 신경과의 상호 작용을 통제하는 분자 기계장치를 해결할 수 있습니다. 이 흔들리는 기술은 비싸지 않으며 올리고드엔드로키테의 높은 양을 얻는 것이 최적입니다.이러한 문화는 신경과 oligodendrocytes의 oligodendrocyte 조건 된 매체및 공동 배양을 생산 할 수 있습니다. 다발성 경화증은 중추 신경계의 초점 제거 근생에 의한 질병이며, 올리고드엔드로시스 손실에 이차적으로 발생합니다. Oligodendrocytes 문화는 재신비화를 촉진하는 방법을 더 잘 이해할 수 있는 도구를 제공합니다.오직 oligodendroglial 세포 배양만 oligodendrocytes의 발달 그리고 생물학을 통제하는 본질적인 기계장치에 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 뉴런과의 공동 배양은 뉴런 생리학에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시작하려면 곡선된 집게를 사용하여 동물의 머리를 눈 높이에서 유지합니다.작은 수술 가위를 사용하여 두개골 의 바닥에 작은 절개를하고 뇌 중간선 다음 두개골을 잘라. 집게를 사용하여 중간선에서 두개골의 두 부분을 부드럽게 벗겨냅니다. 작은 수술 숟가락을 사용하여 머리 구멍에서 뇌를 제거하십시오.얼음에 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 60 밀리미터 페트리 접시에 뇌를 넣어. 스테레오 현미경으로 보고, 뇌반구에서 소뇌, 뇌 줄기 및 후각 전구를 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 두 대뇌 반구를 분리하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다.미세 한 집게를 사용 하 여 수막을 벗겨. 대뇌 코르티치를 60mm 페트리 접시에 얼음 위에 놓습니다. 라미나르 플로우 후드에서 날카로운 메스를 사용하여 대뇌 코르티치를 잘게 자릅니다.다진 조직을 효소 소화 배지를 함유한 50밀리리터 튜브로 옮기습니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 피질 조직이 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인하면서 부드럽게 효소 소화 매체를 제거하기 위해 파이펫을 사용합니다.P1000 마이크로파이프를 사용하여 DMEM 10% 태아 종아리 세럼 1밀리리터를 추가하고 조직을 부드럽게 세리로 세리세울 수 있습니다. 70미크론 필터와 1밀리리터 주사기의 피스톤을 사용하여 피질 조직을 50밀리리터 튜브로 필터링합니다. DMEM 10% 태아 종아리 혈청으로 50 밀리리터 튜브의 내부 튜브 벽에 잔류 조직을 여러 번 헹구십시오.DMEM 10% 태아 종아리 세럼으로 50 밀리리터 튜브를 채웁니다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 423배 g로 합니다. 조심스럽게 상체를 제거하고 DMEM 10 % 태아 송아지 혈청의 두 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.P1000 마이크로파이프로 셀 펠릿을 부드럽게 세살한 다음 P200 마이크로파이프를 사용합니다. DMEM 10%의 태아 종아리 혈청의 적절한 부피로 세포 현탁액을 희석시 희석시. T-150 플라스크에 셀 서스펜션의 5 밀리리터를 1회 10분의 1의 밀도에서 제곱센티미터당 제5세포로 플레이트한다.각 T-150 플라스크에 따뜻한 DMEM 10% 태아 송아지 세럼 20밀리리터를 추가합니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배양하십시오. 250 rpm 및 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 샘플을 흔들어 본 후, 주로 올리고원드로시테 계보 세포를 포함하는 플라스크의 상체를 수확하고 일부 미세 글리아 세포뿐만 아니라 코팅되지 않은 100 mm 페트리 접시에 접시를 놓습니다.페트리 요리를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습된 인큐베이터에서 15분간 배양합니다. 이를 통해 접시 표면의 차동 적 빠른 접착을 통해 마이크로 글리아젤 세포를 제거 할 수 있습니다. 한편, 각 T-150 플라스크는 따뜻하고 갓 준비된 배양 배지 25밀리리터를 채우고 2차 흔들림까지 이산화탄소 5% 미만의 37도에서 가습된 인큐베이터에 인큐베이션을 증식합니다.다음으로, 페트리 접시에서 상체를 새로운 코팅되지 않은 100mm 페트리 요리로 옮겨 잔류 미생물 세포의 접착을 허용합니다. 페트리 요리를 5%의 이산화탄소 아래 37°C의 가습된 인큐베이터에서 15분간 배양합니다. 부착되지 않은 올리고덴드로시테 계보 세포를 포함하는 두 개의 페트리 접시마다 상체를 제거하고 50 밀리리터 튜브로 옮킨다.마이크로글리아로 도금된 페트리 접시를 버리십시오. 423배 g에서 5분간 튜브를 원심분리합니다. 조심스럽게 상체를 제거하고 보텐슈타인 - 사토 매체의 1 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.일반적인 50 밀리리터 튜브에 모든 펠릿을 풀고 보텐슈타인-사토 배지를 사용하여 세포 밀도에 따라 20 또는 30 밀리리터로 볼륨을 조절합니다. 셀 서스펜션의 10 밀리리터와 함께 2~3개의 프리코팅 된 100mm 페트리 접시를 접시. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배양하십시오.2시간 후, 보텐슈타인-사토 매체를 모두 새로 고치어 페트리 요리의 잔해를 치웁울 수 있습니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배지에서 이틀 동안 배양하십시오. 이틀 후, 현미경으로 문화를 검사하십시오.라미나르 플로우 후드에서 멸균 조건하에서 따뜻한 MPB-27 저배지 10밀리리터로 배양 배지를 갱신합니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습 된 인큐베이터에서 이틀 동안 배양하십시오. OCM을 수확하려면 올리고드렌드로키테분비드 인자를 포함하는 상체를 수집합니다.필터는 0.22 미크론 필터를 사용하여 OCM을 살균합니다. 이 프로토콜에서, oligodendrocyte 혈통 세포는 성상 세포와 microglia를 흔들어 서 신경교 배양에서 정제되었다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, 올리고드렌드로시테 배양은 O4 양성 세포의 90 플러스 또는 마이너스 4%, 85플러스 또는 마이너스 7%NG2 양성세포, 4.7플러스 또는 마이너스 2.1%의 PLP 양성세포를 함유한 전 올리고드엔드로시테였으며, 반면, 7.2플러스 또는 마이너스 2.5%의 세포가 GFAPP양성세포였다.이러한 배양으로부터 생산된 OCM은 체외에서 3일 간 첨가되어 정제된 해마 뉴런 배양에 추가되었다. 이 치료는 노장 단백질의 클러스터링을 촉진합니다. 해마 뉴런의 골수화는 체외에서 14 일 동안 올리고드 렌드로치의 첨가를 통해 연구되었다.20일에서 24일 간 체외에서 미엘린 기본 단백질과 같은 미엘린 마커의 면역 염색은 Ranvier의 미엘린 세그먼트 및 노드의 시각화를 허용했습니다. 코어 PBS는 수막 제거에 중요합니다. 활발한 클리어링은 올리고드렌드로치의 생존능력과 피펫에 적용된 흐름의 강점을 실현하는 데 매우 중요합니다.Oligodendrocyte 조건 된 배지 는 신경 생리학에 oligodendroctyes 분 비 요인의 영향에 대 한 통찰력을 얻기 위해 신경 문화에 추가할 수 있습니다. 신경과 oligodendroctyes의 공동 배양은 또한 근생 과정을 공부하기 위하여 수행될 수 있습니다.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 성체 쥐의 뇌에서 외측 심실 벽을 분리하고 효소 조직 해리를 수행하여 단일 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 세포는 신경 줄기 세포의 증식을 선택적으로 강화하고 희소돌기아교세포와 성상세포의 공동 배양으로의 분화를 촉진하는 특정 배양 조건에 적용됩니다.

성체 마우스 신경 줄기세포에서 혼합 희소돌기아교세포와 성상교세포 배양 획득

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

이 비디오는 희소돌기아교세포 계통 세포에서 희소돌기아교세포 조절 배지(OCM)의 생산을 보여주며, 희소돌기아교세포의 분자 방출을 촉진하도록 압력을 가합니다. 성장 인자, 사이토카인 및 기타 생체 활성 분자가 풍부한 이 배지를 뉴런 배양에 추가하여 희소돌기아교세포가 분비하는 인자 가 뉴런 생리학 및 연결성에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

희소돌기아교세포-조건화된 배지를 생성하는 방법

이 비디오는 쥐 새끼 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex(쥐 강아지 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포)

구형세포는 현재 효과적인 장기 치료법이 없는 백혈구이영양증인 크라베병의 특징적인 병리학적 특징입니다. 우리는 활성화된 미세아교세포의 선천적 생물학 및 병원성 잠재력과 구형세포로의 변형을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 개발했습니다.

체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

학습하세요 올리고엔드로시테 정제 및 컨디셔닝 배지 생성 방법을 통해 신경과학 연구에서 세포 분화와 미엘린화 메커니즘을 탐구하세요. 이 기술은 효율적인 공동 문화 실험을 가능하게 합니다.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

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